Universität Stuttgart
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Item Open Access Frosttoleranz bei Pflanzen - Fliehen, vermeiden oder einfach durchhalten!(2005) Heyer, Arnd G.Nur etwa ein Drittel der Fläche des Planeten Erde ist dauerhaft frostfrei: in den tropischen Regenwaldgebieten des Amazonasbeckens, in Kongo, an der afrikanischen Westküste, auf dem Indomalayischen Archipel, in einem kleinen Teil Australiens und auf den pazifischen Inseln in Äquatornähe fällt die Temperatur nie unter etwa 15 Grad. Der Temperaturunterschied zwischen Tag und Nacht ist hier größer als der zwischen Sommer und Winter. Fast die Hälfte aller Pflanzenarten – 115.000 von 250.000 bekannten Blütenpflanzen – kommen nur hier vor. Daraus lässt sich bereits ablesen, dass der Umgang mit niedrigen Temperaturen eine Herausforderung für lebende Organismen ist, der sich nicht jeder stellen mag. Andererseits locken die kälteren Gegenden mit einem großen Flächen- und Mineralstoffangebot – einer Ressource, die für Pflanzen äußerst attraktiv ist.Item Open Access Die Bedeutung der H-Untereinheit des Reaktionszentrums bei der Assemblierung des Lichtsammelkomplexes LH1 in Rhodospirillum rubrum(2005) Lupo, Domenico; Ghosh, Robin (Prof. Dr.)Das photosynthetische Bakterium Rhodospirillum rubrum gehört zur Familie der Nichtschwefelpurpurbakterien (Rhodospirillaceae). Es zeichnet sich durch seinen vielfältigen Stoffwechsel aus, darunter die Fähigkeit fakultativ photosynthetisch zu wachsen. Dabei vollzieht es eine sogenannte anaerobe, anoxygene Photosynthese; dazu dient der photosynthetische Apparat (PSA). Dieser PSA befindet sich in spezialisierten Membranen, die aus der inneren Membran des Bakteriums durch Einstülpung hervorgehen und intracytoplasmatische Membranen (ICM) genannt werden. Die Produktion der ICM unterliegt der Regulation durch ein Netzwerk verschiedener Komponenten, die hauptsächlich auf den Sauerstoffpartialdruck ansprechen. Sobald dieser unter den Schwellenwert von 1% sinkt werden sogar im Dunkeln ICM produziert. Die Hauptkomponente des PSA ist die photosyn-thetische Einheit (PSU). Sie besteht aus einem Lichtsammelkomplex LH1 und dem photo-synthetischen Reaktionszentrum RC. Der LH1 aus R. rubrum besteht aus 16 Heterodimeren, wobei jedes Heterodimere aus zwei kleinen Polypeptiden a und b aufgebaut ist, an die zwei Bakteriochlorophyllmoleküle und ein Carotinoid gebunden sind. Die LH1 bilden, wie Strukturanalysen aus R. rubrum bei mittlerer Auflösung ergaben, eine geschlossene Struktur um das RC aus. Vom RC aus R. rubrum gibt es keine Strukturdaten, aber es sind Strukturen aus verwandten Arten vorhanden, die durch Röntgenbeugungsanalysen an RC-Kristallen erhalten worden waren. Diese RC-Strukturen zeigen alle den gleichen Aufbau: Sie bestehen, wie schon früher biochemisch festgestellt, aus drei Untereinheiten (H, M und L). Die Konfor-mation der Heterotrimeren ist identisch und bestätigt frühere Untersuchungen, dass nur die M- und die L-Untereinheit die photosynthetisch relevanten Cofaktoren binden: Vier Bakterio-chlorophyllmoleküle, zwei Bakteriophaeophytine, ein Carotinoid, zwei Ubichinonmoleküle und ein Eisenatom. Die Funktion der H-Untereinheit dagegen wurde später durch biochemische, molekularbiologische und strukturbiologische Methoden näher charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten für die H-Untereinheit eine wichtige Rolle beim Zusammenbau des RC bzw. der PSU, sowie eine Beteiligung am Primärprozess der Photosynthese: Das Fehlen der H-Untereinheit äußerte sich in der Abwesenheit funktioneller RCs, der Unfähigkeit zur Photosynthese und drastisch verminderten LH1- und ICM-Mengen. Dabei waren aber in einigen Studien, darunter die an R. rubrum, nicht nur das Gen für die H-Untereinheit (puhA) deletiert, sondern auch flankierende Gensequenzen entfernt worden. In neueren Arbeiten wurde der mehrteilige Aufbau der H-Untereinheit untersucht und den einzelnen Domänen Funktionen zugeordnet. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Projekte mit folgenden Zielsetzungen bearbeitet: – Die genauere Charakterisierung von H-Untereinheitsmutanten aus R. rubrum, die durch einen präzisen genetischen Eingriff hergestellt wurden, und deren Rückführung in den ursprünglichen Elternstatus, mit dem Ziel ein Deletions/Komplementations-system zu etablieren. – Darauf aufbauend sollten durch zielgerichteter Mutagenese an der H-Untereinheit Domänen definiert und deren Funktion untersucht werden. Das Ziel war die minimale Komponente der H-Untereinheit zu definieren, die in den oben genannten Mutanten den Elternstatus wiederherstellte. – Das Protokoll zur Isolierung und Aufreinigung der PSU aus R. rubrum sollte modifiziert und optimiert werden. Angestrebt war eine einfachere und kostengünstige-re Methode, um große Mengen an reiner PSU zu erhalten. – Die aufgereinigte PSU aus R. rubrum sollte biophysikalisch, biochemisch und strukturbiologisch untersucht werden, um die Geometrie des LH1 in der PSU zu klären, die Komponenten der isolierten PSU zu identifizieren und die PSU zu kristallisieren. Die genaue Charakterisierung der Mutanten der H-Untereinheit zeigte, dass die durch die Abwesenheit der H-Untereinheit verursachte Reduktion der LH1- und ICM-Mengen aufgehoben werden konnte. Erreicht wurde dies durch die Kultivierung der H-defizienten Stämme in Medien verschiedener Zusammensetzung. Das Deletions/Komplementations-system konnte etabliert werden, indem der ursprüngliche Elternstatus durch ein Plasmid wiederhergestellt wurde, welches das Gen für die H-Untereinheit besaß. Von diesem Plasmid ausgehend, konnte durch ein molekularbiologisches Design die H-Untereinheit erfolgreich in zwei Domänen getrennt werden. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die getrennten, aber gemeinsam exprimierten Domänen die Funktion eines intakten H-Proteins beibehalten und somit in der Lage waren, den ursprünglichen Elternstatus in H-defizienten Stämmen hervorzurufen. Durch den einzigartigen Befund, dass jede Domäne für sich, selbständig exprimiert, in der Lage war, RC-Komplexe zu bilden und photosynthetisches Wachstum zu ermöglichen, konnten gleich zwei verschiedene minimale Komponenten definiert werden. Die genetischen Konstrukte, sowie die erhaltenen Expressionsstämme stellen die Grundlage für zukünftige Projekte dar. In diesen soll eine Beteiligung der H-Untereinheit am Regulationsnetzwerk untersucht bzw. dessen Einfluss auf die Sauerstoffempfindlichkeit der generierten Stämme systembiologisch geklärt werden. Das alte Protokoll zur Isolierung und Aufreinigung der PSU aus R. rubrum konnte in seinem Ablauf deutlich vereinfacht werden. Durch die Wahl eines geeigneten Detergenz bzw. des Säulenmaterials für die Chromatographie wurde eine wesentliche Kosteneinsparung erreicht. Mit dem neuentwickelten Protokoll können bei gleicher Ansatzgröße, im Vergleich zum alten, zehnfach höhere Mengen an PSU isoliert werden. Das Absorptionsspektrum dieser PSU-Präparation entsprach dem unbehandelter ICM und die biochemische Analyse mittels Gelelektrophorese zeigte das gleiche Profil wie PSU-Präparationen nach dem alten Protokoll. Die in den PSU enthaltenen Proteine wurden durch Aminosäuresequenzierung mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert. Dabei handelt es sich um die erste Studie, in der Komponenten der isolierten PSU mit dieser Methode charakterisiert werden. Zusätzlich zu den Komponenten des RC und LH1 wurde ein Protein der äußeren Membran, Porin 41, in der PSU-Präparation gefunden, welches in intensiver Wechselwirkung mit der PSU steht. In zukünftigen Projekten soll geklärt werden, ob dieses Porin ein echter Bestandteil der PSU ist oder aber ein Reinigungsartefakt; wobei im ersten Fall natürlich die Frage nach der Funktion des Porins zu beantworten sein wird. Zur Klärung der Geometrie des LH1 in der PSU wurden Einzelmolekülspektroskopiemessungen durchgeführt und ergaben einen eindeutig zirkular-symmetrischen Aufbau des LH1 um das RC. Dieser Befund galt für detergenz-solubilisierte PSU, aber auch für PSU, die erstmals in Lipidvesikeln rekonstituiert worden waren. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu jenen anderer Arbeitsgruppen, die alle elliptisch deformierte LH1-Komplexe in ihren PSU-Präparationen fanden. Die zweidimensionale Kristallisation zur Aufklärung der PSU-Struktur wurde soweit optimiert, dass Kristalle in reproduzierbarer Qualität erhalten wurden. Deren Auflösung lag im mittleren Bereich und ist weiter zu verbessern. Auch die dreidimensionale Kristallisation der PSU kann nunmehr in Angriff genommen werden, da die benötigte Proteinmenge mit dem neuen Protokoll erreicht wird. Mit dem neuentwickelten Reinigungsverfahren konnte ein Protokoll etabliert werden, um PSU aus verschiedenen R. rubrum Stämmen routinemäßig zu isolieren. Diese können nicht nur bezüglich ihrer Zusammensetzung, Konformation oder Struktur untersucht, sondern auch zur Aufklärung des Energietransfermechanismus weiter analysiert werden.Item Open Access Screening, cloning and biochemical characterisation of novel esterases from bacillus sp. associated with the marine sponge aplysina aerophoba(2005) Karpushova, Anna Alexandrovna; Brümmer, Franz; Lange, Stefan; Schmid, Rolf D.Two novel esterases (EstB1 and EstB2) were isolated from a genomic library of Bacillus sp. associated with the marine sponge Aplysina aerophoba. EstB1 shows low identity (26-44 %)with the published hydrolases of the genus Bacillus, whereas EstB2 shows high identity (73-74 %) with the carboxylesterases from B. cereus and B. anthracis. Both esterases were efficiently expressed in Escherichia coli under the control of T7 promoter using the vector pET-22b(+). Recombinant EstB1 was purified in a single step to electrophoretic homogeneity by IMAC. A method for the refolding of inclusion bodies formed by the recombinant EstB2 was established to obtain active enzyme. Substrate specificity of the two enzymes towards pnitrophenyl and methyl esters and the respective kinetic parameters Km and Vmax were determined. The temperature optima of EstB1 and EstB2 were determined to be in the range of 30-50°C and 20-35°C, respectively. The pH optima were found to be in the range of 6.5-7.5 and 6.5-8.0, respectively. Both enzymes showed the highest stability in up to 50 % (v/v) DMSO followed by methanol, ethanol and 2-propanol. The influence of high NaCl and KCl concentrations was tested. The inhibition effect of 10-50 mM Zn2+ and 50 mM Mg2+ and Ca2+ ions was observed for both esterases. 1-5 mM PMSF deactivated the enzymes, whereas β-mercaptoethanol, DTT and EDTA had no effect on the enzymes activity.Item Open Access Ökologie und Phylogenie grönländischer Wolfsspinnen (Lycosidae, Araneae)(2005) Hammel, Jörg U.In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Ökologie und Phylogenie grönländischer Wolfsspinnen in Süd- und Mittelgrönland durchgeführt. Untersuchungen zur Populationszusammensetzung und Vegetations¬studien sollten neue Erkenntnisse zur Lebensweise und den bevorzugten Lebensräumen erbringen. Ein besseres Verständnis der Verwandtschaftsverhältnisse grönländischer Lycosiden sollten molekularphylogenetische Analysen liefern. Der Schwerpunkt der Untersuchungen bezieht sich auf das Gebiet um die Arktische Station auf der Insel Disko (69° 15,15´N 53° 31,03´W). Der Einsatz von Bodenfallen entlang eines Höhentransektes über 800 m Höhenmeter aus der Lyngmarksbucht hinauf zum Lyngmarksgletscher lieferte erstmals Daten zur Verteilung der Lycosiden in unterschiedlichen Höhenzonen. Die gewonnen Daten bestätigen das nördlichste bekannte Vorkommen einer Population von Pardosa hyperborea in Westgrönland. Mit Hilfe von Bodenfallen und Vegetationsanaylsen war es möglich eine Charakterisierung der Habitatpräferenzen der im Untersuchungsgebiet vorkommenden Lycosiden zu erhalten. Trockene und feuchte Heide sind auf Disko das bevorzugte Habitat von Arctosa insignita. P. furcifera bevorzugt geschützte Buchten mit feuchter Heide und Zwergsträuchern. Lebensräume mit mindestens 50% Vegetation, bestehend aus trockener Heidelandschaft, werden von P. glacialis besiedelt. P. groenlandica besetzt sowohl feuchte Habitate mit üppiger Vegetation, als auch karge Habitate wie Schutthänge oder Kiesstrände. Der einzige für P. hyperborea bekannte Fundort auf Disko kann als Zwergstrauchheide charakterisiert werden. Morphometrische Untersuchungen von 825 Lycosiden lieferten Informationen zur Populationszusammensetzung der Arten. Für die häufigste Art P. glacialis konnte auf dieser Basis eine Rekonstruktion des Lebenszyklus erstellt werden, die für den Untersuchungszeitraum einen zweijährigen Lebenszyklus für P. glacialis nahe legt. Dies stellt einen großen Unterschied zum ermittelten sechsjährigen Lebenszyklus von P. glacialis auf der Insel Ellesmer, Northwest Terretories, Kanada dar. Untersuchungen des Lebenszyklus an Modelarten in arktischen Ökosystem könnten für das Monitoring im Zusammenhang mit Studien zum Klimawandel eingesetzt werden, da Lycosiden sensibel auf veränderte Umweltfaktoren reagieren und einen bemerkenswert flexiblen Lebenszyklus aufweisen. Teile der 12S-rRNA von A. insignita, P. furcifera, P. glacialis, P. groenlandica und P. hyperborea wurden sequenziert und zusammen mit 30 publizierten Lycosiden 12S-Sequenzen und zwei Tetragnatha 12S-Sequenzen als Outgroup analysiert. Für P. furcifera und P. hyperborea ergaben sich Neugrup¬pierungen, die von der klassischen, morphologischen Einordnung abweichen. Die Tendenz der Entwicklung einer arktischen Lycosiden-Linie konnte gezeigt werden, muss aber durch weitere molekularphylogenetische Untersuchungen, die zusätzliche Arten aus den übrigen arktischen Gebieten wie Kanada, Alaska und Russland einschließen, geklärt werden.Item Open Access Photic and non-photic inputs to the suprachiasmatic nucleus of the rat: role of the serotonergic system(2005) Graff, Caroline; Wollnik, Franziska (Prof. Dr.)In mammals, circadian rhythms are controlled by a master clock localized in the suprachiasmatic nucleus (SCN) and entrained to 24 h by external cues. These signals are conveyed by three main afferences: the retinohypothalamic tract (RHT), the geniculohypothalamic tract (GHT) and the serotonergic tract. Photic factors during the night, leading to glutamate release from the RHT and c-Fos and clock gene expression in the SCN, induce phase shifts of the locomotor activity rhythm. Non-photic factors during the day generally induce phase advances of the locomotor activity rhythm and involve serotonin (5-HT) release from the serotonergic tract. Photic and non-photic factors can interact and modulate their respective effects. The purpose of my thesis is to better understand the mechanisms underlying these interactions. In the first part of this work, we have investigated the interaction between a photic factor and a non-photic factor on different circadian parameters in mice exposed to a light-dark cycle and fed daily with a diurnal hypocaloric diet (hypocaloric-fed mice). Compared to control animals fed ad libitum, the hypocaloric-fed mice showed phase changes of the locomotor activity, the melatonin secretion and the vasopressin expression rhythms and showed significant phase advances of two clock gene expression. There were also changes of light-induced phase shifts of the locomotor activity rhythm and light-induced clock gene expression in hypocaloric-fed mice. Thus, diurnal hypocaloric feeding is a non-photic factor able to modulate the synchronizing effects of light in the mouse. Lesion of serotonergic afferences to the SCN induces a marked reduction of the phase shifting effects of the diurnal hypocaloric feeding, implicating 5-HT in the neuronal mechanisms underlying these effects. In rats, 5-HT agonists are known to mimic the effect of light on various parameters of the SCN. We thus proposed that 5-HT could play a role in the functional interaction between photic and non-photic factors in the SCN and we thus studied the neuronal mechanisms mediating the photic-like shifting effects of 5-HT in the rat. In the second part of this work, we first tried to localize the 5-HT receptors implicated in these photic-like effects. As serotonergic agonists act directly in the SCN, these receptors can be either presynaptic or postsynaptic. To test the presynaptic hypothesis, we studied the phase shifting effects of a non-specific serotonergic agonist, the quipazine, in animals bearing lesions of either the serotonergic afferences, the GHT or the RHT. Our results implicate the RHT suggesting that the 5-HT receptors involved are localized on terminals of this tract. The possible serotonergic receptor subtype involved in these photic-like effects of 5-HT could be the 5-HT3 receptors since they have been shown in other brain structure to be localized on glutamatergic terminals and to induce glutamate release. Our results obtained with a specific 5-HT3 agonist and a specific 5-HT3 antagonist on several circadian parameters demonstrate the implication of the 5-HT3 receptor in the photic-like resetting effects of quipazine on the locomotor activity rhythm. However, another 5-HT receptor subtype seems to be involved in the induction of c-FOS expression by quipazine. In addition, we found that NMDA receptors, which are activated by glutamate release, participate in the phase advance of the locomotor activity rhythm and in the c-FOS expression in the SCN, induced by quipazine injection. Thus, the resetting effects of 5-HT in rats are mediated by presynaptic 5-HT3 receptors localized on the RHT terminals that trigger glutamate release, thus producing photic-like behavioral shifts.