Universität Stuttgart

Zellfreie DNA (cfDNA) ist ein Biomolekül, das extrazellulär in verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Blut(-plasma) oder Urin gefunden werden kann. Sie ist Träger von Erbinformation und besitzt eine relativ kurze Halbwertszeit. Diese kurze Halbwertszeit ist nützlich, um die aktuelle cfDNA-Konzentration und damit den physiologischen Zustand spezifisch bestimmen zu können. Somit kann cfDNA als Biomarker für diagnostische Zwecke eingesetzt werden. Neben ihren biologisch vorteilhaften Eigenschaften kann sie außerdem über eine Blutentnahme minimal-invasiv in Form einer sogenannten Flüssigbiopsie entnommen werden und somit eine risikobehaftete Gewebebiopsie vermieden werden. Mithilfe von Next-Generation Sequencing (NGS) sollte cfDNA im Rahmen dieser kumulativ verfassten Doktorarbeit analysiert und in verschiedenen Anwendungsgebieten auf ihre Eignung als Biomarker untersucht werden. Die zugrundeliegenden Publikationen sind in Kapitel 7.2 beigelegt. Im ersten Teil dieser Dissertation wurden die Charakteristika von mikrobieller cfDNA (mcfDNA) in der Infektionsdiagnostik am Beispiel der Sepsis untersucht. In einem Mausmodell wurde unter definierten Bedingungen die zeitliche und räumliche Dynamik von mcfDNA während einer Sepsis nachverfolgt und daraus ein Workflow für die individuelle Charakterisierung des pathologischen Mikrobioms – im Folgenden Pathobiom – und seiner dynamischen Veränderungen entwickelt. Zunächst wurde das Darmmikrobiom von gesunden Mäusen als Reservoir für Sepsis-verursachende Erreger bestimmt. Das physiologische Darmmikrobiom veränderte sich rapide nach Induktion einer Sepsis: Schon nach 24 h bildete sich ein Pathobiom im Darm, das sehr individuell ausgeprägt war. Im nächsten Schritt wurde die räumliche Transition des Pathobioms aus dem Darm in andere Kompartimente wie das normalerweise sterile Peritoneum und den Blutkreislauf untersucht. Auch hier konnten starke Veränderungen bereits nach 24 h in Peritoneum und Blut detektiert und mit unterschiedlichen Methoden nachgewiesen werden: Die Befunde von klassischer Blutkultur und NGS deckten sich weitestgehend, wobei mit NGS zusätzlich deutlich mehr Spezies identifiziert werden konnten. Die Pathobiome unterschieden sich teilweise zwischen einzelnen Mäusen deutlich, es konnten aber im Vergleich zu humanen Proben deutliche Überlappungen mikrobieller Genera identifiziert werden, welche als hauptsächliche Erreger bei einer Sepsis auftreten. Schließlich wurde eine Formel entwickelt, mit deren Hilfe die absolute Erregerbelastung im Blut berechnet werden konnte. Für die Analyse reichten kleinste Blutmengen von nur 30 µl, was die serielle Probenentnahme in Mäusen erst ermöglichte. Folglich konnten einzelne Mäuse über einen Zeitraum von 72 h analysiert werden. Nach 24 h wurde die höchste mikrobielle Belastung festgestellt, es konnten aber auch dynamische Veränderungen innerhalb weniger Stunden festgestellt werden. So ließ sich in dieser Studie eine kurze Halbwertszeit für mcfDNA ableiten und diese DNA-Klasse damit als sensitiver und adäquater Marker für die Sepsisdiagnostik etabliert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit widmete sich der Charakterisierung epigenetischer Marker von humaner cfDNA für die Diagnostik von pankreatobiliären Krebsformen (PBC), wobei hier im Speziellen DNA-Methylierungsmuster (als Information innerhalb der cfDNA) als Biomarker im Fokus standen. Ziel war es, Regionen im Genom zu identifizieren, die zwischen PBC-Patienten und Kontrollgruppen in unterschiedlichem Maße methyliert waren. Aus diesen differenziell methylierten Regionen (DMRs) sollten ein Target-Panel gebildet werden, das basierend auf NGS von Patienten-cfDNA im hohen Durchsatz sensitive und spezifische Diagnostik ermöglichen sollte. Im ersten Schritt wurde methylierte cfDNA unspezifisch angereichert und mithilfe von NGS sequenziert. Die erhobenen Daten wurden mit drei unterschiedlichen bioinformatischen Methoden ausgewertet und DMRs damit bestimmt. Diese wurden zusammen mit bereits publizierten Regionen aus der Literatur sowie neu bestimmten Regionen aus Gebewebedatenbanken zu einem Sequenzierpanel zusammengefügt, welches für die zielgerichtete Methode Hybridization and Capture verwendet wurde. Zusätzliche klinisch erhobene Daten wie der in der Routine bereits etablierte Tumor-Proteinmarker CA19-9 wurden nur als ergänzende Information für das Panel herangezogen, da diese im Gegensatz zu den Sequenzierdaten in dieser Kohorte bisher keine zuverlässige Unterscheidung zwischen Patientengruppen erlaubten. Das Hybridization and Capture-Panel wurde schließlich für die Sequenzierung von je 15 PBC-, 15 Pankreatitis- sowie 15 Kontroll-Patienten verwendet. In Kombination mit den CA19-9-Werten der Patienten wurde ein Machine-Learning-Ansatz angewendet, um in der Identifizierungskohorte die 50 besten Markerpositionen zu identifizieren. Mit diesen konnte eine Sensitivität von 93%, eine Spezifität von 63% und eine Fläche unter der ROC-Kurve von 0,85 erreicht werden. Anschließend wurde eine Validierungskohorte bestehend aus je zehn Patienten aus der PBC-, Pankreatitis- und Kontrollgruppe sowie sieben IPMN-Patienten sequenziert. In dieser Kohorte wurde eine Sensitivität von 92%, eine Spezifität von 84% und eine Fläche unter der ROC-Kurve von 0,88 erzielt. Außerdem konnten die High-grade-IPMNs und PBC-Patienten gut von Low-grade-IPMNs, Pankreatitis und Kontrollen unterschieden werden. Somit konnten Patienten identifiziert werden, welche eine intensivere Behandlung bzw. eine Operation benötigten. Methylierte cfDNA birgt folglich großes diagnostisches Potenzial für Pankreaserkrankungen und zeigte in dieser Publikation sensitive Eigenschaften, die für eine große Anzahl an (Krebs-)Erkrankungen genutzt werden könnten. Im dritten und abschließenden Teil im Rahmen dieser Doktorarbeit war das Ziel, eine spezifische Klasse an kurzen cfDNA-Fragmenten aus Gesamt-cfDNA zu charakterisieren. Die Hypothese war, dass kurze cfDNA-Fragmente (20-60 bp) regulatorische Informationen im systemischen Kontext eines Individuums enthalten, welche in der Diagnostik als differenzielle Marker genutzt werden können. Hierfür wurde zunächst ein Verfahren zur Größenselektion von cfDNA etabliert, welches mithilfe von Gelelektrophorese die Anreicherung intakter doppelsträngiger kurzer DNA-Fragmente ermöglichte. Kurze cfDNA reicherte sich in spezifischen genomischen Positionen an, und zeigte schmale, definierte als auch breite Cluster-Peaks. Dabei zeichneten sich Cluster-Peaks meist durch die Nähe zu Transkriptionsstartpunkten (TSPs) oder Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBS) aus. Ein Vergleich zu regulärer cfDNA offenbarte, dass sie sich gegensätzlich verhielt: Die Anreicherung der einen cfDNA-Klasse bedeutete die Abreicherung der anderen zum Beispiel an offenem Chromatin, Nukleosom-freien Regionen oder TSPs. Kurze cfDNA schien somit kein Abbauprodukt der regulären cfDNA zu sein, sondern eher durch die Bindung von Transkriptionsfaktoren (nicht Nukleosomen wie bei regulärer cfDNA) vor dem Abbau von DNasen geschützt zu sein. Mithilfe der kurzen cfDNA konnte auch über Transkriptionsfaktormotiv-Anreicherung oder die Analyse bekannter Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBS) eine potenzielle Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren (TFs) detektiert werden. Dies deutete bereits auf den Bezug von kurzer cfDNA zu transkriptionellen Vorgängen hin. Darüber hinaus zeigte sich eine Abhängigkeit der Anreicherung von kurzer cfDNA in bestimmten Regionen von der epigenetischen und transkriptionellen Aktivität: Aktive Promotoren zeigten eine starke Anreicherung von kurzer cfDNA, wohingegen stark methylierte CpG-Inseln eine deutlich schwächere Anreicherung von kurzer cfDNA als wenig methylierte CpG-Inseln zeigten. Außerdem zeigten ergänzende RNA-Sequenzierungen die Anreicherung von kurzer cfDNA in Genen, die laut RNA-Analysen hoch exprimiert waren. Diese Beobachtungen erinnerten insgesamt an die Detektion von DNA-Footprints, bei denen die Bindung spezifischer DNA-Sequenzen an bestimmte Proteine durch den Schutz vor Abbau durch DNasen identifiziert wird. Folglich wurden die ableitbaren Transkriptionsfaktor-Footprints aus Flüssigbiopsien als Liquid Footprints bezeichnet. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die Sequenzierung von kurzer cfDNA die Detektion konditionsspezifischer TFBS in Flüssigbiopsien ermöglichte und die Unterscheidung vier klinischer Indikationen (PDAC, Kolorektalkrebs, Sepsis, Post-OP) möglich war. Dies unterstreicht die Möglichkeiten von Liquid Footprinting als explorative, unvoreingenommene Plattform zur Detektion diagnostischer Markerregionen für verschiedenste klinische Indikationen. Abschließend wurde ein kurzer Ausblick auf die Kombination von Methylierungsdaten und Transkriptionsfaktordaten gegeben. Es wurden beispielhaft zwei Regionen betrachtet, welche auf ein Zusammenspiel der beiden Datentypen und damit eine biologische Verknüpfung schließen lassen. Zukünftige Diagnostik könnte von der integrierten Analyse profitieren und das volle Potenzial der verschiedenen cfDNA-Klassen in Kombination ausschöpfen.

Next Generation Sequencings (NGS) ermöglicht immer kostengünstigere Sequenzanalysen von Nukleinsäuren, weshalb die Methode für die klinische Diagnostik und darüber hinaus sehr an Bedeutung gewonnen hat. Untersuchungen von Flüssigbiopsien, die meist nur gering konzentrierte Analyte, wie z.B. zellfreie DNA (cfDNA) beinhalten, können mittels NGS sensitiv analysiert werden. Eine regelmäßige Flüssigbiopsie Analyse könnte beispielsweise in der Therapiekontrolle von onkologischen Erkrankungen Anwendung finden. Da die Herstellung einer Sequenzierbibliothek aufgrund komplexer und vieler Arbeitsschritte sehr aufwendig ist, werden Automatisierungen angewendet. Diese Liquidhandler sind allerdings nur für große Probenumsätze ökonomisch sinnvoll. Für eine geringere Probenanzahl und zum örtlich-flexiblen Einsatz (Point-of-Care Tests) sind kleinere Automatisierungslösungen notwendig, wenn die Proben nicht manuell präpariert werden sollen. In dieser Arbeit wird ein bestehendes Lab-on-a-Chip (LoC) System (Vivalytic von Bosch Healthcare Solutions), das für molekularbiologische Untersuchungen eingesetzt wird, als Plattform für die Entwicklung einer automatisiert hergestellten Sequenzierbibliothek für die gegenwärtig am häufigsten genutzte und genauste NGS-Methode (Sequencing by Synthesis von Illumina) verwendet. Für das Proof-of-Concept wurde eine Multiplex-PCR entwickelt, welche krebstherapierelevante Mutationen einer cfDNA Referenzprobe anreichern kann. Dazu wurden sieben Mutationen betrachtet, welche mit der Wirksamkeit und Resistenzbildung von Therapeutika gegen nicht-kleinzelligen Lungenkrebs und kolorektalem Karzinom assoziiert sind. Zur Implementierung der Enzymschritte für die Herstellung der Sequenzierbibliothek wurden fluidische Abläufe für die LoC-Kartusche entwickelt und optimiert. Die Nukleinsäureaufreinigungen wurden mittels magnetischen Beads auf der bestehenden LoC-Kartusche integriert und erfolgreich getestet. Zudem wurde eine fluoreszenzbasierte Nukleinsäurequantifizierung auf der LoC-Kartusche etabliert. Zur Validierung der Qualität der hergestellten Sequenzierbibliothek wurden Referenz cfDNA-Proben mit unterschiedlichen Mutationsfrequenzen mit dem entwickelten LoC-Verfahren zur Sequenzierbibliotheksherstellung präpariert und nachfolgend sequenziert. Die Ergebnisse wurden mit manuell aufbereiteten Proben verglichen. Bis zu einer minimalen Probeneingangsmenge von 10 ng DNA konnte eine vergleichbare Detektionsrate der Mutationen zwischen manueller und automatisierter Probenvorbereitung festgestellt werden. Damit konnte erstmalig eine automatisierte Sequenzierbibliotheksherstellung mit gezielter Anreicherung, ligationsbasierter Adapteranbringung, magnetische Bead-Nukleinsäureaufreinigungen und Index-PCR auf der LoC-Kartusche erfolgreich umgesetzt werden.

Universität Stuttgart

Browse

Filters

Settings

Sort By

Results per page

Search Results