Universität Stuttgart
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Item Open Access Resolving heterogeneities in single and multiphase bioreactor systems - Predictive modelling tools towards successful scale-up(2020) Kuschel, Maike; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Verknüpfung molekularphysiologischer und reaktionskinetischer Werkzeuge zum Studium der in vivo Regulation des Glukosetransports von Saccharomyces cerevisiae(2003) Buziol, Stefan; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)In der vorliegenden Arbeit wurde der Glukosetransport von Saccharomyces cerevsisiae auf reaktionskinetischer und molekularphysiologischer Ebene untersucht. Der Transport von Hexosen beruht bei S. cerevisiae auf dem Prozess der carriervermittelten erleichterten Diffusion. Durch die Expression geeigneter Transportproteine aus einem Set von 20 Genen kann sich die Zelle auf die Umgebungsbedingungen einstellen. Zunächst wurden die kinetischen Parameter für die Transportproteine Hxt1, Hxt5 und Hxt7 anhand von Einzelexpressionsmutanten in vivo geschätzt. Zusätzlich wurde der Wildtyp charakterisiert. Durch den Einsatz der aeroben fed-batch Kultivierung wurde der quasi-stationäre Zustand, der die Grundvoraussetzung für diese Untersuchungen ist, im Gegensatz zum steady-state bei Chemostat-Kultivierung nach kürzerer Zeit erreicht. Ausgehend von Zellpopulationen unter physiologisch definiertem Zustand wurden Glukosepulsversuche durchgeführt, und die Abnahme der extrazellulären Glukose verfolgt. Dieses Signal wurde mit dem Resultat einer numerischen Integration der dynamischen Bilanzgleichung verglichen, um unter Verwendung einer irreversiblen Michaelis-Menten Kinetik die kinetischen Parameter für die Einzelexpressionsmutanten und den Wildtyp abzuschätzen. Um den Transportschritt vollständig beschreiben zu können, ist es nötig, die Konzentrationen von intrazellulärer Glukose und Glukose-6-Phosphat (G6P) miteinzubeziehen. Es ist hierbei von Bedeutung, die initiale Aufnahmerate zu erfassen, da es während der Glukoseaufnahmemessungen zu einem Anstau intrazellulärer Glukose und infolgedessen einem Efflux derselben kommen kann. Dieser Efflux überlagert dann die Aufnahmemessungen. Während für die Messung von G6P geeignete Zellaufschluss und Extraktionsverfahren zur Verfügung standen, musste zur Erfassung des Signals intrazellulärer Glukose eine neue Methode entwickelt werden. Durch die Etablierung einer stopped-flow Probenahmetechnik wurde es möglich, die Dynamik der Konzentrationen intrazellulärer Glukose und von G6P im Millisekundenbereich zu erfassen. Die experimentellen Daten für die Dynamik von intrazellulärer Glukose und G6P können nun eingesetzt werden um ein Modell des Glukosetransports zu validieren, das auf einer reversiblen Influx-Efflux Kinetik basiert und eine Inhibition durch G6P berücksichtigt. In weiteren Untersuchungen wurde durch den Einsatz von Western blot Analysen die Dynamik der Hexosetransportproteine (Hxt1, Hxt5 und Hxt7) parallel als Antwort auf Veränderungen in der Glukosekonzentration verfolgt. Die gemessenen Konzentrationen für extrazelluläre Gukose, Ethanol und Biomasse wurden mittels Western blot Analyse mit der Expression der Transportproteine korreliert. Zuerst wurde eine glukoselimitierte Chemostat-Kultivierung auf einen batch-Prozess unter Glukoseüberschuss umgeschaltet. Dabei wurde eine Reprimierung des intermediäraffinen Hxt5-Proteins und eine Induktion von Hxt1, dem niedrigaffinen Transporter beobachtet. Die Expression des hochaffinen Hxt7-Transporters wird nach dem Umschalten zunächst verstärkt, um dann stark abzunehmen. Dies könnte einen Mechanismus der Zelle darstellen, auf die erhöhten Glukosekonzentrationen schnell zu reagieren. Beim zweiten Ansatz wurde eine Chemostat-Kultur durch multiple Glukosepulse dynamisch angeregt. Es konnte kein Einfluss der multiplen Stimuli auf die Expression der Transporter Hxt1 und Hxt5 nachgewiesen werden. Hxt7 hingegen zeigte deutliche Änderungen im Expressionsprofil. Es wurde eine Korrelation zwischen der Expression von Hxt7 und den spezifischen Raten für die Glukoseaufnahme und die Ethanolbildung beobachtet. Die Anwendung des Konzepts der "Metabolic control analysis" (Sensitivitätsanalyse) auf ein dynamisches Modell zur Beschreibung des anaeroben Wachstums von S. cerevisiae zeigte, dass die überwiegende Kontrolle des glycolytischen Flusses auf dem Transportschritt liegt. Somit sollte eine Erhöhung der Transportkapazität zu einem höheren glycolytischen Fluss führen. Unter Verwendung einer HXT5-Überexpressionsmutante (HXT5-Multicopyplasmid), der HXT5-Einzelexpressionsmutante sowie des Wildtyps wurden vergleichende Messungen des glycolytischen Flusses durchgeführt. Dazu wurden anaerobe Chemostat-Kulturen eingesetzt und die spezifischen Glukoseaufnahme- und Ethanolbildungsraten gemessen. Die Erhöhung der spezifischen Raten war unbefriedigend. Dies könnte an der durch die Überexpression verursachten "protein burden" liegen oder das Resultat von stark veränderten Poolkonzentrationen sein. Somit sollte ein zukünftiger Ansatz zur Steigerung der glycolytischen Leistung die Minimierung des "protein burden" sowie die Aufrechterhaltung der Homöostase berücksichtigen. Wie sich aus weiteren Simulationsergebnissen ergab, müssen dabei auch Enzyme berücksichtigt werden, die der Erhöhung der Poolkonzentrationen entgegenwirken.Item Open Access Quantification of metabolic interactions between microorganisms(2024) Ulmer, Andreas; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Metabolic and transcriptomic response to hyperosmotic stimulus reveals strategies for optimization of antibody producing Chinese hamster ovary cells(2017) Pfizenmaier-Wu, Jennifer; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Algorithms for the global mapping of RNA-RNA interactomes(2024) Schäfer, Richard A.; Voß, Björn (Prof. Dr.)RNA-RNA intra- and intermolecular interactions are fundamental for numerous biological processes. While there are reasonable approaches to map RNA secondary structures genome-wide, understanding how different RNAs interact to carry out their regulatory functions requires mapping of intermolecular base pairs. RNA-RNA interaction prediction algorithms alone are not capable to consider all biological factors, thus, they suffer from low accuracy. Recently, different strategies to detect RNA-RNA duplexes in living cells, so called direct duplex detection (DDD) methods, have been developed. Common to all is the psoralen-mediated in vivo RNA crosslinking followed by RNA Proximity Ligation to join the two interacting RNA strands. Sequencing of the RNA via classical RNA-Seq and subsequent specialised bioinformatic analyses, which results in the prediction of intra- and intermolecular RNA-RNA interactions. Existing approaches adapt standard RNA-seq analysis pipelines but often neglect inherent features of RNA-RNA interactions that are useful for filtering and statistical assessment. In this work, RNAnue is presented, a general pipeline for the inference of RNA-RNA interactions from DDD experiments that takes into account hybridisation potential and statistical significance to improve prediction accuracy. RNAnue was applied to data from different DDD studies, and the results were compared to those of the original methods. This showed that RNAnue performs better in terms of prediction quantity and quality.Item Open Access Dynamische Modellierung und Simulation des Arzneimittelmetabolismus in humanen Leberzellen: Identifizierbarkeit, Robustheit und inter-individuelle Variabilität(2011) Bucher, Joachim; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)Die Effizienz in der heutigen Arzneimittelforschung und -entwicklung ist, bezogen auf das Verhältnis zwischen der Anzahl der potentiellen aktiven Wirkstoffe und der Anzahl der auf dem Markt vertriebenen Arzneimittel sehr niedrig. Diese Ineffizienz beruht darauf, dass mehr als die Hälfte der Wirkstoffe die klinischen Tests nicht besteht, was wiederum auf erhebliche toxische oder geringe pharmakokinetische Eigenschaften zurückzuführen ist. Untersuchungen zum Arzneimittelmetabolismus im Körper spielen eine große Rolle, da Arzneimittel toxische Eigenschaften annehmen können, wenn sie nicht effizient metabolisiert und aus dem Körper eliminiert werden. Die Leber trägt am meisten zum Arzneimittelmetabolismus bei, da Detoxifikationsenzyme, wie die Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYPs) und UDP-Glucuronosyltransferasen (UGTs), in großer Menge in den Leberzellen exprimiert sind und eine hohe inter-individuelle Variabilität aufweisen. Diese Variabilität darf jedoch nicht mit dem therapeutischen Fenster in Konflikt geraten. Daher erfordert diese inter-individuelle Variabilität eine breit gefächerte, auf Populations-Statistiken beruhende Risiko-Abschätzung der Toxizität in der pharmakologischen Forschung. Diese Arbeit, welche sich auf die dynamische Analyse des Arzneimittelmetabolismus in Hepatozyten konzentriert, setzt den Fokus auf die Modellierung des Netzwerkes in Phase I, II und III, in der Modellidentifikation anhand experimenteller Daten auf die Analyse der Parameter-Identifizierbarkeit, welche mit der Robustheit des Systems verknüpft ist, sowie auf die Vorhersage des individuellen Arzneimittelabbaus auf Basis von individuellen CYP- und UGT-Proteindaten. Die Untersuchung des Arzneimittelmetabolismus in dieser Arbeit zeigte, dass Modellierung und Simulation des Metabolismus und der Transportschritte in Leberzellen essentielle Elemente in der Vorhersage der Toxizität darstellen. Von Bedeutende sind vor allem die quantitative Bestimmung der Modellparameter, sowie die qualitative Beurteilung der Parameteridentifizierbarkeit anhand von Sensitivitäten und Korrelationen. Nur eine hochwertige Modellierung erlaubt die Vorhersage der pharmakokinetischen Eigenschaften des Arzneimittels in der Leber, die Prognose des inter-individuellen Ausmaßes und die statistische Analyse in der Bevölkerung. Diese Arbeit zeigte jedoch, dass dieses Isoenzym-System auf Basis von experimentellen Daten an hepatischen Mikrosomen kaum identifizierbar ist, da dieses System insensitive und nicht-identifizierbare Parameter aufweist. Daher zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die detaillierte Untersuchung des Reaktionsnetzwerkes an rekombinanten Isoenzymen vielversprechender und bedeutender ist als an Mikrosomen, in dem Fall, dass mehrere Isoenzyme an dem Abbau eines Arzneimittels zu einem bestimmten Produkt beteiligt sind. Des Weiteren spielen Transportschritte eine wichtige Rolle in der Elimination und der Ausscheidung von Arzneimitteln aus den Leberzellen. Die Modellidentifikation anhand experimenteller Daten an primären humanen Hepatozyten zeigte in ähnlicher Weise zu der Modellverifikation an Lebermikrosomen insensitive und linear korrelierende Parameter in den Transportschritten. Eine Möglichkeit der Modellreduktion auf Basis einer lokalen Parametersensitivitätsanalyse konnte in dieser Arbeit erfolgreich aufgezeigt werden, welche zu sensitiven Parametern führte und damit zuverlässige Modellvorhersagen zulässt. Die Modellverifikation sollte jedoch in Zukunft durch die Implementierung von zusätzlichen Daten aus Untersuchungen an rekombinanten Transportsystemen ergänzt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Vorhersage der inter-individuellen Variabilität auf quantitativen Proteindaten beruht, sollten die zukünftige Verbesserung der quantitativen Bestimmung der CYP- und UGT-Enzyme, sowie die entsprechende Entwicklung von Methoden für die Transportproteine weiter verfolgt werden. Zukünftig sollte ebenso ein Fokus auf die Kopplung des Moduls des Arzneimittelmetabolismus mit den Modulen Zentralmetabolismus und Genregulation gelegt werden, was die holistische Simulation des Arzneimittelmetabolismus in Wechselwirkung mit den anderen Prozessen in der Zelle unter normalen und krankheitsbedingt gestörten Bedingungen erlaubt. Die Vorhersage der Reaktionswege, der Enzympartner und sogar der Modellparameter, sowie deren Verteilung in der Bevölkerung auf Basis von physikochemischen Eigenschaften von Substanzen, wird ebenso eine zentrale Rolle in der Zukunft spielen. Ein weiteres Potential des in dieser Arbeit vorgestellten Modellierungsansatzes liegt in der Implementierung in multi-kompartimentellen physiologisch basierten pharmakokinetischen Modellen. In diesem Rahmen könnten die individuellen in-silico-Vorhersagen verbessert und ein weiterer Fortschritt in der Entwicklung der personalisierten Medizin erreicht werden.Item Open Access Metabolic compartmentalization in 13C metabolic flux analysis of Chinese hamster ovary cells(2023) Wijaya, Andy Wiranata; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Chinese hamster ovary cells is currently a prime focus in mAb production, comprising over 70% of the total approved biologics. The coming patent expiration of blockbuster drugs triggers new market competition for alternative biosimilars. These alternatives create price competition, hence, biosimilar development has been driven by the need to reduce the manufacturing cost. Reducing the manufacturing cost could be achieved by the optimization of the cell lines or cell culture media. For this purpose, OMICS plays an important role, especially to understand cellular metabolism. OMICS technologies provide insights into the cellular capabilities (blueprint) to the actual activities (metabolome/fluxome). This thesis utilized flux analysis to study the metabolism of CHO cells, especially with the use of Carbon-13 (13C Metabolic Flux Analysis). The combination of isotopic non-stationary 13C MFA, compartmented metabolic model, and the sub-cellular metabolome profile allow the quantification of the in vivo mitochondrial shuttles and identification of the sub-cellular fluxes (e.g. isoenzymes). The latter was identified as the bottleneck for improving IgG1 production.Item Open Access Investigation of growth limitations in (pseudo-)steady states with Corynebacterium glutamicum(2019) Graf, Michaela; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Harmonizing metabolic and spatial compartmentalization for heterologous production of crude violacein in synthetic microbial co-culture(2024) Müller, Tobias; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Systembiologische Untersuchungen zur Optimierung mikrobieller Produzenten schwefelhaltiger Aminosäuren(2016) Teleki, Attila; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Die schwefelhaltige und essentielle Aminosäure L-Methionin besitzt vor allem aufgrund ihres Einsatzes zur Supplementierung von pflanzlichem Tierfutter eine enorme wirtschaftliche Bedeutung. Der globale Jahresbedarf wird auf ca. 1.000.000 Tonnen geschätzt und weist angesichts eines ansteigenden Fleischbedarfs, insbesondere in Schwellenländern, stabile jährliche Wachstumsraten von ca. 5-6% auf. Methionin wird derzeit nahezu ausschließlich durch chemische Synthese (Evonik-Verfahren) als DL-Razemat hergestellt. Ein moderner biotechnologischer Prozess würde eine nachhaltige Alternative zu bisher petrochemisch-basierten Verfahren darstellen und bietet das Potential einer erheblichen Kostensenkung, höherer Substratflexibilität sowie der Herstellung von enantiomer-reinem L-Methionin. Eine Überproduktion von L-Methionin stellt allerdings aufgrund der Komplexität zugrundeliegender Stoffwechselwege, einer strikten zellulären Regulation und eines vergleichsweise hohen energetischen Syntheseaufwands innerhalb gängiger mikrobieller Plattformen eine große Herausforderung dar. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels systembiologischer Ansätze ein durch die Evonik Industries AG bereitgestellter Modellproduzent (E. coli SPOT01) auf Potentiale zu einer gezielten Methionin-Überproduktion untersucht. Rationale Stammoptimierungen basieren auf systematische genetische Modifikationen und setzen ein dynamisch-quantitatives Verständnis zugrundeliegender intrazellulärer Stoffwechselnetzwerke voraus (Systems Metabolic Engineering). Innerhalb zielgerichteter metabolischer Perturbationsanalysen können Kontrolleinflüsse beteiligter Enzyme auf die zu optimierenden Zielflüsse auf systemischer Ebene quantifiziert werden (Metabolic Control Analysis). Derartige Ansätze erfordern eine abgestimmte Anwendung intrazellulärer Metabolomanalysen, adäquater Perturbations- und Probennahmestrategien sowie mathematischer Modellierung. Hierzu wurde eine universelle LC-ESI-MS/MS-Methode entwickelt, die eine sensitive und selektive Quantifizierung eines breiten Spektrums niedermolekularer Metabolite des zellulären Stoffwechsels ermöglicht (Metabolic Profiling). In umfangreichen Transportkinetik-Studien konnte anschließend mit L-Serin ein alternatives und netzwerk-inhärentes Stimulussubstrat identifiziert werden, das eine direkte und zielgerichtete Perturbation des L-Methionin-Synthesenetzwerks ermöglicht. Unter Anwendung adaptierter Stimulusszenarien sowie semi-automatisierter Beprobungsstrategien konnten innerhalb produktionsrelevanter Kultivierungsbedingungen von E. coli SPOT01 aussagekräftige Konzentrationsdynamiken fokussierter Metabolitpools erzielt werden. Für die quantitative Auswertung resultierender Perturbationsprofile wurde ein modellbasierter Ansatz unter Verwendung einer nicht-mechanistischen LinLog-Kinetik sowie ein rein datengetriebener Ansatz unter Verwendung des PEC-Kriteriums (Pool Efflux Capacity) verfolgt. Insbesondere die PEC-Analyse stellte sich hierbei als zielführender Ansatz heraus, der aufgrund seiner hohen Robustheit auch bei messtechnischen Unsicherheiten valide Aussagen im Rahmen der Kontrollanalyse erlaubt. Innerhalb unterschiedlicher Perturbationsstudien konnten hierbei übereinstimmend die Cystathionin-β-Lyase (MetC), die Methioninsynthase (MetH/E) und das Methionin-Exportsystem (YjeH) als Enzyme mit hoher Flusskontrolle identifiziert werden. Aufgrund einer ausgeprägten Akkumulation des Vorläufermetabolits L-Homocystein und eines zunehmenden Übergewichts gegenüber L-Cystein, erfolgt die unspezifische Umsetzung des cytotoxischen Intermediats zum Akkumulationsprodukt Homolanthionin. Der unspezifische Abbau von Homolanthionin führt zur erneuten Bildung von L-Homocystein und stellt den Ausgangspunkt für eine alternative Syntheseroute des Haupt-Nebenprodukts L-Isoleucin. Dieses für die L-Methioninsynthese höchst unvorteilhafte Akkumulationsszenario (Kohlenstoff- und Energieverlust) konnte letztlich auf ein Ungleichgewicht in der Bereitstellung von L-Aspartat (TCA-Syntheseweg) und L-Serin (EMP-Syntheseweg) zurückgeführt werden. Unter Einsatz des vollmarkierten Stimulussubstrats [U13C]-L-Serin konnte der Informationsgehalt resultierender instationärer Datensätze weiter gesteigert werden. Die hohe Flusskontrolle durch die Methioninsynthase (MetH/E) konnte hierbei eindeutig auf eine limitierte Transmethylierungskapazität durch den C1-Stoffwechsel zurückgeführt werden. Ein Schlüsselenzym in diesem Zusammenhang stellt die Hydroxymethyltransferase (GlyA) dar, welche unter Umsetzung von L-Serin Methylgruppen für die finale Transmethylierung bereitstellt. Durch eine gezielte Erhöhung der enzymatischen Affinität von GlyA zu seinem Substrat L-Serin kann eine Kompensation des TCA/EMP-Ungleichgewicht unter einer gleichzeitigen Aufhebung des Akkumulationszyklus erfolgen.