Universität Stuttgart
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Item Open Access Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access Isolierung des humanen Lactasegens und seine Expression in der Hefe Pichia pastoris(2002) Bethge, Rut; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) katalysiert bei der Verdauung die hydrolytische Spaltung des Milchzuckers Lactose in Glucose und Galactose. Dieses Enzym ist im Bürstensaum des Dünndarms der Säugetiere lokalisiert. Seine Aktivität wird nach dem Ende der Laktationsphase sehr stark gesenkt, bzw. die Synthese in Teilabschnitten des Darms eingestellt, was eine Lactoseintoleranz bei 75 % der Weltbevölkerung zur Folge hat. Eine Ausnahme stellen hierbei Nordeuropäer und einige afrikanische Völker mit traditionellem Konsum von Milch und Milchprodukten dar. Mit dem Lactosemetabolismus sind unter anderem die Stoffwechselkrankheiten Milchunverträglichkeit, die durch einen Defekt in der Lactase-Synthese zustandekommt, und Galactosämie, die auf dem genetischen Defekt der Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase (GALT) beruht, verbunden. Während die Symptome, Durchfall und Erbrechen, der Milchunverträglichkeit weniger schwerwiegend sind, führt der Verlauf von Galactosämie unbehandelt zu geistiger Zurückgebliebenheit und in vielen Fällen zum Tod. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Entwicklung denkbarer Behandlungsstrategien der Galaktosämie durchgeführt. Der Grundgedanke ist, die negativen Folgewirkungen der Galactosämie durch Hemmung des ersten Enzyms des Lactosemetabolismus, der LPH, unter Akzeptanz der Folgen einer Milchunverträglichkeit, zu unterbinden. Hierbei kamen unterschiedliche Glycosidaseinhibitoren zum Einsatz. Erstens wurde die humane Lactase-Phlorizin-Hydrolase in Pichia pastoris exprimiert und die Quantifizierbarkeit ihrer Lactaseaktivität in dem Test auf Disaccharidase-Aktivität nach Dahlqvist untersucht. Zweitens wurde die Anwendbarkeit des Testsystems zur Charakterisierung einer LPH-Hemmung im Allgemeinen, bzw. zur Suche nach neuen spezifischen LPH-Inhibitoren untersucht. Die LPH wurde aus menschlichen Dünndarmgewebeproben isoliert. Dazu wurde ihre Gesamt-RNA isoliert, die mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt wurde. Daraus konnten durch PCR sowohl die Lactase-, als auch die Phlorizin-Hydrolase-Domäne der LPH amplifiziert werden. Durch den Vergleich ihrer DNA-Sequenzen mit der 1988 von Mantei et al. veröffentlichten Sequenz der LPH ergaben sich in beiden Domänen jeweils 6 Basenabweichungen, von denen angenommen wurde, dass es sich dabei um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) handelt. Die Gesamt-LPH wurde durch Zusammenfügen der beiden Einzeldomänen mittels "Overlap-Extension" erhalten. Bei der Sequenzierung der Gesamt-LPH ergaben sich vor allem im hinteren Bereich, am 3'-Ende, Basenabweichungen, die in den ursprünglichen Einzeldomänen nicht vorhanden waren. Es muß demnach davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen Variationen nicht um SNPs sondern um Mutationen handelt. Sowohl die einzelnen Domänen, als auch die Gesamt-LPH wurden in dem eukaryotischen System der Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe des Testes auf Disaccharidaseaktivität nach Dahlqvist auf ihre Lactose-Hydrolyse-Aktivität untersucht. Das Verfahren wurde dabei auf eine Anwendung im Mikromaßstab modifiziert. Während die exprimierte Phlorizin-Hydrolase-Domäne alleine nur geringe Lactaseaktivität zeigte, konnte nach Expression der Lactase-Domäne, sowie der Gesamt-LPH deren hydrolytische Aktivität nachgewiesen werden. Die Lactaseaktivität konnte somit der Lactase-Domäne zugeordnet werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz aktiv. Die Expression in Pichia pastoris ermöglicht es demnach, die Aktivität von Varianten der LPH auf einfache Art und Weise zu testen. Zur Durchführung weiterer Experimente sollte ein mutationsfreies Gen hergestellt werden, um einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, und festzustellen, wie viele Polymorphismen das Gen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modifizierte Dahlqvist-Test eingesetzt, um Verbindungen auf ihre hemmende Wirkung auf die Lactase-Phlorizin-Hydrolase, bzw. ihre Einzeldomänen, zu prüfen. Mit Phlorizin, einem Lactasehemmer, konnte die Zuverlässigkeit des Tests bestätigt werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der Literatur für Inhibitionsversuche geeignet. Das Testsystem erlaubt somit die gezielte Durchmusterung synthetisch hergestellter Verbindungen auf deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Lactaseaktivität und die Untersuchung der Wirkungsweise von Inhibitoren auf verschiedene Varianten der LPH. Auch für einen von dem Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart synthetisch hergestellten ß-Glucosidase- und ß-Galactosidase-Inhibitor konnte eine Hemmung der Lactaseaktivität festgestellt werden. Eine weitere, gezielte Durchmusterung von Verbindungen mit Hilfe des etablierten Systems könnte somit zur Charakterisierung neuer Inhibitoren führen und alternative Ansätze zur therapeutischen Behandlung von Galaktosämie eröffnen.Item Open Access Die humane Acetylcholinesterase: Design und Synthese eines optimierten Gens und die Expression in Pichia pastoris(2002) Vorlová, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Ziel der Arbeit war die Etablierung eines Expressionssystems für die Herstellung funktioneller humaner Acetylcholinesterase. Aufgrund der bekannten negativen Erfahrungen mit anderen Expressionssystemen wurde als host Organismus P. pastoris gewählt. Um die Expression auf der Translationsebene weiter zu begünstigen wurde die Codon-usage des zu synthetisierenden Gens an die des Expressionsorganismus angepasst. Das synthetische Gen wurde für die Expression in P. pastoris in die Vektoren pPICZαA und pGAPZαA kloniert, die sich durch ihre Promotoren, den Methanol-induzierbaren AOX1-Promotor und den konstitutiven GAP-Promotor, unterscheiden. Zur schnellen Identifizierung von Transformanden, die das Gen in aktiver Form exprimieren wurde ein Agarplattenassay entwickelt. Zur weiteren Optimierung der Ausbeuten wurden der Einfluss verschiedener Medien, Fütterungsstrategien und Kultivierungsfaktoren wie des pHs des umgebenden Mediums untersucht. Unter den so erreichten optimierten Bedingungen konnte in Schüttelkolbenkulturen eine Expression von bis zu 10000 U/l erzielt werden. Ein Großteil dieser Ergebnisse konnten für die Optimierung einer Fermentation übernommen werden, in der schließlich entsprechende Expressionsraten erzielt wurden. In einen weiteren Schritt wurde der Einfluss der veränderten Nucleotidsequenz auf die Expression in P. pastoris und in COS-Zellen untersucht. Während in den Säugerzellen eine deutliche Abhängigkeit der Expression von der verwendeten Nucleotidsequenz festgestellt wurde, konnten in P. pastoris mit drei unterschiedlichen Genkonstrukten, die alle für die humane Acetylcholinesterase kodierten, keine unterschiedlichen Mengen an exprimiertem Protein festgestellt werden. Mit der Synthese einer optimierten Gensequenz, der Wahl von P. pastoris als Wirtsorganismus und der Etablierung eines Affinitätsaufreinigungs-Protokolls konnte ein effizientes Expressionssystem zur Produktion hochreiner humaner Acetylcholinesterase etabliert werden.Item Open Access Cloning, expression, purification and characterization of a novel cytochrome P450 isolated from Thermus thermophilus HB27(2002) Blasco, Francesca; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Enzymes produced by extremophiles are of considerable biotechnological interest. They show activity and stability at extreme temperatures, low water activity and high hydrostatic pressure. The growing knowledge about "thermozymes" from thermophilic organisms obtained during the recent years and the importance of P450 monooxygenases as potential biocatalysts for industrial applications has created high interest in P450 enzymes from thermophilic bacteria and archaea. Although the homology between P450s is generally low, a few domains and sequence signatures are conserved and can be identified by homology searches. Following this approach a homology search of recently sequenced genomes from thermophiles was performed to identify novel P450 enzymes of this origin. Indeed, a region showing homology to a known bacterial P450 (P450 BM3 from Bacillus megaterium) was found within the Thermus thermophilus HB27 genome, currently being sequenced in Göttingen. Thermus thermophilus is a non-sporulating Gram-negative bacterium isolated from hot springs. Its genome of 1.82 Mbp (excluding the mega-plasmid pTT27 of 0.24 Mbp) has a GC-content of approximately 69 %. The optimal temperature for growth is between 65 and 72 °C, the maximum being 85 °C and the minimum being 47 °C. Bulk protein extracted from this thermophile is much more stable to heat than mesophilic protein extracts; and only about 10 % of the total protein is denatured by heating up to 110 °C for 5 min. Cytochrome P450 proteins, named for the absorption band at 450 nm of their carbon monoxide bound form, are a large superfamily of enzymes. P450s are ubiquitous enzymes essential for steroid biosynthesis, catabolism of drugs, utilization of carbon compounds as an energy source in bacteria, and in the production of various macrolide antibiotics. Sequence identity among P450s is often low (normally less than 20 %), but the structural fold has been conserved during evolution. P450s are heme thiolate proteins; the most conserved structural feature is a cysteine as fifth ligand to the heme iron. Normally P450s use electrons from NAD(P)H to catalyze activation of molecular oxygen, leading to regiospecific and stereospecific oxidative attack (often hydroxylation) of non-activated hydrocarbons at physiological temperatures. The substrates of P450s are extremely diverse. They are involved in the biosynthesis of hormones or antibiotics, as well as carcinogenesis and degradation of xenobiotics. The selective oxidation of an unactivated C-H bond in a complex organic molecule to the alcohol functionality (C-OH) has wide applications in chemical synthesis. The present work reports cloning, expression, purification, crystallization and characterization of CYP175A1, a cytochrome P450 from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB27. For over expression the gene was amplified by PCR in the presence of specific primers from a DNA fragment kindly provided by Prof. H. J. Fritz (University of Göttingen). The PCR product was ligated into the polylinker region of pKK223-3 for expression under control of the tac promoter. The resulting clone was transformed in E. coli BL21(DE3)RP CodonPlus and selected for ampicillin and chloroamphenicol resistance. Expression was induced by IPTG and a yield of approx. 40 mg protein/liter culture was obtained. After cell disruption and ammonium sulfate precipitation P450_Tth was purified to homogeneity, following two different purification protocols. The fractions corresponding to the highest purity were used for crystallization, while the others were used for further biochemical characterization. The 44 kDa protein is soluble and displays an absorption spectrum in the reduced, oxidized, and carbonyl adduct analogous to those of other P450 enzymes. This enzyme exhibits thermostability with a melting temperature 30 °C higher than that of P450cam from P. putida. The crystal structure of CYP175A1 has been determined in co-operation with T. Poulos (University of California, Irvine). CYP175A1 exhibits the typical prism like P450-fold composed of 17 a-helices and 11 b-strands, corresponding to four beta sheets. The location of CYP175A1 in the T. thermophilus genome (close to crtB encoding a phytoene synthase), and the fact that genes for carotenoid biosynthesis occur as a cluster in T. thermophilus as well as in other carotenoid-producing strains, suggested that the gene may be involved in carotenoid biosynthesis. Heterologous complementation using Escherichia coli strains genetically enginereed to produce b-carotene indicated that CYP175A1 was able to catalyze the conversion of b-carotene to zeaxanthin via cryptoxanthin. The model of the b-carotene-CYP175A1 complex was generated. The hydrophobic nature of the ligand fitted well into the binding site of CYP175A1 which contained mostly hydrophobic or neutral residues. The position of the ligand in the active site of the enzyme showed that the C-3 of the b-ionone ring is the closest atom to the heme iron confirming the experimentally observed regioselectivity.Item Open Access Regioselectivity of CYP2B6 : homology modelling, molecular dynamics simulation, docking(2002) Bathelt, Christine; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenHuman cytochrome P450 (CYP) 2B6 activates the anticancer prodrug cyclophosphamide (CPA) by 4-hydroxylation. In contrast, the same enzyme catalyzes N-deethylation of a structural isomer, the prodrug ifos-famide (IFA) thus causing severe adverse drug effects. To model the molecular interactions leading to a switch in regioselectivity, the structure of CYP2B6 was modelled based on the structure of rabbit CYP2C5. We mod-elled the lacking 22 residue loop in CYP2C5 between helix F and G (F-G loop) which is not resolved in the X-ray structure by molecular dynamics (MD) simulations using a simulated annealing protocol. The modelled conformation of the loop was validated by unconstrained MD simulations of the complete enzymes (CYP2C5 and CYP2B6) in water for 70 and 120 ps, respectively. The simulations were stable and led to a backbone r.m.s. deviation of 1.7 Å between the two CYPs. The shape of the substrate binding site of CYP2B6 was further analyzed. It consists of three well-defined hydro-phobic binding pockets adjacent to the catalytic heme. Size, shape and hydrophobicity of these pockets was compared to the shapes of the two structurally isomeric substrates. In their preferred orientation in the binding site both substrates fill all three binding pockets without repulsive interactions. The distance to the heme iron is short enough for 4-hydroxylation and N-deethylation to occur for CPA and IFA, respectively. However, if the substrates are docked in the non-preferred orientation (such that 4-hydroxylation and N-deethylation would occur for IFA and CPA, respectively), one pocket is left empty, and clashes were observed between the substrates.Item Open Access Development, validation, and application of an acetylcholinesterase-biosensor test for the direct detection of insecticide residues in infant food(2002) Schulze, Holger; Scherbaum, Ellen; Anastassiades, Michelangelo; Vorlová, Sandra; Schmid, Rolf D.; Bachmann, Till T.A highly sensitive and rapid food-screening test based on disposable screen-printed biosensors was developed, which is suitable for monitoring infant food. The exposure of infants and children to neurotoxic organophosphates and carbamates is of particular concern because of their higher susceptibility to adverse effects. The European Union has therefore set a very low limit for pesticides in infant food which must not contain concentrations exceeding 10 μg/kg for any given pesticide. The maximum residue limit (MRL) has been set to be near the determination threshold that is typically achieved for pesticides with traditional analytical methods. The biosensor method could detect levels lower than 5 μg/kg and thus clearly fulfills the demands of the EU. To substantiate these measurements, recovery rates were determined and amounted on average to 104 % in food. Matrix effects were eliminated by the introduction of a special electrode treatment. The test was compared with two traditional pesticide multiresidue analysis methods (GC/MS, LC/MS) using 26 fruit and vegetable samples from local markets and 23 samples of processed infant food from Germany, Spain, Poland and the USA. Three infant food samples exceeded the MRL of 10 μg/kg when analyzed by either biosensor test or multiresidue methods.Item Open Access A model of the pressure dependence of the enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards (±)-menthol(2002) Kahlow, Ulrich; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)Transesterification of (±)-menthol using propionic acid anhydride and Candida rugosa lipase was performed in chloroform and water at different pressures 1,10,50,and 100 bar) to study the pressure dependence of enantioselectivity E. As a result,E significantly decreased with increasing pressure from E = 55 (1 bar) to E = 47 (10 bar), E = 37 (50 bar), and E = 9 (100 bar). To rationalize the experimental findings, molecular dynamics simulations of Candida rugosa lipase were carried out. Analyzing the lipase geometry at 1,10, 50,and 100 bar revealed a cavity in the Candida rugosa lipase. The cavity leads from a position on the surface distinct from the substrate binding site to the core towards the active site,and is limited by F415 and the catalytic H449. In the crystal structure of the Candida rugosa lipase,this cavity is filled with six water molecules. The number of water molecules in this cavity gradually increased with increasing pressure:six molecules in the simulation at 1 bar,10 molecules at 10 bar,12 molecules at 50 bar,and 13 molecules at 100 bar. Likewise,the volume of the cavity progressively increased from about 1864 Å 3 in the simulation at 1 bar to 2529 Å 3 at 10 bar,2526 Å 3 at 50 bar,and 2617 Å 3 at 100 bar. At 100 bar,one water molecule slipped between F415 and H449, displacing the catalytic histidine side chain and thus opening the cavity to form a continuous water channel. The rotation of the side chain leads to a decreased distance between the H449-N and the (+)-menthyl-oxygen (nonpreferred enantiomer) in the acyl enzyme intermediate,a factor determining the enantioselectivity of the lipase. Although the geometry of the preferred enantiomer is similar in all simulations,the geometry of the nonpreferred enantiomer gets gradually more reactive. This observation correlates with the gradually decreasing enantioselectivity E.Item Open Access Etablierung von neuen Methoden zur Herstellung rekombinanter Antikörper und zur spezifischen Selektion von Antikörpervarianten im hohen Durchsatz(2002) Lange, Stefan; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst rekombinante herbizidspezifische Antikörperfragmente (single chain Fragmente und Fab Fragmente) in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris produziert. Dies gelang jeweils durch genomische Integration der codierenden Gene. Im Fall des atrazinspezifischen Fabs K411B wurden hierfür mehrere Vektoren hergestellt, die jeweils die Gene beider Ketten als Fusion mit der a-Faktor-Signalsequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors enthielten. Somit konnten nach Transformation eines einzigen Vektors in Pichia beide Antikörperketten exprimiert und ins Medium sekretiert werden. Es zeigte sich, daß Klone mit beiden Genen unter Kontrolle des methanolinduzierbaren AOX1 Promotors größere Mengen Fab exprimierten, als solche mit den Antikörpergenen unter Kontrolle des konstitutiven GAPDH-Promotors. Durch fed-batch Kultivierung im 5l Bioreaktor konnten schließlich 40 mg l-1 Fab exprimiert werden. Wie sich durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte, bildeten ca. 30 % der schweren und leichten Ketten komplette Fab Fragmente. Auch im Falle des scFv K411B konnte mit Klonen, die das scFv-Gen als Fusion mit dem a-Faktor unter Kontrolle des AOX1-Promotors genomisch integriert trugen deutlich mehr exprimiert werden. Die Bindungseigenschaften des scFv und des Fab K411B wurden mit einem direkten, kompetitiven ELISA bestimmt: Wie erwartet zeigten beide Antikörperfragmente Testmittelpunkte von ca. 3 µg l-1. Dieser lag damit jedoch um ca. eine Größenordnung höher, als der mit dem parentalen monoklonalen Antikörper K4E7 gemessene Wert von ca. 0,2 µg l-1. Die Kreuzreaktivitäten der verschiedenen rekombinanten Antikörper stimmten jedoch nahezu mit denen des mAk überein. Die Entfernung mehrerer Restriktionsschnittstellen in dem für die Expression des Fab K411B hergestellten Expressionsvektor ermöglichte dessen Verwendung zur Herstellung von Fab Fragmenten beliebiger Spezifität durch einfachen Austausch der nun durch singuläre Schnittstellen begrenzten variablen Domänen. Dies wurde durch Expression eines 2,4-D-spezifischen Fabs validiert. Obwohl die exprimierte Menge deutlich geringer, als die des Fab K411B war, konnte mittels ELISA eine sigmoidale Bindungskurve zur Bestimmung von 2,4-D erstellt werden, aus der sich ein Testmittelpunkt von ca. 10 µg l-1 ergab. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neben dem ELISA weitere Methoden zur Messung der Bindungseigenschaften von Antikörpern etabliert und bezüglich ihrer Eignung zum Screening von Antikörperbibliotheken in hohem Durchsatz getestet: Zunächst wurde ein auf Fluoreszenzpolarisation beruhender homogener, kompetitiver Assay entwickelt. Mit einem Testmittelpunkt von ca. 90 µg l-1 bei der Bestimmung von Atrazin wäre für Anwendungen in der Umweltanalytik jedoch eine Optimierung hinsichtlich einer verbesserten Sensitivität notwendig. Aufgrund seiner im Vergleich zum ELISA sehr schnellen Durchführbarkeit, wäre der Einsatz als Schnelltest im mittleren Durchsatz geeignet und weniger für ein Screening im hohen Durchsatz, da die Ergebnisse im Vergleich zum ELISA weniger genau und reproduzierbar waren. Zum Screening von Antikörperbibliotheken und zur Selektion von Varianten mit bestimmten Bindungseigenschaften im hohen Durchsatz, wie es für evolutive Methoden erforderlich ist, wurde ein Hefeoberflächenexpressionssystem etabliert. Diese mit dem Phagen-Display verwandte Methode ist im Gegensatz zum ELISA und zum Fluoreszenzpolarisationstest vom Mikrotiterplattenformat unabhängig, da die Bestimmung der Bindungseigenschaften sowie die Selektion von Varianten mit dem Durchflußcytometer erfolgt: Durch Fusion der Gene der scFv's mit dem Gen einer Domäne des Agglutininrezeptors gelang nach Transformation des Fusionsgenes die Expression und Präsentation des daraus resultierenden funktionellen Fusionsproteins auf der Hefeoberfläche. Die damit erreichte Kopplung von Geno- und Phänotyp erlaubt durch Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antigenen und/oder Epitop-spezifischen Antikörpern und nachfolgender Analyse und Sortierung am Durchflußcytometer das Screening und die Selektion von Hefezellen, die Antikörper mit speziellen Bindungseigenschaften exprimieren. Die erfolgreiche funktionelle Expression der verschiedenen scFv's auf der Hefeoberfläche wurde durch Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Laserscanning-Mikroskopie sowie FACS-Messungen überprüft und bestätigt. Eine Vereinfachung der Screeningmethode wurde durch Expression des scFv-EGFP auf der Oberfläche der Zellen erreicht: Damit kann auf die für die Bestimmung der Oberflächenexpressionsmenge notwendige Markierung der scFv's mit Epitop-spezifischen fluorezenzmarkierten Antikörpern verzichtet werden, da die Fluoreszenz des EGFP-Anteils direkt mit der Menge des exprimierten Fusionsproteins korreliert.Item Open Access Activity of lipases and esterases towards tertiary alcohols : new insights into structure-function relationships(2002) Henke, Erik; Pleiss, Jürgen; Bornscheuer, Uwe TheoHydrolytic enzymes are versatile biocatalysts and find increasing applications in organic synthesis and a considerable number of industrial processes using these enzymes have been commercialized. Within this class, lipases (E.C. 3.1.1.3) and carboxyl esterases (E.C. 3.1.1.1) are frequently used as they accept a broad range of non-natural substrates, are usually very stable in organic solvents and exhibit good to excellent stereoselectivity.