Universität Stuttgart
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Item Open Access Etablierung einer biologischen vaskularisierten Matrix als Grundlage für ein in-vitro-Lebertestsystem(2007) Schanz, Johanna Elisabeth; Brunner, Herwig (Prof. Dr. techn.)Die Leber spielt eine zentrale Rolle im Stoffwechsel eines Organismus. Sie ist aus einer Vielzahl hochspezialisierter Zellen aufgebaut und übernimmt komplexe, für den gesamten Organismus lebensnotwendige Stoffwechselfunktionen. Eingenommene Medikamente und Substanzen gelangen im Menschen über das Blutkreislaufsystem zur Leber und werden dort von den Hepatozyten um- und abgebaut (Biotransformation). Hierbei entstehen sogenannte Metabolite, die oft eine ganz andere (mitunter toxische) Wirkung haben als das ursprüngliche Medikament. Aus diesem Grund sind Leberzellen (Hepatozyten) bzw. das gesamte Organ "Leber" von besonderem Interesse als Analysesystem für Substanzen, Wirkstoffe und ihre Metabolite. Es gibt für Metabolismusstudien verschiedene, relativ einfache in vitro Testsysteme jedoch noch kein humanes organähnliches Lebermodell, das Langzeitstudien an primären Hepatozyten ohne Funktionsverlust ermöglicht. Damit isolierte Hepatozyten in der Kultur ihre Funktionalität behalten, ist die Bereitstellung einer möglichst in vivo ähnlichen Mikroumgebung wichtig. Dazu gehören einerseits die Co-Kultur mit nicht-parenchymalen Leberzellen und andererseits die Gewährleistung der Zellversorgung sowie eine geeignete Trägerstruktur (Matrix), die eine 3-Dimensionalität der Kultur schafft. Zur Aufbau eines Co-Kultursystems wurden in dieser Arbeit Endothelzellen eingesetzt, da sie eine Filtrationsbarriere für Makromoleküle zwischen dem Blut und den Gewebszellen bilden und an der Regenerationsprozessen beteiligt sind. Als Trägerstruktur wurde eine azellularisierte, vaskularisierte Matrix aus Schweinedarm, das so genannte "Biological Vascularized Scaffold" (BioVaSc), verwendet. Sie basiert auf einem 10 - 15 cm langen Stück porcinen Jejunums, welches sich unter Erhalt der Gefäßsystemstrukturen inklusive des arteriellen Zuflusses sowie des venösen Abflusses chemisch azellularisieren lässt. Eine ausreichende Versorgung der Hepatozyten mit Nährstoffen und Sauerstoff sowie der Abtransport von Toxinen und Metaboliten nach Medikamenten-/Wirkstoff-Umsetzung ließen sich durch ein computergesteuertes Bioreaktorsystem gewährleisten. Zum Aufbau eines Lebermoduls wurde die BioVaSc in zwei Schritten mit Zellen besiedelt: Im ersten Schritt erfolgte die Rebesiedelung der Gefäßstrukturen mit primären mikrovaskulären Endothelzellen oder endothelialen Vorläufer über den arteriellen Zufluss. Im zweiten Besiedlungsschritt folgte die Besiedlung des Matrixlumens (ehemaliger Darm) mit primären Hepatozyten. Dazu wurden die Zellen in einer Kollagen-I-Suspension ins Matrixlumen pipettiert und selbiges an beiden Seiten mit Klemmen verschlossen. Das so entstandene Co-Kultursystem ließ sich über einen Zeitraum von 2-3 Wochen im Bioreaktor kultivieren. Eine Probenentnahme zur Überwachung der Zellfunktionen erfolgte wochentäglich. Nach Versuchsende fand eine Fixierung der BioVaSc für die Herstellung von Paraffinpräparaten statt. Anhand der Expression der endothelzellspezifischen Marker CD 31 und FLK-1 konnte im Rahmen dieser Arbeit die Differenzierung porciner Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane Endothelzellen ließen sich unter Erhalt der genannten Marker in das Gefäßsystem integrieren und waren der Ursprung für neu entstandene Blutgefäße (Neoangiogenese). Die ins System integrierten Hepatozyten exprimierten ebenfalls zellspezifische Marker (CKLP 34, Hepatocyte), bildeten wichtige Zell-Zellkontakte wie Tight Junctions und Adherens Junctions aus und proliferierten. Durch die Anfärbung von Tight Junctions ließen sich zwischen den Zellen Gallenkanälchenstrukturen sichtbar machen. Eine Kommunikation zwischen Endothelzellen und Hepatozyten (cellular Cross-Talk) konnte über die Expression von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) belegt werden. Anhand der Mediumproben ließ sich nachgeweisen, dass die Hepatozyten bis zum Ende der Kultur Harnstoff sowie Albumin synthetisierten und Laktat bildeten. Der Phase-I- und Phase-II-Metabolismus von Dextrometorphan war im porcinen Modell ohne Enzyminduktion nachweisbar. Die Etablierung des Lebermoduls erfolgte zunächst aufgrund der besseren Verfügbarkeit auf Basis porciner Zellen. Die Ergebnisse ließen sich jedoch anschließend auf das humane Modell übertragen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die BioVaSc als Grundlage für ein Lebertestsystem eignet. Das hier aufgebaute System hat als erstes Modell ein Gefäßsystem zur Co-Kultur von Endothelzellen und Hepatozyten unter physiologischen Bedingungen. Erstmals stellt ein Lebermodell damit die Möglichkeit in Aussicht den Transport von im Blut gelösten Molekülen durch die sinusoidale Endothelzellschicht zu den Hepatozyten bzw. von Metaboliten durch die sinusoidale Endothelzellschicht zum Blut zu untersuchen.Item Open Access New insights into structure and function of type I collagen(2008) Xiong, Xin; Brunner, Herwig (Prof. Dr. techn.)Collagen is one of the most abundant proteins in mammalians and strongly conserved throughout evolution. It constitutes one third of the human proteome and comprises three-quarters of the dry weight of human skin. It is widely accepted as a major structural component in animal body such as in bones, cartilage and skins. More and more studies have shown that, in addition to the structural function, collagens can induce or regulate many cellular functions and processes such as cell differentiation, cell motion, cell communication and apoptosis. Furthermore, its unique triple helix structure gained more attention since it is responsible for its high stability and biological function. Due to the high accessibility, Type I and Type III collagen are widely studied and frequently used as biocompatible materials in cell culture, tissue engineering and medical technology. Until now the understanding of the molecular mechanisms for collagen assembly is of great medical and also biotechnological importance. Here, large amounts of highly purified homogeneous Type I collagen have been obtained from rat tail tendon by a simple two-step purification involving extraction with 9 M urea followed by Superose 12 chromatography. This simple two step purification of Type I collagen is up-scalable. The yield is up to 95%. The product could be easily lyophilized and stored. AFM and SEM images showed a structure similar to natural collagen. This collagen was extensively characterized by different biochemical, physical and cell biological methods. Mass spectrometry identified only collagen Type I peptides indicating that the extracted collagen was homogeneous. The comparison between urea-extracted (UC) collagen and acetic acid-extracted collagen (AC) showed significant differences whereby the UC was not degraded or hydrolyzed as in acetic acid. Furthermore, tandem MS analyses showed some interesting post-translational modifications, which will result in new insights into collagen structure in vivo. The purified collagen was renatured quantitatively by dialysis against water to form triple-helices, as judged by UV-circular dichroism. The collagen dissolved in 8M urea exhibits a unique reversible aggregation behavior which is not affected by the presence of reducing agents. UV-circular dichroism analysis shows that collagen initiates triple helix formation at 4 M urea or below. This triple helix structure is comparable to that observed with synthetic collagen peptides. Cultures of a 3T3 mouse embryonic fibroblast cells incubated with urea-extracted collagen showed a higher motility than those grown with acetic acid-extracted collagen as judged by light microscopy and scanning electron microscopy. The real time PCR showed significant difference on transcriptional level and showed clearly up regulation of the genes involved in response to mechanical stress in AC but not in UC and reference culture in medium. All these results indicate a benefit of UC for biotechnological/biomedical applications. The urea-extracted collagen exhibits a unique reversible-aggregational phenomenon during gel filtration in 8 M urea. We could show that covalent bonds and cross-linkings are not involved. This observation and subsequently extensive mass spectrometric analyses led to a new model of triple-helical assembly and a hypothesis about the collagen export, which may offer some new insights into understanding of collagen structure and transport from cytosol to extracellular space. The results presented here have led to an industrial patent (patented on 04. 30th. 2008). A manuscript was submitted to FEBS J for publication.Item Open Access Phänotypische und molekularbiologische Untersuchungen der Interaktionen in gemischten Biofilmen(2012) Purschke, Frauke Gina; Rupp, Steffen (PD Dr.)Die Mehrheit der Mikroorganismen lebt in ihrer natürlichen Umgebung in Biofilmen, oberflächenassoziierten Lebensgemeinschaften, die normalerweise von einer extra-zellulären Matrix umgeben sind. Die meisten Biofilme werden nicht von einzelnen sondern mehreren Spezies gebildet, die in den Biofilmen nicht nur miteinander kooperieren, sondern auch um vorhandene Nährstoffe konkurrieren. Die Gram-negative Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa und der polymorphe Pilz Candida albicans sind zwei opportunistisch Pathogene, die oft in Co-Existenz in einem humanen Wirt nachgewiesen werden. Verschiedene Modelle antagonistischen Verhaltens wurden für diese Organismen in gemischten Biofilmen berichtet. Um diese Inter-aktionen zwischen P. aeruginosa und C. albicans genauer zu erforschen, wurde der Einfluss der Quorum sensing Moleküle untersucht. Hierfür wurde ein in vitro Assay etabliert, der eine einfache und schnelle Detektion von Veränderungen in der Aus-prägung von Biofilmen erlaubt. Während sowohl Überstände als auch nur das für die Biofilmbildung von P. aeruginosa wichtige Quorum sensing Molekül N-3-oxo-dodecanoyl-homoserinlacton die Biofilmbildung von C. albicans unterdrücken, wirkt Farnesol, der Pilz-Autoinducer, zwar inhibierend auf die Adhärenz, aber verstärkend auf bereits bestehende bakterielle Biofilme. Zur weiteren Charakteriserung dieser Interaktion wurde das Sekretom einzelner und gemischter Biofilme zu verschiedenen Zeitpunkten mit MALDI-TOF MS/MS analysiert. Insgesamt wurden 247 unter-schiedliche Proteine identifiziert, von denen 170 P. aeruginosa und 77 C. albicans zugeordnet werden konnten. P. aeruginosa sekretierte in Anwesenheit von C. albicans Virulenzfaktoren wie das Exotoxin A sowie Proteine der Stoffwechselwege zur Eisenerfassung wie das Pyochelin-Biosynthese-Protein PchD und den Ferripyoverdin-Rezeptor FpvA. Außerdem wurde in gemischten Biofilmen jedoch nicht in rein bakteriellen Biofilmen das Siderophor Pyoverdin identifiziert, das Eisen mit großer Affinität bindet. Dieses deutet darauf hin, dass P. aeruginosa in Konkurrenz mit C. albicans die Wege zur Eisenaufnahme induziert. Von C. albicans dagegen wird der Metabolismus reprimiert, inklusive der detektierten eisenbindenden Proteine. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mikroorganismen nicht nur mit dem Wirt um essentielle Nährstoffe konkurrieren, sondern auch mit der vorhandenen Mikroflora. Die transkriptionellen Veränderungen während der Ausbildung von Biofilmen wurden genutzt, um Reporterstämme in C. albicans, P. aeruginosa und dem nicht-pathogenen E. coli herzustellen, welche die Bildung von Biofilmen anzeigen. Mit Hilfe dieser Stämme können Quorum sensing Moleküle anderer Mikroorganismen detektiert werden. Gemeinsam mit dem in vitro Assay steht mit diesen Stämmen eine Toolbox zur Verfügung, um Biofilme und Einflüsse auf diese zu charakterisieren.Item Open Access Detektion und Charakterisierung von Zellwandproteinen in Candida albicans(2008) Hiller, Ekkehard; Brunner, Herwig (Prof. Dr.)Candida albicans ist ein weit verbreiteter human pathogener Organismus, der sowohl oberflächliche wie auch systemische Infektionen verursacht. Diese treten vor allem bei Personen mit geschwächtem Immunsystem auf. Bei der Infektion spielen die Zellwand und ihre Bestandteile eine besonders wichtige Rolle. Dieses komplexe Netzwerk aus Glucan, Chitin, Mannan und Proteinen stellt die Naht¬stelle der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen dar. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mehrere der in dieses Netzwerk eingebundenen Proteine ausschlaggebend für die Adhäsion und die Interaktion mit dem Wirt und seinem Immunsystem sind. Hinweise auf Änderungen im Zell¬wand-Proteom während des Übergangs vom Wachstum als Blastosporen hin zu Hyphen wurden zuerst im Microarray Experimenten gefunden, und konnten später in Untersuchungen bestätigt werden, die sich auf die Zellwandproteine konzentrierten. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Proben¬vorbereitung verglichen, um die kovalent an die Zellwand gebundenen Proteine oder deren Peptide durch massen¬spektro¬metrische Methoden zu identifizieren. Trypsin, Endo¬proteinase Glu-C und Bromcyan zur Freisetzung von Proteinfragmenten wurden allein oder in Kombination verwendet und miteinander verglichen. Zusätzlich untersucht wurden die Auswirkungen einer Vor¬behandlung der Zell¬wand durch eine β-1,3-Glucanase. Die Identifikation der Peptide erfolgte mittels zweier verschiedener Massenspektrometer. Insgesamt konnten 33 Proteine in der Wachstumsform der Blastosporen identifiziert werden, sechs davon mit vorhergesagtem GPI-Anker. Im Gegensatz dazu wiesen 14 der 18 identifizierten Proteine aus Hyphen-Zellen diese spezifische Ankersequenz auf, 12 davon sind in dieser Wachstumsform transkriptionell induziert. Zwischen den verwendeten Methoden wurde eine hohe Varianz in der Zahl identifizierter Proteine, bzw. der Zahl zu einem Protein gehörender Peptide, gefunden. Zusätzlich wurden die von C. albicans in synthetische Flüssigmedien sekretierten Proteine identifiziert. Unter den sowohl von Blastosporen wie auch Hyphen sekretierten Proteinen befand sich Sun41p. In einer früheren Arbeit wurde gezeigt, dass die Transkription dieses Proteins in Hyphen induziert wird. Die SUN Gen Familie, zu der es gehört, wurde in S. cerevisiae definiert und beinhaltet eine für Pilze spezifische Familie von Proteinen die eine hohe Übereinstimmung in ihrer C-terminalen Domäne aufweisen. Gene dieser Familie sind in unterschiedliche zelluläre Prozesse wie DNS-Replikation, Alterung, mitochondriale Biogenese und Cytokinese involviert. In C. albicans gehören zwei Gene, SUN41 und SIM1, dieser Familie an. Da Sun41p als potentieller Virulenz¬faktor Ziel einer gegen Pilze gerichteten Therapie darstellen kann, wurde seine Funktion durch die Konstruktion einer SUN41 Deletionsmutante untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass C. albicans Mutanten ohne SUN41 ähnliche Defekte aufweisen wie sie auch bei entsprechenden S. cerevisiae Mutanten gefunden wurden. Dies beinhaltet unter anderem Defekte bei der Cyto¬kinese. Zusätzlich zeigten die SUN41 Mutanten eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber der die Zellwand schädigende Substanz Kongorot, wohingegen bei der Anwesenheit von Calcofluor Weiß keine Veränderung beobachtbar war. Im Vergleich mit dem Wildtyp wies der SUN41 Deletions-Stamm Defekte bei der Bildung von Biofilmen auf, zeigte eine reduzierte Adhäsion auf einem epithelialen Gewebemodell und konnte unter den getesteten Bedingungen auf Festmedien keine Hyphen bilden. Die Ergebnisse deuten auf eine Funktion von Sun41p als Glycosidase hin, die an der Zellwand-Biogenese beteiligt ist und dadurch die Cytokinese, die Adhäsion am Wirtsgewebe, die Bildung von Biofilmen und die Virulenz beeinflusst. Dies weist auf eine wichtige Rolle von Sun41p bei der Interaktion des Pathogen mit dem Wirt hin.Item Open Access Entwicklung eines DNA-Microarrays zur Detektion von Resistenzdeterminanten in Acinetobacter baumannii(2014) Dally, Simon; Rupp, Steffen (PD Dr.)Acinetobacter baumannii ist ein opportunistisch pathogenes Bakterium, welches schwere Infektionen, insbesondere Pneumonie, Sepsis, Harnwegs- oder Wundinfekte, auslösen kann. Es besitzt die Fähigkeit, in beachtlichem Ausmaß, Antibiotika-Resistenzen zu akquirieren, was die Behandlung infizierter Patienten erheblich erschwert. Erst nach der Detektion dieser Resistenzen lässt sich eine gezielte antibiotische Therapie initiieren. In dieser Arbeit wurde ein DNA-Microarray entwickelt, der die Diagnose von Resistenzdeterminanten in A. baumannii ermöglicht. Der Zeitbedarf für die Arrayanalyse lag mit 4 Stunden dabei deutlich unter dem für konventionelle kulturbasierte Methoden. Der neu entworfene Microarray ist mit seinen 370 speziell entwickelten Sonden dazu in der Lage, 91 Zielsequenzen, die mit einer Antibiotika-Resistenz assoziiert sind, nachzuweisen. Die kurze Bearbeitungszeit, die für eine Analyse veranschlagt werden muss, gewährt die schnelle Verfügbarkeit therapierelevanter Resultate. Damit ist eine schnelle Anpassung der Medikation kritisch erkrankter Patienten und konsekutiv eine Verbesserung ihrer Prognose möglich. Auch zur Aufklärung epidemiologischer Fragestellungen könnte der Microarray eingesetzt werden.Item Open Access Hydrogelsysteme auf Basis UV-polymerisierbarer Biopolymere für den Aufbau von Gewebemimetika mittels Inkjet-Bioprinting am Beispiel von hyalinem Knorpel(2014) Hoch, Eva; Tovar, Günter (Prof. Dr.)Gegenstand der Arbeit war die Darstellung von Biopolymer-basierten, gewebeähnlichen Hydrogelsystemen und deren Formulierung als Biotinten für das Inkjet-Bioprinting. Dafür wurden zwei Bestandteile der natürlichen extrazellulären Matrix gewählt: Gelatine und Chondroitinsulfat. Beide wurden durch Reaktion mit Methacrylsäureanhydrid derivatisiert. Zur Anpassung der Geleigenschaften an verschiedene native Gewebe durch Variation des Vernetzungsgrades wurden Gelatinederivate mit verschiedenen Methacrylierungsgraden der Aminogruppen erzeugt: Ca. 70 % bis ca. 100 %. Chondroitinsulfat wurde mit einem Methacrylierungsgrad der Disaccharideinheiten von ca. 23 % derivatisiert. Unter Variation des Methacrylierungsgrades sowie des Massenanteiles konnten durch UVA-initiierte Vernetzung in Anwesenheit des Photoinitiators Irgacure® 2959 chemisch stabile Gelatinehydrogele mit großer Variationsbreite ihrer Quellbarkeit (ca. 370 % bis 965 %) und mechanischen Festigkeit (ca. 5 kPa bis 370 kPa) erzeugt werden. Die erreichten Quellbarkeiten und mechanischen Festigkeiten lagen im Bereich verschiedener nativer Weichgewebe. Die Vernetzung mithilfe eines hoch intensiven, fokussierten Laserstrahles im Sinne der Zweiphotonenpolymerisation ermöglichte außerdem die Erzeugung von mikrostrukturierten Gelatinehydrogelen. Gelenkknorpel (hyaliner Knorpel), welcher in der vorliegenden Arbeit als Modellgewebe gewählt wurde, besitzt herausragende Eigenschaften bezüglich seiner Festigkeit und Quellbarkeit. Durch die Integration von Chondroitinsulfat in die Gelatinehydrogele konnten die Geleigenschaften im Hinblick auf die Beschaffenheit von nativem Gelenkknorpel verbessert werden, indem die Quellbarkeit bei gleichbleibender Festigkeit signifikant erhöht wurde. So wiesen beispielsweise 10 Gew.-%-ige Gelatinehydrogele (Methacrylierungsgrad ca. 85 %) einen Speichermodul von ca. 9,8 kPa und eine Quellbarkeit von ca. 660 % auf. Vergleichbare Hybrid-Hydrogele mit Chondroitinsulfat besaßen mit ca. 10,7 kPa einen nahezu unveränderten Speichermodul, wohingegen die Quellbarkeit mit ca. 830 % signifikant höher war. Die physikalischen Eigenschaften der Hybrid-Hydrogele aus Gelatine und Chondroitinsulfat waren damit nativem Gelenkknorpel ähnlicher als die reiner Gelatinehydrogele. Bei der Verkapselung von Chondrozyten in dreidimensionale Gelatine- und Gelatine-Chondroitinsulfat-Hydrogele zeigte sich ein deutlicher Einfluss der Gelzusammensetzung auf die Morphologie und das Proliferationsverhalten der Zellen. Chondrozyten in Chondroitinsulfat-haltigen Gelen wiesen eine zellarttypische kugelige Morphologie und eine geringe proliferative Aktivität auf. Chondrozyten in reinen Gelatinegelen besaßen vorwiegend eine Fibroblasten-artige Morphologie und eine höhere Proliferationsrate, wie es für dedifferenzierte Chondrozyten typisch ist. Dies deutet darauf hin, dass die dargestellten Chondroitinsulfat-haltigen Hydrogele den Chondrozyten-spezifischen Differenzierungszustand stabilisierten, während reine Gelatinehydrogele dies nicht taten. Im Hinblick auf die Verarbeitung der dargestellten Materialsysteme mittels Inkjet-Druckverfahren wurde die Viskosität der Hydrogelprecursorlösungen untersucht. Lösungen unmodifizierter und niedrig methacrylierter Gelatine mit Massenanteilen >= 10 Gew.-% gelierten bei 25 °C und besaßen selbst bei 37 °C Viskositäten > 10 mPa s, die für kommerzielle Inkjet-Druckköpfe zu hoch sind. Dahingegen wiesen Lösungen hoch methacrylierter Gelatine bei 37 °C und 25 °C bis zu Konzentrationen von 15 Gew.-% Inkjet-druckbare Viskositäten < 10 mPa s auf. Die zusätzliche Acetylierung der Gelatinederivate mit niedrigem Methacrylierungsgrad bewirkte eine Maskierung noch vorhandener freier Aminogruppen, ohne dass sich der Gehalt an vernetzbaren Methacrylgruppen änderte. Durch die daraus resultierende Reduktion der inter- und intramolekularen Wechselwirkungen der Gelatinemakromonomere konnten auch diese Lösungen zu Inkjet-druckbaren Biotinten formuliert werden. Die Doppelfunktionalisierung mit Acetyl- und Methacrylgruppen ermöglichte damit die Formulierung von Gelatine-basierten Inkjet-Biotinten mit einer großen Bandbreite der Quellbarkeit und der Festigkeit der resultierenden Hydrogele. Die dargestellten Materialsysteme wurden als Biotinten mit einem piezoelektrischen Mikrodosiersystem verarbeitet. Dabei konnte bei einer Drucktemperatur von 25 °C ein stabiler Druckprozess etabliert werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass eine solche Verarbeitung für Chondrozyten zytokompatibel ist. In der vorliegenden Arbeit gelang damit die Formulierung von Biopolymer-basierten Biotinten für das Inkjet-Bioprinting mit lebenden Säugerzellen. Diese Biotinten können zu Hydrogelen vernetzt werden, deren mechanische Eigenschaften verschiedenen nativen Geweben entsprechen. Die dargestellten Materialsysteme besitzen damit ein hohes Potenzial für den Aufbau funktionaler Gewebemodelle, wie zum Beispiel hyaliner Knorpel, mit biomimetischer Kompartimentierung und Mikrostruktur.Item Open Access Development of culture media for the construction of vascularized adipose tissue and vascularized 3D full-skin equivalents in vitro(2016) Huber, Birgit; Tovar, Günter (Prof. Dr.)Item Open Access Entwicklung von Verfahren zur enzymatischen Epoxidierung von Pflanzenölen und Fettsäurederivaten(2018) Haitz, Fabian; Hirth, Thomas (Prof. Dr. rer. nat.)Pflanzliche Öle werden in der chemischen Industrie häufig funktionalisiert, um in verschiedenen Anwendungsgebieten eingesetzt werden zu können. Eine interessante Funktionalisierung stellt die Epoxidierung der in verschiedenen Fettsäuren enthaltenen C=C-Doppelbindung dar. Die so erzeugten Pflanzenöl-basierten Epoxide können beispielsweise als Weichmacher in Kunststoffen, als Monomerbausteine zur Herstellung von Polymeren oder als Intermediate zur Herstellung von Schmierstoffen verwendet werden. Zur Epoxidierung von Pflanzenölen und daraus gewinnbaren Fettsäurederivaten können Enzyme eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 18 verschiedene freie Lipasen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Persäurebildung untersucht und die damit verbundene Epoxidierung am Beispiel von Ölsäure für neun ausgewählte Lipasen gezeigt. Dabei wurden fünf neue CalB-ähnliche Lipasen aus verschiedenen Pseudozyma sp. identifiziert und auf Aminosäureebene mit der Lipase B aus Pseudozyma antarctica (CalB) verglichen. Die Epoxidierung verschiedener Pflanzenöle und Pflanzenöl-basierter Derivate wurde unter Verwendung einer immobilisierten Lipase optimiert. Die Optimierung der enzymatischen Epoxidierung zweier nicht im Lebensmittelbereich eingesetzter Pflanzenöle, Drachenkopf- und Senföl, erfolgte mit Hilfe der statistischen Versuchsplanung. Als Einflussgrößen wurden die Enzym- und Lösemittelmenge, die Inkubationszeit und die Reaktionstemperatur variiert. Durch die Auswahl dieser beiden hinsichtlich ihrer Fettsäurezusammensetzung sehr unterschiedlichen Pflanzenöle konnte eine Prozessoptimierung unter Berücksichtigung der Substratcharakteristika erfolgen. Dabei wurden für beide Öle Epoxidausbeuten von über 90 % erzielt. Die in dieser Arbeit für zwei verschiedene Pflanzenöle optimierten Reaktionsparameter konnten erfolgreich auf die Umsetzung von 15 verschiedenen Pflanzenölen übertragen werden. Für alle Öle wurden Epoxidausbeuten von 70 bis über 95 % erreicht. Die unterschiedlichen enzymatisch hergestellten Pflanzenölepoxide wurden umfangreich hinsichtlich der Viskosität sowie des Schmelz- und Kristallisationsverhaltens charakterisiert. Dabei wurden die Ergebnisse erstmals in Bezug auf die Fettsäurezusammensetzung der Substrate diskutiert. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit erfolgreich die Epoxidierung verschiedener Fettsäurederivate gezeigt. Dabei wurden Fettsäuremethylester, verschiedene freie Fettsäuren, 9-Octadecen-1,18-dicarbonsäure und 9-Octadecen mit hohen Epoxidausbeuten umgesetzt. Die Skalierbarkeit der chemo-enzymatischen Epoxidierung wurde in dieser Arbeit erfolgreich am Beispiel der Umsetzung von Drachenkopföl bis in den 10 L-Maßstab gezeigt. Als geeignetes Maßstabsübertragungskriterium wurde der konstante volumenspezifische Leistungseintrag identifiziert. Im Zuge der Maßstabsübertragung wurde außerdem der Einfluss verschiedener Prozessparameter, wie des Lösemittel- und Dispersphasenanteils sowie der Rührerdrehzahl auf die im Reaktor erzielte Tropfengrößenverteilung beschrieben. Zur in-situ-Messung der Tropfengrößenverteilung wurde ein 3D-ORM-System eingesetzt. Die sich bei spezifischen Prozessbedingungen einstellende charakteristische Tropfengrößenverteilung wurde in Form des sogenannten Sauterdurchmessers d32 dargestellt und anschließend in Zusammenhang mit den jeweils erzielten Epoxidierungsraten diskutiert.Item Open Access Mikrostrukturierte Schichten aus biofunktionalisierten Nanopartikeln als dreidimensionale Affinitätsoberfläche zum Proteinnachweis auf Microarrays(2007) Borchers, Kirsten; Brunner, Herwig (Prof.)Nanopartikel mit einer Schale aus Proteinen stellen ein Material mit extrem großer, biofunktioneller Oberfläche dar. Dieser vielseitige Werkstoff wurde in der vorliegenden Arbeit einem breiten Anwendungsspektrum verfügbar gemacht. Kern-Schale-Nanopartikel aus einem anorganischen SiO2-Kern und einer organischen Schale aus funktionellen Silanen wurden verwendet, um daran als Fängerelemente Proteine mit spezifischen Bindeeigenschaften zu immobilisieren. Die Funktionalisierung der Partikeloberflächen konnte mit großer Flexibilität an verschiedene Anforderungen angepasst werden: Fänger-Moleküle konnten in zufälliger Orientierung kovalent oder auch gerichtet auf den Partikeloberflächen immobilisiert werden. Die biofunktionalisierten Nanopartikel wurden anschließend mittels lithografischer Techniken oder Kontakt-Druck-Verfahren in Form von mikrostrukturierten Schichten stabil auf aktivierten Glasoberflächen abgeschieden. Die partikelgebundenen Fänger-Proteine wurden stabilisiert, sodass ihre biologische Funktionalität innerhalb der trockenen Partikelschichten erhalten blieb. Auf diese Weise wurden dreidimensionale Affinitätsoberflächen im Microarrayformat erzeugt, die dauerhaft lagerfähig waren. Die hohe Bindekapazität der dreidimensionalen Microspots resultierte beim Nachweis von Proteinen in einem dynamischen Bereich, der fünf Größenordnungen überspannte. Nanopartikel-Microarrays waren sowohl mit Fluoreszenzdetektion kompatibel als auch mit MALDI-Massenspektrometrie (MALDI-MS), den Standard-Ausleseverfahren der modernen Molekularbiologie und der Proteomforschung. Die hohe Bindekapazität und große Fängerdichte machen Biochips aus Nanopartikel-Microspots besonders relevant für Anwendungen, die für den empfindlichen Nachweis eines Analyten möglichst viele der in der Probe vorhandenen Analytmoleküle auf die Sensor-Oberfläche aufkonzentrieren wollen. Der modulare Aufbau der Chips ermöglicht die Trennung von Kopplungschemie und Microstrukturierung, sodass für die Entwicklung von Hybrid-Tests unterschiedliche Fängerelemente maßgeschneidert auf einer Sensoroberfläche immobilisiert werden können.Item Open Access Characterization of Candida albicans genes involved in cell wall biogenesis and infection(2010) Zavrel, Martin; Herwig Brunner (Prof. Dr.)Candida albicans is a commensal organism living on skin and mucosal surfaces of humans and warm blooded animals. Its presence becomes a problem in immunocompromised patients where it may turn into an opportunistic pathogen. Candida colonizes various host niches including skin, gastrointestinal and the urogenital tract, which offer various environments in terms of pH and nutrient availability. The cell surface of the fungus is the site of direct interaction of Candida with the host, mediating environmental sensing, adhesion and also interaction with the host immune system. Since the cell wall is not present in humans its components are a prime target for drug development. One part of this work is focused on characterization of cell wall changes induced by deletion of genes efg1 and cph1. These genes encoding for transcription factors were previously described to be involved in many cellular functions including filamentation and pathogenicity. Deletion of efg1 affects mostly the glucan polysaccharide part of the fungal cell wall. In contact with macrophages and dendritic cells, deletion of efg1 itself or together with cph1 alters significantly the immunogenicity of the strains, while deletion of cph1 alone plays only a minor role. In order to reveal whether C. albicans is able to specifically respond to different host niches, transcriptional profiling was used in order to identify C. albicans genes differentially regulated during adhesion on polystyrene, vaginal and intestinal tissue models. The second part of this work is following up on the results of the transcriptional profiling. It is focused on functional characterization of several genes differentially regulated under the tested conditions and encoding for putative cell surface proteins. Among the genes characterized in detail are two encoding for predicted GPI-proteins, Pga7 and Pga23 and one for a protein secreted to the medium, Pra1. Functional studies of PGA7, PGA23 and PRA1 with regard to adhesion and invasion as well as cell wall structure and stability were performed using deletion and overexpression strains. These studies qualify Pga7, Pga23 and Pra1 as structural elements of the cell wall rather than adhesins. The proper function of Pra1 seems to be also in interaction with host components. Finally, a family of genes with one member induced during adhesion (AUF8 Adhesion Upregulated Factor 8) was analyzed. These genes were predicted to be localized in the plasma membrane, carrying four transmembrane domains. There are totally seven homologues in the C. albicans genome including AUF8, and of which six are located on chromosome 5 in a 10 kb gene-cluster. When heterologously expressed in S. cerevisiae, one of the proteins, Auf8GFP localizes to the plasma membrane. Deletion studies did not show any direct involvement of the AUF genes in the adhesion or invasion process. However, there are some indications about their importance during stationary phase of growth.