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Item Open Access The Lipase Engineering Database – a navigation and analysis tool for protein families(2003) Fischer, Markus; Pleiss, JürgenThe Lipase Engineering Database (http://www.led.uni-stuttgart.de) integrates information on sequence, structure, and function of lipases, esterases, and related proteins. Sequence data on 806 protein entries are assigned to 38 homologous families, which are grouped into 16 superfamilies with no global sequence similarity between each other. For each family, multisequence alignments are provided with functionally relevant residues annotated. Pre-calculated phylogenetic trees allow navigation inside superfamilies. Experimental structures of 45 proteins are superposed and consistently annotated. The Lipase Engineering Database has been applied to systematically analyze sequence-structure-function relationships of this vast and diverse enzyme class. It is a useful tool to identify functionally relevant residues apart from the active site residues, and to design mutants with desired substrate specificity.Item Open Access Identification of factors impeding the production of a single-chain antibody fragment in Escherichia coli by comparing in vivo and in vitro expression(2003) Ölschläger, Peter; Lange, Stefan; Schmitt, Jutta; Siemann-Herzberg, Martin; Reuss, Matthias; Schmid, Rolf D.In order to produce the atrazine-specific scFv K411B, it was expressed in either the cytoplasm or the periplasm of Escherichia coli BL21(DE3). For periplasmic production, the scFv was N-terminally fused to the pelB leader, whereas the unfused variant resulted in cytoplasmic expression. The extent of protein accumulation differed significantly: The expression level of the scFv with leader was 2.3 times higher than that of the protein without leader. To further investigate this, the respective translation profiles were generated by coupled in vitro transcription/translation assays and gave according results. Periplasmic expression resulted in only 10% correctly folded scFv. The same percentage was obtained when the scFv was expressed in vitro, indicating that the oxidizing environment of the periplasm did not increase proper folding. Thus, the data obtained in vitro confirmed the findings observed in vivo and suggested that the discrepancy in expression levels was due to different translation efficiencies. However, the in vivo production of the scFv with EGFP fused C-terminally (scFv-EGFP) was only successful in the cytoplasm, although in vitro the expression with and without the leader rendered the same production profile. This indicated that neither the translation efficiency nor the solubility but other factors impeded periplasmic expression of the fusion protein.Item Open Access Systematische Analyse von Epoxidhydrolasen : Erstellung einer familienspezifischen Datenbank, Entwicklung einer strukturbezogenen Klassifizierung und Amplifikation unbekannter Epoxidhydrolasen(2003) Barth, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Laufe dieser Arbeit wurde eine systematische Analyse an 93 Epoxidhydrolase (EH) Sequenzen durchgeführt. Ein Vergleich der drei bekannten EH Strukturen aus Agrobacterium radiobacter, Mus musculus und Aspergillus niger zeigte die hohe Konservierung des a/b Hydrolase Folds und die Existenz zweier variabler Loop-Regionen, dem NC-und dem Cap-Loop. Aus dem Multisequenz-Alignment der 93 EHs wurden die Loop-Längen aller EHs bestimmt und in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen. Hierbei bildeten sich drei nach Superfamilien und Organismengruppen getrennte Cluster. Jedes Cluster enthält eine der drei bekannten Strukturen. Unter der Annahme, dass ähnliche Loop-Längen eine ähnliche Struktur bedingen, konnten Homologiemodelle von fünf EHs erstellt werden. Vergleiche der Substratspektren mit der Cluster Zugehörigkeit führten zu der Annahme, dass Loop-Länge und Substratspezifität korrelieren, da z.B. nur für EHs mit langen Cap-Loops der Umsatz epoxidierter Fettsäuren beschrieben wurde. Mit dem Programm CODEHOP wurden degenerierte familienspezifische Primer erstellt und an zwei bakteriellen Organismen getestet. Aus Streptomyces antibioticus Tü4, welcher eine EH Aktivität gegen Styroloxid aufweist und Rhodococcus ruber LU760 konnten jeweils Fragmente mit signifikanter Homologie zu EHs amplifiziert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befaßt sich mit der Erstellung und Auswertung einer familienspezifischen Datenbank auf der Grundlage der Lipase Engineering Database (LED). Die Epoxidhydrolase/Haloalkandehalogenase (EH/HD) Datenbank enthält 397 Sequenz-einträge, 305 Proteineinträge und für 19 dieser Proteineinträge 51 Strukturdatensätze. Neben EHs und HDs enthält die Datenbank weitere Enzymfamilien, die in 14 homologe Familien und zwei Superfamilien eingeteilt wurden. Untersuchungen der Strukturen aus EH/HD Datenbank und LED zeigten, dass trotz massiver struktureller Unterschiede, zwischen den Strukturen dieser beiden Datenbanken, das katalytische Zentrum strukturell in allen a/b Hydrolasen erhalten ist. Auch das für Lipasen ermittelte Anker-Konzept für die Stabilisierung des Oxyanionholes greift bei den Proteinen der EH/HD Datenbank. Für das hochkonservierte GXGXS-Motiv konnte eine mögliche strukturrelevante Funktion entwickelt werden, die seine konservierte Struktur und Lage erklärt.Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.Item Open Access Insight into the mechanism of the IMP-1 metallo-beta-lactamase by molecular dynamics simulations(2003) Ölschläger, Peter; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenTwo models, a purely nonbonded model and a cationic dummy atom approach, were examined for the modeling of the binuclear zinc-containing IMP-1 metallo-beta-lactamase in complex with a mercaptocarboxylate inhibitor. The cationic dummy atom approach had substantial advantages as it maintained the initial, experimentally determined geometry of the metal-containing active site during molecular dynamics simulations in water. The method was extended to the modeling of the free enzyme and the enzyme in complex with a cephalosporin substrate docked in an intermediate structure. For all three systems, the modeled complexes and the tetrahedral coordination of the zinc ions were stable. The average zinc-zinc distance increased by about 1 Å in the substrate complex compared to the inhibitor complex and the free enzyme in which a hydroxide ion acts as a bridging ligand. Thus, the zinc ions are predicted to undergo a back and forth movement upon the cycle of hydrolysis. In contrast to previous assumptions, no interaction of the Asn167 side chain with the bound cephalosporin substrate was observed. Our observations are in agreement with quantum-mechanical calculations and experimental data and indicate that the cationic dummy atom approach is useful to model zinc-containing metallo-beta-lactamases as free proteins, in complex with inhibitors and in complex with substrates.Item Open Access Entwicklung und Evaluierung von Assaysystemen zur Identifizierung des Substratspektrums von Epoxidhydrolasen, Aufreinigung und Charakterisierung einer Epoxidhydrolase aus Rhodococcus ruber DSM44319(2003) Doderer, Kai; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel der Arbeit war die Suche nach neuen Epoxidhydrolasen (EC 3.3.2.3), die in rekombinanter Form als Biokatalysatoren verwendet werden können. Die Suche nach neuen Epoxidhydrolaseaktivitäten kann auf zwei Wegen erfolgen. Datenbanken, wie z. B. "GenBank", können auf DNA oder Protein Ebene durch Sequenzvergleiche mit Programmen, wie z. B. BLAST nach Sequenzen durchsucht werden, die bekannten Epoxidhydrolasen ähnlich sind. Im umgekehrten Fall kann eine unbekannte, aus einem Organismus isolierte Sequenz mit anderen verglichen werden und so die putative Funktion bestimmt werden. Im ersten Teil der Arbeit wurden drei putative Epoxidhydrolasen aus B. subtilis, C. glutamicum und M. charantia, die durch Sequenzvergleiche identifiziert wurden, untersucht. Durch die Analyse der Proteinsequenz kann nicht auf die Substratspezifität rückgeschlossen werden, deshalb musste die Funktionalität mit mehreren Epoxiden getestet werden. Dafür wurden zwei Produktnachweise in Mikrotiterplatten für vicinale Diole entwickelt. Der PSS (Periodatspaltung und Färbung mit Schiffschem Reagenz) und PSC (Periodatspaltung und Detektion mit Carboxyfluorescein) Assay. Mit dem PSS-Assay wurden die Produkte einer Periodatspaltung mit Pararosanilin in einer Farbreaktion nachgewiesen. Der PSS-Assay erlaubt den direkten Nachweis der 1,2-Diole in wässriger Lösung in Gegenwart von Zelllysaten. Der PSS-Test wurde mit vier Substrat/Produkt Kombinationen validiert. In allen Fällen konnte ein Diolgehalt von mindestens 5 µmol/ml sicher detektiert werden. Die Standardfehler lagen unter 8%. Mit dem PSC-Assay wurde das nach der Spaltung verbliebene Periodat mit Carboxyfluorescein nachgewiesen. Der PSC-Assay wurde mit sieben verschiedenen Epoxiden und ihren korrespondierenden 1,2-Diolen validiert und es konnten Standardfehler von unter 4 % und ein Detektionslimit von <1 µmol/ml bestimmt werden. Somit ist der PSC Test zum Variantenscreening geeignet. Mit diesen beiden Assaysystemen wurden die drei obengenannten, rekombinant in E. coli produzierten, Epoxidhydrolasen untersucht. Dabei konnte keine Epoxidhydrolaseaktivität gegen alle getesteten Epoxide nachgewiesen werden. L(+)-Weinsäure wird in einem Maßstab von 30000 t/a bei Preisen von 5 €/kg vorwiegend aus Rückständen der Weinerzeugung hergestellt. Die sich daraus ergebenden starken jahreszeitlichen Schwankungen machen eine von Naturstoff unabhängigen Zugang zu L(+)-Weinsäure attraktiv. R. ruber DSM44319 ist in der Lage cis-2,3-Oxirandicarbonsäure zu L(+)-Weinsäure zu hydrolysieren. Das für die Hydrolyse von cis-2,3-Oxirandicarbonsäure verantwortliche Enzym wurde aus R. ruber DSM44319 durch eine mehrstufige Aufreinigung mit einem Reinigungsfaktor von rund 450 isoliert. Das aufgereinigte Protein wurde charakterisiert und die Teile der Proteinsequenz bestimmt. Mit diesen Fragmenten konnte bei einer Datenbanksuche in den US Patenten eine Hydrolase aus R. rhodochrous LMPG-18079 gefunden werden, die dieselbe Reaktion katalysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass die patentierte Protein- und DNA-Sequenz aus R. rhodochrous LMPG-18079 und R. ruber DSM44319 identisch sind. Proteinsequenzvergleiche zwischen der R. ruber Sequenz mit bekannten Epoxidhydrolasen zeigten keine Ähnlichkeit. Jedoch zeigt diese Sequenz eine hohe Ähnlichkeit mit vielen Halogencarbonsäure Dehalogenasen. Damit konnte gezeigt werden, dass die Hydrolase aufgrund ihrer Proteinsequenz als Halogencarbonsäure Dehalogenase (EC 3.8.1.5) einzustufen ist, obwohl sie in ihrer Funktionalität einer Epoxidhydrolase entspricht.Item Open Access Directed evolution of a bacterial alpha-amylase : towards enhanced pH-performance and higher specific activity(2003) Bessler, Cornelius; Schmitt, Jutta; Maurer, Karl-Heinz; Schmid, Rolf D.Alpha-Amylases, in particular, microbial Alpha-amylases are used widely in industrial processes such as starch liquefaction and pulp processes and more recently in detergency. Following the need for Alpha-amylases adapted to latter, we enhanced the alkali-activity of the Alpha-amylase from Bacillus amyloliquefaciens (BAA). The genes coding for the wild type BAA and the mutants BAA S201N and BAA N297D were subjected to error prone PCR and gene shuffling. For the screening of mutants we developed a novel, reliable assay suitable for high throughput screening based on the Phadebas® assay. One mutant (BAA 42) has an optimal activity at pH 7, corresponding to a shift of one pH unit compared to the wild type. BAA 42 is active over a broader pH-range than the wild type resulting in a fivefold higher activity at pH 10. In addition, the activity in periplasmic extracts and the specific activity increased 4 and 1.5 fold, respectively. Another mutant (BAA 29) possesses a wild type like pH-profile but reveals a 40-fold higher activity in periplasmic extracts and a nine fold higher specific activity. The comparison of the amino acid sequences of these two mutants with other homologous microbial Alpha-amylases revealed the mutation of the highly conserved residues W194R, S197P and A230V. In addition, three further mutations were found K406R, N414S and E356D, the latter being present in other bacterial Alpha-amylases.Item Open Access Entwicklung hochsensitiver Biosensoren für neurotoxische Insektizide in Lebensmitteln : enzymatische in-vitro Aktivierung von Phosphorthionaten mit der Monooxygenase P450-BM3 und Sensitivitätssteigerung durch Proteindesign von Acetylcholinesterase(2003) Schulze, Holger; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines sensitiven AChE-Biosensors für den quantitativ summarischen Nachweis neurotoxischer Organophosphate und Carbamate in Lebensmitteln und Säuglingsnahrung. Für die Untersuchung von Lebensmittelproben musste ein Verfahren entwickelt werden, welches unspezifische Matrixeinflüsse verhindert. Dies gelang durch Eingliederung einer Elektrodenbehandlung mit dem Tensid Tween 20 in das Testprotokoll. Dieser Schritt reduzierte die Probenvorbehandlung auf ein Minimum und lieferte ausgezeichnete Wiederfindungsraten von durchschnittlich 85% in den getesteten Lebensmittelproben. Der Biosensortest wurde mit Realproben vom Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Stuttgart erfolgreich validiert. Die Anwendbarkeit konnte im Rahmen einer gemeinsamen Studie mit dem CVUA Stuttgart gezeigt werden, in der Babybrei-Proben aus vier Ländern untersucht wurden. Hierbei wurden drei Überschreitungen des EU-Grenzwertes für Säuglingsnahrung festgestellt. Für Phosphorthionate konnte eine neuartige Aktivierungsmethode entwickelt werden. Phosphorthionate stellen den Hauptanteil der als Insektizide eingesetzten Organophosphate dar, sind in ihrer ursprünglichen Form dem AChE-Hemmtest aber nicht zugänglich. Die Dreifachmutante F87V, L188Q, A74G war im Gegensatz zum Wildtyp Cytochrom P450 BM-3 in der Lage, die Oxidation von Phosphorthionaten in die korrespondierenden starken AChE-Inhibitoren zu katalysieren. Die Analyse der Reaktionsprodukte mittels GC-MS/MS ergab eine quasi quantitative Umsetzung von Parathion und Chlorpyrifos zu Paraoxon bzw. Chlorpyrifos-oxon. Der indirekte Nachweis der enzymatisch aktivierten Phosphorthionate über die AChE-Hemmwirkung lieferte eine Transformationseffizienz von 85% für Parathion und 99% für Chlorpyrifos. Dieses Verfahren wurde erfolgreich in Lebensmittelproben getestet. Dies bedeutet eine deutliche Steigerung des Analytspektrums von AChE-Biosensoren. Die Sensitivität des AChE-Biosensors konnte durch Protein-Design von Nippostrongylus brasiliensis AChE gesteigert werden. Es wurden zehn Einfachmutanten und eine Mutante mit zusätzlicher Insertion von 26 Aminosäuren mittels ortsspezifischer Mutagenese hergestellt und in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die Ausbeute des Wildtyps konnte durch optimierte Kultivierungsbedingungen in einem 5L Fermenter auf 0,6 g/L gesteigert werden. Dieser Wert liegt deutlich über allen bislang erreichten Expressionsraten rekombinanter AChEn. Die AChE-Mutanten wurden im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber den 11 wichtigsten Organophosphaten und Carbamaten getestet. Die Mutation M301(288)A in der Acyltasche des aktiven Zentrums der AChE lieferte die insgesamt sensitivste Mutante. Gegenüber Omethoat ergab sich eine 108-fache Sensitivitätssteigerung. Die Sensitivität gegenüber Pirimiphos-methyl konnte ebenfalls um zwei Größenordungen gesteigert werden. Insgesamt konnte die Sensitivität gegen 10 von 11 getesteten Insektizide erhöht werden. Damit konnte das Ziel, Konzentrationen im Bereich des Pestizidgrenzwertes von Säuglingsnahrung von 10 µg/kg zu detektieren, für acht 8 der 11 getesteten Insektizide erreicht werden.Item Open Access Design of acetylcholinesterases for biosensor applications(2003) Schulze, Holger; Vorlová, Sandra; Villatte, Francois; Bachmann, Till T.; Schmid, Rolf D.In recent years, the use of acetylcholinesterases (AChEs) in biosensor technology has gained enormous attention, in particular with respect to insecticide detection. The principle of biosensors using AChE as a biological recognition element is based on the inhibition of the enzyme’s natural catalytic activity by the agent that is to be detected. The advanced understanding of the structure-function-relationship of AChEs serves as the basis for developing enzyme variants, which, compared to the wild type, show an increased inhibition efficiency at low insecticide concentrations and thus a higher sensitivity. This review describes different expression systems that have been used for the production of recombinant AChE. In addition, approaches to purify recombinant AChEs to a degree that is suitable for analytical applications will be elucidated as well as the various attempts that have been undertaken to increase the sensitivity of AChE to specified organophosphates and carbamates using side-directed mutagenesis and employing the enzyme in different assay formats.Item Open Access The molecular mechanism of enantiorecognition of tertiary alcohols by carboxylesterases(2003) Henke, Erik; Bornscheuer, Uwe Theo; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenCarboxylesterases containing the sequence motif GGGX catalyze hydrolysis of esters of chiral tertiary alcohols, albeit at only low to moderate enantioselectivity towards three model substrates (linalyl acetate, methyl-1-pentin-1-yl acetate, 2-phenyl-3-butin-2-yl acetate). In order to understand the molecular mechanism of enantiorecognition and to improve enantioselectivity towards this interesting substrate class, the interaction of both enantiomers with the substrate binding sites of acetylcholinesterases and p-nitrobenzyl esterase from Bacillus subtilis was modeled and correlated to experimental enantioselectivity. For all substrate-enzyme pairs, enantiopreference and ranking by enantioselectivity could be predicted by the model. In p-nitrobenzyl esterase, one of the key residues in determining enantioselectivity was G105: exchange of this residue by alanine led to a six-fold increase of enantioselectivity (E=19) towards 2-phenyl-3-butin-2-yl acetate. However, the effect of this mutation is personalized: towards the substrate linalyl acetate, the same mutant had a reversed enantiopreference. Thus, depending on the substrate structure, the same mutant had either increased enantioselectivity or opposite enantiopreference compared to wild type enzyme.