Universität Stuttgart
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Item Open Access Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access Isolierung des humanen Lactasegens und seine Expression in der Hefe Pichia pastoris(2002) Bethge, Rut; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) katalysiert bei der Verdauung die hydrolytische Spaltung des Milchzuckers Lactose in Glucose und Galactose. Dieses Enzym ist im Bürstensaum des Dünndarms der Säugetiere lokalisiert. Seine Aktivität wird nach dem Ende der Laktationsphase sehr stark gesenkt, bzw. die Synthese in Teilabschnitten des Darms eingestellt, was eine Lactoseintoleranz bei 75 % der Weltbevölkerung zur Folge hat. Eine Ausnahme stellen hierbei Nordeuropäer und einige afrikanische Völker mit traditionellem Konsum von Milch und Milchprodukten dar. Mit dem Lactosemetabolismus sind unter anderem die Stoffwechselkrankheiten Milchunverträglichkeit, die durch einen Defekt in der Lactase-Synthese zustandekommt, und Galactosämie, die auf dem genetischen Defekt der Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase (GALT) beruht, verbunden. Während die Symptome, Durchfall und Erbrechen, der Milchunverträglichkeit weniger schwerwiegend sind, führt der Verlauf von Galactosämie unbehandelt zu geistiger Zurückgebliebenheit und in vielen Fällen zum Tod. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Entwicklung denkbarer Behandlungsstrategien der Galaktosämie durchgeführt. Der Grundgedanke ist, die negativen Folgewirkungen der Galactosämie durch Hemmung des ersten Enzyms des Lactosemetabolismus, der LPH, unter Akzeptanz der Folgen einer Milchunverträglichkeit, zu unterbinden. Hierbei kamen unterschiedliche Glycosidaseinhibitoren zum Einsatz. Erstens wurde die humane Lactase-Phlorizin-Hydrolase in Pichia pastoris exprimiert und die Quantifizierbarkeit ihrer Lactaseaktivität in dem Test auf Disaccharidase-Aktivität nach Dahlqvist untersucht. Zweitens wurde die Anwendbarkeit des Testsystems zur Charakterisierung einer LPH-Hemmung im Allgemeinen, bzw. zur Suche nach neuen spezifischen LPH-Inhibitoren untersucht. Die LPH wurde aus menschlichen Dünndarmgewebeproben isoliert. Dazu wurde ihre Gesamt-RNA isoliert, die mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt wurde. Daraus konnten durch PCR sowohl die Lactase-, als auch die Phlorizin-Hydrolase-Domäne der LPH amplifiziert werden. Durch den Vergleich ihrer DNA-Sequenzen mit der 1988 von Mantei et al. veröffentlichten Sequenz der LPH ergaben sich in beiden Domänen jeweils 6 Basenabweichungen, von denen angenommen wurde, dass es sich dabei um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) handelt. Die Gesamt-LPH wurde durch Zusammenfügen der beiden Einzeldomänen mittels "Overlap-Extension" erhalten. Bei der Sequenzierung der Gesamt-LPH ergaben sich vor allem im hinteren Bereich, am 3'-Ende, Basenabweichungen, die in den ursprünglichen Einzeldomänen nicht vorhanden waren. Es muß demnach davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen Variationen nicht um SNPs sondern um Mutationen handelt. Sowohl die einzelnen Domänen, als auch die Gesamt-LPH wurden in dem eukaryotischen System der Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe des Testes auf Disaccharidaseaktivität nach Dahlqvist auf ihre Lactose-Hydrolyse-Aktivität untersucht. Das Verfahren wurde dabei auf eine Anwendung im Mikromaßstab modifiziert. Während die exprimierte Phlorizin-Hydrolase-Domäne alleine nur geringe Lactaseaktivität zeigte, konnte nach Expression der Lactase-Domäne, sowie der Gesamt-LPH deren hydrolytische Aktivität nachgewiesen werden. Die Lactaseaktivität konnte somit der Lactase-Domäne zugeordnet werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz aktiv. Die Expression in Pichia pastoris ermöglicht es demnach, die Aktivität von Varianten der LPH auf einfache Art und Weise zu testen. Zur Durchführung weiterer Experimente sollte ein mutationsfreies Gen hergestellt werden, um einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, und festzustellen, wie viele Polymorphismen das Gen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modifizierte Dahlqvist-Test eingesetzt, um Verbindungen auf ihre hemmende Wirkung auf die Lactase-Phlorizin-Hydrolase, bzw. ihre Einzeldomänen, zu prüfen. Mit Phlorizin, einem Lactasehemmer, konnte die Zuverlässigkeit des Tests bestätigt werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der Literatur für Inhibitionsversuche geeignet. Das Testsystem erlaubt somit die gezielte Durchmusterung synthetisch hergestellter Verbindungen auf deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Lactaseaktivität und die Untersuchung der Wirkungsweise von Inhibitoren auf verschiedene Varianten der LPH. Auch für einen von dem Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart synthetisch hergestellten ß-Glucosidase- und ß-Galactosidase-Inhibitor konnte eine Hemmung der Lactaseaktivität festgestellt werden. Eine weitere, gezielte Durchmusterung von Verbindungen mit Hilfe des etablierten Systems könnte somit zur Charakterisierung neuer Inhibitoren führen und alternative Ansätze zur therapeutischen Behandlung von Galaktosämie eröffnen.Item Open Access A model of the pressure dependence of the enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards (±)-menthol(2002) Kahlow, Ulrich; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)Transesterification of (±)-menthol using propionic acid anhydride and Candida rugosa lipase was performed in chloroform and water at different pressures 1,10,50,and 100 bar) to study the pressure dependence of enantioselectivity E. As a result,E significantly decreased with increasing pressure from E = 55 (1 bar) to E = 47 (10 bar), E = 37 (50 bar), and E = 9 (100 bar). To rationalize the experimental findings, molecular dynamics simulations of Candida rugosa lipase were carried out. Analyzing the lipase geometry at 1,10, 50,and 100 bar revealed a cavity in the Candida rugosa lipase. The cavity leads from a position on the surface distinct from the substrate binding site to the core towards the active site,and is limited by F415 and the catalytic H449. In the crystal structure of the Candida rugosa lipase,this cavity is filled with six water molecules. The number of water molecules in this cavity gradually increased with increasing pressure:six molecules in the simulation at 1 bar,10 molecules at 10 bar,12 molecules at 50 bar,and 13 molecules at 100 bar. Likewise,the volume of the cavity progressively increased from about 1864 Å 3 in the simulation at 1 bar to 2529 Å 3 at 10 bar,2526 Å 3 at 50 bar,and 2617 Å 3 at 100 bar. At 100 bar,one water molecule slipped between F415 and H449, displacing the catalytic histidine side chain and thus opening the cavity to form a continuous water channel. The rotation of the side chain leads to a decreased distance between the H449-N and the (+)-menthyl-oxygen (nonpreferred enantiomer) in the acyl enzyme intermediate,a factor determining the enantioselectivity of the lipase. Although the geometry of the preferred enantiomer is similar in all simulations,the geometry of the nonpreferred enantiomer gets gradually more reactive. This observation correlates with the gradually decreasing enantioselectivity E.Item Open Access Expression von DNA aus Bodenproben in Streptomyces für den Nachweis neuer Enzymaktivitäten(2002) Bonacker, Eckart; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit wurden Genbanken aus Boden DNA in Streptomyces erstellt und auf Enzymaktivität gescreent. In diesem Zusammenhang wurden anfänglich mehrere Reportergene in Streptomyces exprimiert und verschiedene Methoden zur Transformation von Streptomyces im Hinblick auf ihre Anwendbarkeit und Effizienz getestet und optimiert. Als geeignetste Transformationsmethode erwies sich die Protoplastentransformation. Mit dieser Methode konnten Transformationseffizienzen von 10 exp 6 cfu/ µg DNA in Streptomyces lividans erzielt werden und damit ausreichende Werte für die Herstellung von Genbanken erhalten werden. Nach Aufreinigung genomischer DNA aus Böden wurde eine mehr als 18500 Klone umfassende Genbank in Streptomyces lividans erstellt und auf Lipase- bzw. Esteraseaktivität getestet. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Gene für die Catechol-2,3-dioxygenase und die BTL2- Lipase, die in verschiedenen Schritten der Aufreinigungsprodzedur von Boden-DNA eingebracht wurden, in einem anschließenden Screening aufgefunden werden können. Durch das Wiederfinden dieser Gene wurde die Durchführbarkeit dieser Methoden demonstriert. So konnte die Catechol-2,3-dioxygenase in einem von 2200 gescreenten Kolonien und die BTL2- Lipase in zwei von 3000 gescreenten Kolonien nachgewiesen werden. Weiterhin wurde auf den Einsatz von Streptomyceten in verschiedenen Assaysystemen hingearbeitet, die eine Verwendung von Mikrotiterplatten zum Hochdurchsatz Screening erfordern. Es konnte gezeigt werden, daß Mikrotiterplatten im 96er und 384er Format, sowohl bei Verwendung des halbsynthetischen R5 Mediums für die Kultivierung von Streptomyces, als auch für die qualitative und quantitative Durchführung von Farbassays im Kulturüberstand geeignet sind.Item Open Access Die humane Acetylcholinesterase: Design und Synthese eines optimierten Gens und die Expression in Pichia pastoris(2002) Vorlová, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Ziel der Arbeit war die Etablierung eines Expressionssystems für die Herstellung funktioneller humaner Acetylcholinesterase. Aufgrund der bekannten negativen Erfahrungen mit anderen Expressionssystemen wurde als host Organismus P. pastoris gewählt. Um die Expression auf der Translationsebene weiter zu begünstigen wurde die Codon-usage des zu synthetisierenden Gens an die des Expressionsorganismus angepasst. Das synthetische Gen wurde für die Expression in P. pastoris in die Vektoren pPICZαA und pGAPZαA kloniert, die sich durch ihre Promotoren, den Methanol-induzierbaren AOX1-Promotor und den konstitutiven GAP-Promotor, unterscheiden. Zur schnellen Identifizierung von Transformanden, die das Gen in aktiver Form exprimieren wurde ein Agarplattenassay entwickelt. Zur weiteren Optimierung der Ausbeuten wurden der Einfluss verschiedener Medien, Fütterungsstrategien und Kultivierungsfaktoren wie des pHs des umgebenden Mediums untersucht. Unter den so erreichten optimierten Bedingungen konnte in Schüttelkolbenkulturen eine Expression von bis zu 10000 U/l erzielt werden. Ein Großteil dieser Ergebnisse konnten für die Optimierung einer Fermentation übernommen werden, in der schließlich entsprechende Expressionsraten erzielt wurden. In einen weiteren Schritt wurde der Einfluss der veränderten Nucleotidsequenz auf die Expression in P. pastoris und in COS-Zellen untersucht. Während in den Säugerzellen eine deutliche Abhängigkeit der Expression von der verwendeten Nucleotidsequenz festgestellt wurde, konnten in P. pastoris mit drei unterschiedlichen Genkonstrukten, die alle für die humane Acetylcholinesterase kodierten, keine unterschiedlichen Mengen an exprimiertem Protein festgestellt werden. Mit der Synthese einer optimierten Gensequenz, der Wahl von P. pastoris als Wirtsorganismus und der Etablierung eines Affinitätsaufreinigungs-Protokolls konnte ein effizientes Expressionssystem zur Produktion hochreiner humaner Acetylcholinesterase etabliert werden.Item Open Access In vitro and in silico models for in vivo events(2002) Ölschläger, Peter; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)In Part A the atrazine-specific scFv (single-chain variable antibody fragment) K411B, that can be applied in herbicide analysis, was expressed either in the cytoplasm or the periplasm of Escherichia coli BL21(DE3). For periplasmic production, the scFv was N-terminally fused to the pelB leader, whereas the unfused variant resulted in cytoplasmic expression. The expression level differed significantly: the extent of protein accumulation of the scFv with leader was 2.3 times higher than that of the protein without leader. To further investigate this, the respective translation profiles were generated by coupled in vitro transcription/translation assays and gave according results. Periplasmic expression resulted in only 10% correctly folded scFv. The same percentage was obtained when the scFv was expressed in vitro, indicating that the oxidizing environment of the periplasm did not increase proper folding. Thus, the data obtained in vitro confirmed the findings observed in vivo and suggested that the discrepancy in expression levels was due to different translation efficiencies. Enhanced green fluorescent protein (EGFP) was fused C-terminally to the scFv to allow online monitoring during the production process. The resulting fusion protein could be used in a novel fluorescence immunoassay referred to as fluorophor-linked immunosorbent assay (FLISA) in order to measure functionality of the fusion protein. The scFv domain, which binds to the immobilized hapten, can be detected by measuring the fluorescence of the EGFP domain. The time-consuming binding of secondary antibodies and enzyme reaction, necessary for ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays), is not required. Consequently, the assay time of 1.5 hours needed to complete the FLISA is much shorter than that of comparable ELISAs, which require about 5 hours. The amount of the soluble fraction of cell extracts from Escherichia coli expressing the fusion protein and the normalized fluorescence signal showed a linear correlation with R2 > 0.99. The FLISA was used to determine the amount of functional scFv-EGFP fusion protein expressed in E. coli. The fusion protein could not be expressed in the periplasm but in the cytoplasm and showed a similar expression profile as the scFv. In vitro, the expression with and without the pelB leader rendered the same production profile as for the scFv. This indicated that neither the translation efficiency nor the solubility but other factors impeded periplasmic expression of the fusion protein. In a high-cell-densitiy cultivation, 25 gramms (2 gramms per liter) of scFv were produced. As the major fraction of recombinant protein was insoluble, a refolding method was developed yielding active scFv in nearly quantitative yields. Alternatively, active scFv could be purified from the culture supernatant to homogeneity by immobilized metal affinity chromatography. When applied to s-triazine analysis, the FLISA performed with scFv-EGFP fusion protein showed better results than the respective ELISA using scFv. In Part B an assay based on molecular dynamics simulations for the prediction of substrate specificities of the IMP-1 metallo-b-lactamase and variants towards cephalosporin antibiotics was developed. To establish a reliable modeling method for the active site, containing two zinc atoms, a purely nonbonded approach and a cationic dummy atom approach were tested. The latter was shown to give a better representation of the protein. The enzyme in complex with a mercaptocarboxylate inhibitor as it had been crystallyzed could be simulated well with this procedure at 300 K. The active site, i.e. the coordination of the two zinc atoms remained stable. Subsequently, the model was successfully extended to the free enzyme and to the enzyme in complex with a b-lactam bound as an intermediate. In this structure the b-lactam is already hydrolyzed and coordinated to one zinc via the carboxylate, to the other zinc via the anionic nitrogen resulting from the amide bond cleavage. Cephalothin, a substrate that is known to be converted well, remained stable in the intermediate structure at 300 K for 1.2 ns. The zinc-zinc distances in the free enzyme and the enzyme in complex with the b-lactam intermediate differed significantly and suggest that upon catalytic conversion of the antibiotic a movement of the zinc atoms occurs. To investigate IMP-6, a mutant differing in one amino acid from IMP-1, and other b-lactam substrates, the molecules were docked into IMP-1 and IMP-6, respectively, according to cephalothin. For these enzyme/substrate combinations literature data (kcat/KM values) were available and these showed significant differences. As not all combinations remained stable in the intermediate structure at 300 K, molecular dynamics simulations were performed at 100 K. After several simulations had been carried out for each combination, three parameters proved to be correlated to the experimental data: 1. For combinations with very inefficient hydrolysis, the anionic nitrogen lost contact to the respective zinc, 2. a deformation of the angle between the anionic nitrogen, the dummy atom (a component of the cationic dummy atom approach) and the zinc atom was observed for combinations with poor conversion and 3. an increase of the zinc-zinc distance occurred in inefficient enzyme/substrate combinations. The mentioned angle and distance were related in each combination and when they were plotted versus each other in a 2D chart, a grouping of inefficient, middle-rate and efficient metallo-b-lactamase/b-lactam combinations was observed.Item Open Access Cloning, expression, purification and characterization of a novel cytochrome P450 isolated from Thermus thermophilus HB27(2002) Blasco, Francesca; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Enzymes produced by extremophiles are of considerable biotechnological interest. They show activity and stability at extreme temperatures, low water activity and high hydrostatic pressure. The growing knowledge about "thermozymes" from thermophilic organisms obtained during the recent years and the importance of P450 monooxygenases as potential biocatalysts for industrial applications has created high interest in P450 enzymes from thermophilic bacteria and archaea. Although the homology between P450s is generally low, a few domains and sequence signatures are conserved and can be identified by homology searches. Following this approach a homology search of recently sequenced genomes from thermophiles was performed to identify novel P450 enzymes of this origin. Indeed, a region showing homology to a known bacterial P450 (P450 BM3 from Bacillus megaterium) was found within the Thermus thermophilus HB27 genome, currently being sequenced in Göttingen. Thermus thermophilus is a non-sporulating Gram-negative bacterium isolated from hot springs. Its genome of 1.82 Mbp (excluding the mega-plasmid pTT27 of 0.24 Mbp) has a GC-content of approximately 69 %. The optimal temperature for growth is between 65 and 72 °C, the maximum being 85 °C and the minimum being 47 °C. Bulk protein extracted from this thermophile is much more stable to heat than mesophilic protein extracts; and only about 10 % of the total protein is denatured by heating up to 110 °C for 5 min. Cytochrome P450 proteins, named for the absorption band at 450 nm of their carbon monoxide bound form, are a large superfamily of enzymes. P450s are ubiquitous enzymes essential for steroid biosynthesis, catabolism of drugs, utilization of carbon compounds as an energy source in bacteria, and in the production of various macrolide antibiotics. Sequence identity among P450s is often low (normally less than 20 %), but the structural fold has been conserved during evolution. P450s are heme thiolate proteins; the most conserved structural feature is a cysteine as fifth ligand to the heme iron. Normally P450s use electrons from NAD(P)H to catalyze activation of molecular oxygen, leading to regiospecific and stereospecific oxidative attack (often hydroxylation) of non-activated hydrocarbons at physiological temperatures. The substrates of P450s are extremely diverse. They are involved in the biosynthesis of hormones or antibiotics, as well as carcinogenesis and degradation of xenobiotics. The selective oxidation of an unactivated C-H bond in a complex organic molecule to the alcohol functionality (C-OH) has wide applications in chemical synthesis. The present work reports cloning, expression, purification, crystallization and characterization of CYP175A1, a cytochrome P450 from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB27. For over expression the gene was amplified by PCR in the presence of specific primers from a DNA fragment kindly provided by Prof. H. J. Fritz (University of Göttingen). The PCR product was ligated into the polylinker region of pKK223-3 for expression under control of the tac promoter. The resulting clone was transformed in E. coli BL21(DE3)RP CodonPlus and selected for ampicillin and chloroamphenicol resistance. Expression was induced by IPTG and a yield of approx. 40 mg protein/liter culture was obtained. After cell disruption and ammonium sulfate precipitation P450_Tth was purified to homogeneity, following two different purification protocols. The fractions corresponding to the highest purity were used for crystallization, while the others were used for further biochemical characterization. The 44 kDa protein is soluble and displays an absorption spectrum in the reduced, oxidized, and carbonyl adduct analogous to those of other P450 enzymes. This enzyme exhibits thermostability with a melting temperature 30 °C higher than that of P450cam from P. putida. The crystal structure of CYP175A1 has been determined in co-operation with T. Poulos (University of California, Irvine). CYP175A1 exhibits the typical prism like P450-fold composed of 17 a-helices and 11 b-strands, corresponding to four beta sheets. The location of CYP175A1 in the T. thermophilus genome (close to crtB encoding a phytoene synthase), and the fact that genes for carotenoid biosynthesis occur as a cluster in T. thermophilus as well as in other carotenoid-producing strains, suggested that the gene may be involved in carotenoid biosynthesis. Heterologous complementation using Escherichia coli strains genetically enginereed to produce b-carotene indicated that CYP175A1 was able to catalyze the conversion of b-carotene to zeaxanthin via cryptoxanthin. The model of the b-carotene-CYP175A1 complex was generated. The hydrophobic nature of the ligand fitted well into the binding site of CYP175A1 which contained mostly hydrophobic or neutral residues. The position of the ligand in the active site of the enzyme showed that the C-3 of the b-ionone ring is the closest atom to the heme iron confirming the experimentally observed regioselectivity.Item Open Access Etablierung von neuen Methoden zur Herstellung rekombinanter Antikörper und zur spezifischen Selektion von Antikörpervarianten im hohen Durchsatz(2002) Lange, Stefan; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst rekombinante herbizidspezifische Antikörperfragmente (single chain Fragmente und Fab Fragmente) in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris produziert. Dies gelang jeweils durch genomische Integration der codierenden Gene. Im Fall des atrazinspezifischen Fabs K411B wurden hierfür mehrere Vektoren hergestellt, die jeweils die Gene beider Ketten als Fusion mit der a-Faktor-Signalsequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors enthielten. Somit konnten nach Transformation eines einzigen Vektors in Pichia beide Antikörperketten exprimiert und ins Medium sekretiert werden. Es zeigte sich, daß Klone mit beiden Genen unter Kontrolle des methanolinduzierbaren AOX1 Promotors größere Mengen Fab exprimierten, als solche mit den Antikörpergenen unter Kontrolle des konstitutiven GAPDH-Promotors. Durch fed-batch Kultivierung im 5l Bioreaktor konnten schließlich 40 mg l-1 Fab exprimiert werden. Wie sich durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte, bildeten ca. 30 % der schweren und leichten Ketten komplette Fab Fragmente. Auch im Falle des scFv K411B konnte mit Klonen, die das scFv-Gen als Fusion mit dem a-Faktor unter Kontrolle des AOX1-Promotors genomisch integriert trugen deutlich mehr exprimiert werden. Die Bindungseigenschaften des scFv und des Fab K411B wurden mit einem direkten, kompetitiven ELISA bestimmt: Wie erwartet zeigten beide Antikörperfragmente Testmittelpunkte von ca. 3 µg l-1. Dieser lag damit jedoch um ca. eine Größenordnung höher, als der mit dem parentalen monoklonalen Antikörper K4E7 gemessene Wert von ca. 0,2 µg l-1. Die Kreuzreaktivitäten der verschiedenen rekombinanten Antikörper stimmten jedoch nahezu mit denen des mAk überein. Die Entfernung mehrerer Restriktionsschnittstellen in dem für die Expression des Fab K411B hergestellten Expressionsvektor ermöglichte dessen Verwendung zur Herstellung von Fab Fragmenten beliebiger Spezifität durch einfachen Austausch der nun durch singuläre Schnittstellen begrenzten variablen Domänen. Dies wurde durch Expression eines 2,4-D-spezifischen Fabs validiert. Obwohl die exprimierte Menge deutlich geringer, als die des Fab K411B war, konnte mittels ELISA eine sigmoidale Bindungskurve zur Bestimmung von 2,4-D erstellt werden, aus der sich ein Testmittelpunkt von ca. 10 µg l-1 ergab. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neben dem ELISA weitere Methoden zur Messung der Bindungseigenschaften von Antikörpern etabliert und bezüglich ihrer Eignung zum Screening von Antikörperbibliotheken in hohem Durchsatz getestet: Zunächst wurde ein auf Fluoreszenzpolarisation beruhender homogener, kompetitiver Assay entwickelt. Mit einem Testmittelpunkt von ca. 90 µg l-1 bei der Bestimmung von Atrazin wäre für Anwendungen in der Umweltanalytik jedoch eine Optimierung hinsichtlich einer verbesserten Sensitivität notwendig. Aufgrund seiner im Vergleich zum ELISA sehr schnellen Durchführbarkeit, wäre der Einsatz als Schnelltest im mittleren Durchsatz geeignet und weniger für ein Screening im hohen Durchsatz, da die Ergebnisse im Vergleich zum ELISA weniger genau und reproduzierbar waren. Zum Screening von Antikörperbibliotheken und zur Selektion von Varianten mit bestimmten Bindungseigenschaften im hohen Durchsatz, wie es für evolutive Methoden erforderlich ist, wurde ein Hefeoberflächenexpressionssystem etabliert. Diese mit dem Phagen-Display verwandte Methode ist im Gegensatz zum ELISA und zum Fluoreszenzpolarisationstest vom Mikrotiterplattenformat unabhängig, da die Bestimmung der Bindungseigenschaften sowie die Selektion von Varianten mit dem Durchflußcytometer erfolgt: Durch Fusion der Gene der scFv's mit dem Gen einer Domäne des Agglutininrezeptors gelang nach Transformation des Fusionsgenes die Expression und Präsentation des daraus resultierenden funktionellen Fusionsproteins auf der Hefeoberfläche. Die damit erreichte Kopplung von Geno- und Phänotyp erlaubt durch Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antigenen und/oder Epitop-spezifischen Antikörpern und nachfolgender Analyse und Sortierung am Durchflußcytometer das Screening und die Selektion von Hefezellen, die Antikörper mit speziellen Bindungseigenschaften exprimieren. Die erfolgreiche funktionelle Expression der verschiedenen scFv's auf der Hefeoberfläche wurde durch Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Laserscanning-Mikroskopie sowie FACS-Messungen überprüft und bestätigt. Eine Vereinfachung der Screeningmethode wurde durch Expression des scFv-EGFP auf der Oberfläche der Zellen erreicht: Damit kann auf die für die Bestimmung der Oberflächenexpressionsmenge notwendige Markierung der scFv's mit Epitop-spezifischen fluorezenzmarkierten Antikörpern verzichtet werden, da die Fluoreszenz des EGFP-Anteils direkt mit der Menge des exprimierten Fusionsproteins korreliert.Item Open Access Erhöhung der mikrobiellen und molekularen Diversität von Carotinoiden(2002) Kauffmann, Isabelle Melanie; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Carotinoide sind meist gelbe bis rote Farbstoffe, die in der Natur weit verbreitet sind. Sie werden derzeit als Tierfutterzusatz, Nahrungsergänzungsmittel und für pharmazeutische und kosmetische Produkte eingesetzt. Jedoch ist das Angebot strukturell verschiedener Carotinoide für medizinische Zwecke gering, und nur eine begrenzte Anzahl von Carotinoiden ist chemisch herzustellen, aus natürlichen Quellen zu isolieren oder zu fermentieren. Zunächst wurde in dieser Arbeit versucht, die mikrobielle Diversität von Carotinoiden zu erhöhen, indem Genbanken aus Boden-DNA auf Carotinoidbildung gescreent wurden. Dazu wurden verschiedene, sich im Aufschlußprinzip unterscheidende Methoden zur Extraktion von DNA aus Bodenproben miteinander verglichen. Dabei sollte erreicht werden, daß DNA aus Actinomyceten von DNA aus Gram-negativen Mikroorganismen abgetrennt werden kann, da die Expression von Actinomyceten Genen in E. coli wie auch die Expression von Genen aus Gram-negativen Organismen in Actinomyceten aufgrund unterschiedlicher Promotoren und Codon-usage oft problematisch ist. Durch die Kombination der Methoden nach Zhou und Moré konnte dies erreicht werden. Darüber hinaus wurde für die nach Moré isolierte DNA ein direktes Reinigungsprotokoll etabliert, wodurch die DNA ohne vorherige Fällung direkt mit Silica aus dem Lysat isoliert und gereinigt werden kann. Die anschließende Klonierung der nach Zhou isolierten DNA wurde in E. coli Zellen durchgeführt, die die beiden Carotinoid Gene crtB und crtE aus Erwinia uredovora auf einem Plasmid enthielten. Diese Zellen bilden bereits das farblose Carotinoid Phytoin. Durch Komplementationsscreening sollten nun Klone identifiziert werden, die weitere Gene für die Carotinoid Biosynthese tragen und deren Genprodukte Phytoin als Substrat nutzen können. So wäre die Identifizierung über eine Gelb- oder Rotfärbung des entsprechenden Klons möglich. Beim Screening von 70 000 Klonen konnte keiner identifiziert werden, der eine Gelb- oder Rotfärbung aufwies. Um eventuell auftretende systematische Fehler auszuschließen, wurde der Bodenprobe zur Validierung der Methode 1 ml E. uredovora-Kultur (entsprechend 5,5 x 108 Zellen) zugegeben, aus der anschließend DNA isoliert und die Genbank erstellt wurde. Beim Komplementationsscreening wurden unter 7 000 gescreenten Klonen vier identifiziert, die eine Gelborangefärbung aufwiesen, die von der Bildung von b-Carotin herrührt. Diese b-Carotin-Bildung war darauf zurückzuführen, daß die beiden Gene crtI und crtY, die im Genom von E. uredovora benachbart liegen, kloniert worden waren. Dies führt bei Komplementation mit den beiden Genen crtE und crtB, die in E. coli vorgelegt worden waren, zur Biosynthese von b-Carotin. Zur Erhöhung der molekularen Diversität von Carotinoiden wurde zunächst durch DNA shuffling zweier homologer Gene, die für Spheroiden Monooxygenasen codieren, versucht, die Substratspezifität dahingehend zu verändern, daß als bevorzugtes Produkt Carotinoide entstehen, die eine möglichst hohe Anzahl an Ketogruppen tragen. Die beiden Spheroiden Monooxygenasen (crtA) aus Rhodobacter capsulatus und Rhodobacter sphaeroides können die Carotinoide, die bei Expression der in E. coli vorgelegten Gene crtB, crtE und crtI-C14 (eine crtI-Mutante, die durch DNA shuffling zweier homologer crtI-Gene erzeugt worden war) gebildet werden, als Substrat nutzen und zu Oxo-Produkten umsetzen. Die Genprodukte von crtE, crtB und crtI-C14 führen in E. coli zur Bildung eines Gemisches aus Lycopin und 3,4,3´,4´-Tetradehydrolycopin was eine Pinkfärbung des entsprechenden Klons hervorruft. Bei den entsprechenden Oxo-Derivaten handelt es sich um unterschiedliche Produkte, da Klone, die die Gene crtB, crtE und crtI-C14 und den entsprechenden crtA-Wildtyp exprimieren, unterschiedliche Färbungen aufweisen. Es wurden 24 000 Klone der durch DNA shuffling erzeugten Mutantenbibliothek gescreent, wobei keiner im Vergleich zu den jeweiligen Wildtypen eine veränderte Färbung aufwies. In einem weiteren Ansatz wurde der Carotinoid Biosyntheseweg in E. coli durch die auf einem Plasmid codierten Gene crtB, crtE, crtI-C14 und crtY bis zum b-Carotin verlängert. Klone mit diesem Plasmid weisen eine Gelborangefärbung auf, die auf die Bildung von b-Carotin zurückzuführen ist. Die b-Carotin-Ketolase CrtO aus Synechocystis sp. PCC6803 (SYO) kann b-Carotin zu dem Ketocarotinoid Echinenon umsetzen. Durch Komplementationsscreening einer durch error-prone PCR erzeugten Mutantenbibliothek von SYO sollten Mutanten erzeugt werden, die zur Bildung von Canthaxanthin anstatt Echinenon führen. Diese sind durch eine veränderte Färbung bei visuellem Screening identifizierbar. In dieser Arbeit wurden 35 000 Klone gescreent, wobei keiner eine Farbänderung aufwies. Bei näherer Untersuchung zeigte sich allerdings, daß durch veränderte Kultivierungsbedingungen auch der SYO-Wildtyp in der Lage ist, Canthaxanthin als Hauptprodukt zu produzieren.