Universität Stuttgart
Permanent URI for this communityhttps://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1
Browse
5 results
Search Results
Item Open Access Cloning, expression, characterization and engineering of cytochrome P450 CYP116B3 from Rhodococcus ruber DSM 44319(2007) Liu, Luo; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The Cytochrome P450 monooxygenases are ubiquitous heme-containing proteins, which catalyze regio- and stereo-selective oxidations of non-activated hydrocarbon. Bacterial P450 enzymes are in most cases not membrane-associated, water soluble and exhibit relatively high stability. Several bacterial strains have been tested for their monooxygenase activity. During the in vivo screening, Rhodoccocus ruber DSM 44319 and Rhodococcus erythropolis DSM 43066 strains exhibited oxidation activity towards cyclohexane. Because the genome DNA sequence of the two Rhodococcus strains has not been sequenced, a homology search was applied using known P450 gene sequences from other Rhodococcus strains. A set of degenerate primers was designed to the most similar regions, identified through the DNA sequence alignment of P450RhF from Rhodococcus sp. NCIMB 9784 and P450 CYP116 from Rhodococcus sp. NI86/21. A P450-like gene fragment with 740 base pairs was amplified from Rhodococcus ruber DSM 44319 by PCR using these degenerate primers. The flanking regions of the P450-like DNA fragment were explored by directional genome walking using PCR combined TA-cloning. The entire P450 gene with 2313 bp was isolated. It encodes a protein of 771 amino acids. The primary protein structure suggests that it is a natural self-sufficient fusion protein consisting of a P450 monooxygenase domain, a flavin-containing reductase domain, and a [2Fe2S] ferredoxin domain. This new P450 gene from Rhodococcus ruber DSM 44319 was named by P450 nomenclature committee CYP116B3 and can be considered as a new member of class IV of cytochrome P450 monooxygenases. The cytochrome P450 monooxygenase CYP116B3 was successfully cloned into vector pET28a(+), and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Subsequently, the enzyme was purified using immobilized metal affinity chromatography with a total yield of 18.6 mg l-1 and purity of 85%. Thin layer chromatography detected only FMN within the reductase domain, as the sequence alignment had predicted. The reductase activity was determined using an exogenous electron acceptor cytochrome c. The reductase domain of this P450 CYP116B3 demonstrated a strong preference for NADPH over NADH. As well as P450RhF, P450 CYP116B3 catalyzed O-dealkylation of 7-ethoxycoumarin gave product 7-hydroxycoumarin. Furthermore, in the presence of NADPH, the P450 CYP116B3 demonstrated hydroxylation activity towards aromatic hydrocarbons, naphthalene, indene, acenaphthene, toluene, fluorene, m-xylene and ethyl benzene. The conversion of naphthalene, acenaphthene and fluorene resulted in respective ring monohydroxylated metabolites. Alkyl aromatics like toluene, m-xylene and ethyl benzene were hydroxylated exclusively at the side chains. The highest turnover rate catalyzed by wild-type P450 CYP116B3 is about 1 nmol of 7-ethoxyxoumarin converted per 1 nmol of P450 CYP116B3 per minute. Compare to P450 BM-3, the activity of P450 CYP116B3 is very low. In order to investigate the structure-function relationship, a structure model of P450 CYP116B3 was designed based on the known homologous structures. The position 109 was identified which is located on the ceiling of the substrate binding pocket. The substitution of alanine residue at position 109 by phenylalanine may promote binding and oxidation of smaller alkyl substrates, such as cyclohexane or alpha-pinene. However after the substitution no oxidation activity towards smaller substrates was detected. Only an increase of activity towards 7-ethoxycoumarin and PAHs was observed. Directed evolution provides a useful tool to explore enzyme functions without structural information. Therefore, directed evolution was carried out in this study to improve the enzyme activity. The mutagenesis was limited to the monooxygenase domain of CYP116B3. A mutation library was generated by error-prone PCR. A high throughput screening system was developed based on the O-dealkylation of 7-ethoxycoumarin using whole E. coli cells, which expressed the enzyme in 96-well microtiter plates. Finally, the two best mutants, 70A08 (A86T/T91S/A109F/I179F/I267L) and 74H10 (T91S/A109L/I179F/I267L) were identified after four error-prone PCR rounds with 100-fold increased O-dealkylation activity towards 7-ethoxycoumarin. To investigate the alteration of the substrate spectrum of the two mutants, a wide rang of potential substrates was tested, including known substrates of the wild-type CYP116B3. However, 70A08 and 74H10 did not show increased activity towards any substrate besides 7-ethoxycoumarin.Item Open Access Computergestützte Untersuchungen zur Dynamik und Wasserbindung des omega-loops in TEM beta-Lactamasen(2007) Bös, Fabian; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Die Enzyme der TEM ß-Lactamasen stellen in gramnegativen Bakterien die Hauptursache für die Resistenz gegenüber ß-Lactam-Antibiotika dar. Der Omega-loop ist ein in allen Klasse A ß-Lactamasen konserviertes Strukturelement und positioniert eine für den Reaktionsmechanismus essentielle Aminosäure. Der Omega-loop ist durch eine Salzbrücke zwischen den Aminosäuren Arg164 und Asp179 in seiner Form fixiert. Der Grad seiner Flexibilität ist jedoch auf Grund teils widersprüchlicher Ergebnisse bisheriger Untersuchungen unklar. Da bekannt ist, dass Wasser einen großen Einfluss auf die Struktur, Funktion und Dynamik von Proteinen hat, wurde in dieser Arbeit mit computergestützten Methoden der Zusammenhang zwischen der Wasserbindung und der Dynamik des Omega-loops untersucht. Zudem wurde im Rahmen dieser Arbeit an der Automatisierung von multiplen molekulardynamischen Simulationen in Cluster- und Grid-Umgebungen sowie an neuen Methoden zur Analyse der Proteindynamik mitgearbeitet. Die Kristallwassermoleküle aus 49 hochaufgelösten Röntgenkristallstrukturen der ß-Lactamase-Familien TEM, SHV und CTX-M wurden einer Cluster-Analyse unterzogen, um Aussagen über konservierte Wassermoleküle in Klasse A ß-Lactamasen treffen zu können. Es wurden insgesamt 13 Wassermoleküle identifiziert, welche in mehr als 90% der 49 Strukturen konserviert waren; darunter auch zwei zu 100% konservierte Wassermoleküle. Sechs der insgesamt 13 konservierten Wassermoleküle waren am Omega-loop lokalisiert, drei weitere konservierte Wassermoleküle waren mit anderen loop-Elementen in der Proteinstruktur assoziiert. Die am Omega-loop lokalisierten Wassermoleküle befanden sich in einer Aushöhlung, welche der Omega-loop mit den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns formt. Diese konservierten Wassermoleküle ermöglichen die Ausbildung eines Wasserstoffbrückennetzwerks zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und denen des Proteinkerns und stabilisieren somit den Omega-loop. Um die Dynamik und Flexibilität des Omega-loops näher zu charakterisieren und den Einfluss der konservierten Wassermoleküle darauf zu untersuchen, wurden multiple molekulardynamische Simulationen der TEM ß-Lactamase in Wasser als explizitem Lösungsmittel durchgeführt. Es zeigte sich, dass die TEM ß-Lactamase ein hoch geordnetes und rigides Protein ist, dass nur in loop-Bereichen eine erhöhte Flexibilität aufweist. Während der Hauptteil des Omega-loops eine geringe Flexibilität aufweist, sind die Aminosäuren 173 bis 177 durch eine erhöhte Flexibilität gekennzeichnet. Dieses kurze Teilstück des Omega-loops zeigte eine deutliche Bewegung, die einem ¨Offnen und Schließen der Aushöhlung am Omega-loop entspricht. Durch die Kombination mehrerer Simulationen konnte auch gezeigt werden, dass die Ergebnisse früherer Arbeiten über die Flexibilität des Omega-loops keinesfalls im Widerspruch zueinander stehen, sondern jeweils nur unterschiedliche Teilschritte der Omega-loop Bewegung beschreiben, deren Gesamtdauer über die einer einzelnen Simulation hinausgeht. Für vier der sechs in der Kristallstrukturanalyse identifizierten konservierten Wassermoleküle konnte in den multiplen Simulationen reproduzierbar gezeigt werden, dass sie Wasserbrücken zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns ausbilden. Die Aminosäuren 173 bis 177 sind jedoch nicht an der Ausbildung dieser Wasserbrücken beteiligt, was ihre erhöhte Flexibilität erklärt. Die Durchführung multipler Simulationen stellt eine logistische Herausforderung in Bezug auf die Vorbereitung, Durchführung und Auswertung der zahlreichen Simulationen dar, die nur noch sehr schwer von Hand zu bewältigen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher in Zusammenarbeit mit dem Höchstleistungsrechenzentrum der Universität Stuttgart der gesamte Ablauf einer multiplen molekulardynamischen Simulation in ein System zur automatisierten Durchführung wissenschaftlicher Arbeitsabläufe implementiert und erfolgreich in einer Grid-Umgebung getestet. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Visualisierung und Interaktive Systeme der Universität Stuttgart wurde daher eine neuartige Methode zur haptischen Interaktion und Analyse von molekulardynamischen Simulationen entwickelt. Hierzu wurde ein haptisches Eingabegerät, dass Bewegungen in sechs Freiheitsgraden ermöglicht und über einen stiftähnlichen Griff bedient wird, mit einem Visualisierungsprogramm für molekulardynamische Simulationen gekoppelt. Dieser Ansatz ermöglicht durch das Zuweisen von Oberflächeneigenschaften an die betrachtete Proteinstruktur die Übermittlung zusätzliche Informationen. Zudem ist es möglich, über das haptische Eingabegerät direkt mit der Proteinstruktur zu interagieren und somit die Proteindynamik im Verlauf einer molekulardynamischen Simulation interaktiv und zeitabhängig zu analysieren.Item Open Access Biokatalyse mit Cytochrom P450 Monooxygenasen: zur selektiven Oxidation von Terpenen und Fettsäuren(2007) Budde, Michael; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Ziel dieser Arbeit war die selektive Oxyfunktionalisierung von alpha-Pinen sowie von hoch verzweigten Fettsäuren und Fettsäurederivaten zur Herstellung wertvoller Produkte und Synthesebausteine für die Riechstoff- und Pharmaindustrie. Die dabei verwendeten Biokatalysatoren CYP102A1 (P450 BM-3) aus Bacillus megaterium bzw. CYP102A2 und CYP102A3 aus Bacillus subtilis gehören zur Klasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen. Diese sind in der Lage, molekularen Sauerstoff unter Aufnahme zweier Elektronen zu aktivieren und ein Sauerstoffatom auf das Substratmolekül zu übertragen, wobei das andere Sauerstoffatom in Form von Wasser freigesetzt wird. Die hier untersuchten Enzyme der CYP102A-Familie nehmen aufgrund ihrer Domänenarchitektur eine Sonderstellung unter den Monooxygenasen ein. Es handelt sich bei ihnen um Fusionsproteine, die eine FAD/FMN-enthaltenden Reduktasedomäne und eine Monooxygenasedomäne in einer Polypeptidkette enthalten, was einen effizienten Elektronentransfer gewährleistet und somit für die höchsten mit P450 Monooxygenasen gemessenen Umsatzraten sorgt (>1500 min-1 gegen unverzweigte Fettsäuren). Darüber hinaus sind sie nicht membrangebunden und somit wasserlöslich sowie stabil, was sie zu interessanten Kandidaten für die Etablierung biotechnologischer Prozesse macht. Hoch verzweigte Fettsäuren und Fettsäurederivate konnten mit Hilfe von CYP102A1 und der Dreifachmutante CYP102A1 A74G F87V L188Q regioselektiv hydroxyliert und somit zu Synthesebausteinen für die Produktion von Makrolidantibiotika umgesetzt werden, die dabei erzielten Umsatzraten erreichen die für unverzweigte Fettsäuren gemessenen Größenordnungen. Durch Aufnahme von Substratbindungsspektren konnte geklärt werden, dass – entgegen der Erwartung – hoch verzweigte Substrate das aktive Zentrum von CYP102A2 und A3 nicht erreichen. Die oben beschriebene Dreifachmutante war in der Lage, (-)-alpha-Pinen mit hoher Regioselektivität in Pinenepoxid umzuwandeln (72%, CYP102A1 A74G F87V L188Q), darüber hinaus ist es durch Anwendung von rationalem und datenbasiertem Proteindesign gelungen Mutanten herzustellen, die (-)-alpha-Pinen ebenfalls mit hoher Selektivität zu Verbenol umsetzen. Bei der Entwicklung der Mutanten kamen Methoden wie Einfachsättigungsmutagenese oder ortsgerichtete Mutagenese zum Einsatz, wobei auch im Rahmen einer Kooperation durchgeführte molekulardynamische Simulationen zur Verbesserung der Regioselektivität von CYP102A1-Mutanten bei der Oxidation von (-)-alpha-Pinen beigetragen haben. Um die durch Mehrfachsättigungsmutagenese erzeugten Mutanten im Hochdurchsatzverfahren durchmustern zu können, wurden die dafür notwendigen Arbeitsschritte optimiert und weitgehend automatisiert. Zudem konnte ein produktspezifischer, hochdurchsatzfähiger Test entwickelt werden, der auf einer Farbreaktion zwischen Verbenol und schwefelsaurer Vanillinlösung beruht und die quantitative Bestimmung von Verbenolkonzentrationen >1 mM in Mikrotiterplatten erlaubt. Nach Durchmusterung einer 5000 Klone umfassenden Mutantenbibliothek konnte schließlich die hochselektive CYP102A1 Y51V A74G F87V A111T L188S Fünffachmutante isoliert werden, die (-)-alpha-Pinen mit einer Umsatzrate von 218 min-1 zu 88% Verbenol hydroxyliert, was eine weitere Verbesserung der Aktivität der zuvor identifizierten CYP102A1 A74G F87A L188Q (83 min-1) Dreifachmutante bedeutete. Eine weitere Charakterisierung der (-)-alpha-Pinen oxidierenden Mutanten erfolgte in 10 ml Ansätzen unter Verwendung eines auf Formiatdehydrogenase basierendem Kofaktorregenerierungssystems, was den quantitativen Einsatz des teuren Kofaktors NADPH überflüssig machte. Außerdem sorgte die Verwendung einer organischen Phase für eine in situ Produktabtrennung, was die Stabilität der gebildeten Produkte unter Prozessbedingungen erhöhte. Die hier im 10 ml Maßstab erzielten Raum-Zeit-Ausbeuten (bis zu 450 mg l-1 h-1) übertreffen die bisher bekannten Verfahren zur mikrobiellen bzw. enzymkatalysierten Oxidation von alpha-Pinen um Größenordnungen.Item Open Access DNA-Microarrays zur Identifizierung von pathoadaptiven Mutationen und Antibiotikaresistenzen in extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC)(2007) Barl, Timo; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von DNA-Microarrays zur Genotypisierung von E. coli für die klinische Diagnostik. Im ersten Teil der Dissertation wurde ein DNA-Microarray zur Detektion der häufigsten pathoadaptiven Mutationen in der Bindeuntereinheit von Typ 1-Fimbrien (FimH), die das Pathogenitätspotential von extraintestinal pathogenen Escherichia coli-Stämmen (ExPEC) erhöhen, entwickelt. Dieser Microarray wurde verwendet, um die fimH-Varianten von 131 E. coli-Isolaten zu genotypisieren. Sämtliche Ergebnisse wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die insgesamt 16 nachgewiesenen verschiedenen Mutationen traten grundsätzlich in Kombination mit der dominanten Mutation V27A auf. Zusätzlich konnten für die hauptsächlich kommensalischen Gruppe A-Stämme die Mutation A202V bzw. für die pathogenen Gruppe B2-Stämme N70S, S78N und R166H als spezifische Marker identifiziert werden. In einem zweiten Teil wurde der vorbeschriebene gyrA-Microarray (Yu et al. 2004) zur Detektion der Fluorchinolonresistenz in E. coli überarbeitet und anschließend mit dem fimH-Microarray in einen Array integriert. Dabei wurden Mutationen an den Aminosäure-Positionen 83 und 87 berücksichtigt, die den ersten Schritt einer stufenweisen Akkumulation von Mechanismen darstellen, die zu einer klinisch relevanten Resistenz führen. Mit dem integrierten Array zur simultanen Detektion der relevanten Mutationen in fimH und gyrA wurden 141 Isolate genotypisiert. Dabei wurde in insgesamt 30 Isolaten mindestens eine resistenzauslösende Mutation nachgewiesen. Bei allen betroffenen Isolaten handelte es sich dabei ausnahmslos um Isolate aus Harnwegsinfektionen. Unter anderem konnte die phänotypische Chinolonresistenz von sechs klinischen Isolaten jeweils auf eine gyrA-Doppelmutation zurückgeführt werden. Zusätzlich wurde gyrA 255C als eine weitere Gruppe A-spezifische Position identifiziert. Die in dieser Arbeit verwendete Technologie der allelspezifischen Hybridisierung erwies sich als äußerst robust und leistungsfähig. Allerdings ist ein grundsätzliches Merkmal der Methode, dass für die unterschiedlichen Sondensätze häufig verschiedene Diskriminierungen zwischen Perfect Match- und Mismatchsonden beobachtet werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass der Einsatz einer mismatchspezifischen Endonuklease (Surveyor Nuclease) zu einer verbesserten Auflösung insbesondere für cytosinhaltige Fehlpaarungen bei einem Oligonukleotidarray führt. Abschließend betrachtet wurden in dieser Arbeit eine Reihe grundlegender Ergebnisse über die allelspezifische Hybridisierung gewonnen: (1) Stille Mutationen in der Ziel-DNA sowie die Einbaurate des Fluoreszenzfarbstoffs hatten einen signifikanten Einfluss auf die absolute Signalintensität, waren jedoch für die Diskriminierung der Varianten unerheblich. (2) Mit einem 22 min dauernden PCR-Programm konnte ausreichend Ziel-DNA amplifiziert werden, um eine eindeutige Genotypisierung durchzuführen. Dies reduzierte die Gesamtdauer des Assays auf dreieinhalb Stunden nach der DNA-Extraktion. (3) Für die Genotypisierung waren 1000 Genomäquivalente als Eingangsmaterial für die PCR ausreichend. (4) Schließlich wurde gezeigt, dass eine Mischpopulation aus zwei fimH-Genotypen bis zu einem 50fachen Überschuss der einen Variante aufgelöst werden konnte.Item Open Access CYP102A P450 monooxygenases: comparative analysis and construction of cytochrome P450 chimera(2007) Eiben, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The members of the CYP102A subfamily are in several ways unique. They are natural fusion proteins of approximately 117-119 kDa comprised of the N terminal monooxygenase domain and a FAD and FMN containing diflavin reductase domain. These fatty acid hydroxylases exhibit extraordinary activities of 3000-10000 min-1 in comparison to other P450 monooxygenases making them promising candidates for industrial applications. Up to now, cloning and characterisation of only three members of this subfamily have been published: CYP102A1 from Bacillus megaterium and CYP102A2 and CYP102A3 from Bacillus subtilis strain 168. We have currently cloned and characterised another member of this family, CYP102A7, and there are at least eight more genes for CYP102A monooxygenases, which have been identified in several genome sequencing projects. Multiple sequence alignment of all amino acid sequences revealed that the similarity between different members is between 50 and 90 % according to which these enzymes can be divided into four groups. The four cloned enzymes belonging to three different groups but with 65 to 70 % similarity were used for further investigation. Despite their appearance to be similar, they often exhibit different properties. For example, the new isolated CYP102A7 catalyses the deethylation of 7-ethoxycoumarin which is not accepted as substrate by CYP102A1, CYP102A2 and CYP102A3. The hydroxylation patterns produced by these four monooxygenases are also different. Additionally we investigated solvent and thermal stability of these P450 monooxygenases. For example, the monooxygenase domain of CYP102A1 is much more stable than those of CYP102A2and CYP102A3. On the other hand, its reductase domain is less stable than the corresponding ones of CYP102A2 and CYP102A3. Therefore we exchanged the natural more unstable reductase domain of CYP102A1 with the more stable reductase domain of CYP102A3, using the natural linker of CYP102A1. The new chimera was able to hydroxylate substrates within a wider temperature range (up to 50°C) compared to the parental enzymes, showed higher process stability and has a half-life at 50°C more than ten times longer than CYP102A1. Further we substituted the reductase domain of CYP102A1 by a thermostable analogue. In the genome of the thermophilic Geobacillus stearothermophilus a gene was found exhibiting 50 % protein similarity to the reductase domain of CYP102A1. The gene encodes a hypothetical alpha-subunit of a sulfite reductase, but also belongs to the diflavin reductases. This reductase was cloned downstream of the monooxygenase domain of CYP102A1. Activity of the foreign reductase within the chimera A1GR was confirmed by cytochrome c reduction. Next to the ability to transfer electrons to the heme iron, oxidation of C14-C18 fatty acids was proven. While the hydroxylation activity of CYP102A1 towards myristic and palmitic acid decreased to about 5 % of the initial rate after incubation at 49°C, the chimera exhibited no loss of activity under the same conditions.