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19991

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Institute: search.filters.UBSInstitut.Institut für Technische BiochemiePublication Type: search.filters.UBSTyp.DissertationStart date: 1999End date: 1999Author: search.filters.author.Minning, Stefan

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    ItemOpen Access
    Die Lipase aus Rhizopus oryzae: Klonierung, Expression, Reinigung und Mutagenese eines industriell relevanten Enzyms für die Biokatalyse und die Strukturbestimmung
    (1999) Minning, Stefan; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
    Die Lipase aus Rhizopus oryzae (ROL) konnte in der Vergangenheit in E. coli erfolgreich in Form inaktiver Einschlußverbindungen exprimiert werden. Um daraus die aktive Lipase zu erhalten, musste diese durch eine teure und aufwendige Rückfaltungsprozedur renaturiert werden. Da die Hefe Pichia pastoris dafür bekannt ist, heterologe Proteine mit großen Ausbeuten zu exprimieren wurde sie zur Produktion der reifen ROL, sowie diverser Mutanten verwendet. Die Expression unter Kontrolle des methanol-induzierbaren Alkoholoxidase Promotors (AOX1) ergab wesentlich höhere Ausbeuten wie unter dem konstitutiv exprimierenden Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase Promotor (GAP). Er stellte deshalb für weitere Arbeiten den Promotor der Wahl dar. Es folgten eine Reihe fermenatativer Studien in komplexem Vollmedium, wie auch in synthetischem Medium zur Erhöhung der Lipase Ausbeute. Dabei konnten sowohl der Sauerstoffeintrag, wie auch die Fütterungsrate als Schlüsselparameter bei der Ausbeute identifiziert werden. In einem optimierten Fermentationsprotokoll konnte die sechsfache Menge aktiver Lipase, verglichen mit Escherichia coli erreicht werden. Die Lipase aus den verschiedenen Kultivierungen in komplexem Medium konnte durch einen Konzentrierungs- und einen Chromatographieschritt bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Die ROL aus Pichia pastoris wurde biochemisch charakterisiert und die Eigenschaften mit denen der ROL aus Escherichia coli verglichen. Abgesehen von der erhöhten Thermostabilität der ROL aus P. pastoris verhielten sich die Enzyme aus beiden Expressionssystemen sehr ähnlich. Außerdem konnte eine Klasse von zufällig erzeugten Fusionspeptiden ausgehend von der Metallbindungsstelle der ATPase 439 von Helicobacter pylori zur Verwendung in der Metallafinitätschromatographie entwickelt werden. Durch High-Throughput Screening konnte ein Peptid identifiziert werden, welches gegenüber dem His-Tag verbesserte Eigenschaften aufwies.