Universität Stuttgart
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Item Open Access Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.Item Open Access Molekulare Grundlagen der Stereoselektivität Lipase-katalysierter Umsetzungen(2001) Schulz, Tanja; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lipase aus Pseudomonas cepacia ist ein ausgezeichnetes Enzym in der kinetischen Racemattrennung sekundärer Alkohole. Die Stereopräferenz beruht ausschließlich auf der Substratstruktur der Enantiomere, während die Stereoselektivität auf atomaren Wechselwirkungen zwischen Substrat und Lipase beruht. 30 sekundäre Alkohole mit veröffentlichten E-Werten wurden gewählt. Modelle der Ester wurden kovalent in die Bindestelle der Lipase gebunden. Die beiden Enantiomere von 27 Substraten bevorzugten eine von zwei Bindungsmodi: das schnell-umgesetzte Enantiomer in einem produktiven, das langsam-umgesetzte Enantiomer in einem nicht-produktiven Bindungsmodus. Der produktive Bindungsmodus langsam-umgesetzter Enantiomere wird durch abstoßende Wechselwirkungen mit einer starren Wand nahe der Oxyanionen-Bindetasche gestört. Als Folge drückt das Substrat das aktive Histidin aus einer katalytisch effektiven Orientierung und der Abstand d(HNe-Oalc) zwischen Histidin und dem Alkohol-Sauerstoffatom nimmt zu. d(HNe-Oalc) korreliert mit experimentell ermittelten E-Werten: Substrate, die mit der Lipase aus P. cepacia mit hohen E-Werten umgesetzt werden (E > 100), weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) > 2.2 Å auf und eine effektive Katalyse des Enantiomers wird unterbunden. Substrate mit niederer Selektivität (E < 20) weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) < 2.0 Å auf. In diesem Fall werden beide Enantiomere mit ähnlichen Reaktionsraten umgesetzt. Eine vergleichbare Abhängigkeit des Abstands d(HNe-Oalc) und experimentell bestimmten E-Werten wurde für chirale Amine festgestellt. Der Abstand d(HNe-Oalc) ist auch ein entscheidender Parameter in Umsetzungen chiraler, sekundärer Alkohole mit zwei benachbarten Stereozentren mit der Lipase aus Candida rugosa. Die in silico Einführung von Punktmutationen in die Bindestelle der Lipase aus P. cepacia führte z.B. für die Einfachmutante Y29L zu einem verlängerten Abstand d(HNe-Oalc). Die erwartete Steigerung des E-Wertes konnte experimentell bestätigt werden.Item Open Access Biochemische Nachweisverfahren auf der Basis genetischer Regulationselemente: vom Reporterassay zum Repressor/DNA-Bindungstest(2000) Köhler, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)In der vorliegenden Arbeit wurde auf der Grundlage von genetischen Regulationselementen ein in vivo Assay und vergleichend hierzu ein in vitro Assay entwickelt. Ein rekombinanter E. coli Stamm wurde beim in vivo Reporterassay zur Detektion von 4-CBA verwendet, der bei Anwesenheit von 4-CBA Luziferase exprimiert. Durch Immobilisierung dieses Stammes konnte ein einfaches und spezifisches Testverfahren im Mikrotiterplattenformat entwickelt werden. Mit den optimierten Immobilisierungsbedingungen und der Verwendung einer Membranmutante von E. coli konnte ein Detektionslimit von 28 µM 4-CBA in 200 min erreicht werden. Zusätzlich wurde ein von den Eigenschaften der Zelle unabhängiges in vitro Assaysystem entwickelt. Da der Mechanismus der Tetrazyklinresistenz in Bakterien bekannt war, wurde Tetrazyklin als Analyt ausgewählt. Im neu zu entwickelnden Assay sollte der durch Tetrazyklin induzierte Abfall des Repressors von der Operator DNA zur quantitativen Bestimmung von Tetrazyklin benutzt werden. Dazu wurde der Tet Repressor mit N-terminal oder C-terminal fusioniertem Tag und nativ in E. coli überexprimiert. Die Funktionalität der Repressoren wurde im Gel-Mobility-Shift Assay untersucht. Nur der Repressor ohne Tag sowie der Repressor mit einem durch Proteaseverdau abgespaltenem Tag zeigten volle biologische Aktivität. Im Hinblick auf eine spätere Assay-Entwicklung wurde der Einfluß eines enzymatischen Markers auf die Repressor/Operator-DNA-Bindung mit derselben Methode getestet. Daraus folgte eine Versuchsdurchführung für den Mikrotiterplatten-Assay. Diese beeinhaltete die Immobilisierung des Repressors, die Bindung von Tetrazyklin an diesen und die Bindung POD markierter Operator-DNA an tetrazyklinfreie Repressoren. Die Bestimmung der POD Aktivität ließ Rückschlüsse auf die vorhandene Tetrazyklinkonzentration zu. Da dieses Assayformat mit sehr großen Standardabweichungen verbunden war, wurden markerfreie Oberflächenplasmonresonanzmessungen vorgenommen.Item Open Access Selektive Hydroxylierung von alpha- und beta-Ionon durch Streptomyces Stämme und molekulargenetische Arbeiten zur Identifizierung und Isolierung der Ionon-Hydroxylase aus Streptomyces fradiae Tü 27(1999) Lutz-Wahl, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit sollten α- bzw. β-Ionon durch selektive Hydroxylierung mittels Mikroorganismen zu 3-Hydroxyiononen umgesetzt werden, um einen Baustein für die chemisch-enzymatische Synthese von Astaxanthin und Zeaxanthin zu liefern. Über 200 Streptomyceten-Stämme wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, β- und/oder α-Ionon regio- und stereoselektiv zu den jeweiligen 3-Hydroxy-Derivaten umzusetzen. Mit β-Ionon als Substrat zeigten 19 Stämme Umsetzung zu 4-Hydroxy- und nicht zum gewünschten 3-Hydroxy-β-ionon. Unter diesen 19 Stämmen setzten sechs α-Ionon zu 3-Hydroxy-α-ionon um. S. fradiae Tü 27 zeigte mit 75 % die größte Umsatzrate. Aufgrund von GC- und NMR-Daten konnte gezeigt werden, daß die Hydroxylierung von racemischem α-Ionon [(6R)-(-) / (6S)-(+)] nur die Bildung der zwei Enantiomere (3R,6R)- und (3S,6S)-Hydroxy-α-ionon ergab. Die enzymatische Hydroxylierung von α-Ionon durch die getesteten Streptomyceten-Stämme findet sowohl mit einer hohen Regio- als auch mit einer hohen Stereoselektivität statt. Um die Gene, die für diese Hydroxylase kodieren, zu isolieren, wurden P450-Genfragmente aus S. fradiae Tü 27 amplifiziert und sequenziert. Hier konnten zwei P450 Genfragmente identifiziert werden. Die Isolierung der vollständigen P450-homologen Gene mit unterschiedlichen Methoden gelang jedoch nicht. Um nun eine Aussage darüber treffen zu können, ob eines der beiden P450-Genfragmente aus dem Stamm Streptomyces fradiae Tü 27 die Hydroxylase kodiert, die die selektive Hydroxylierung des α-Ionons katalysiert, wurden die P450 homologen Gene durch Integrationsmutagenese inaktiviert. Die Mutanten wurden für die Umsetzung von α-Ionon eingesetzt. Während mit der Integrationsmutante GMP450-27Q eine Umsetzung zu 3-Hydroxy-α-ionon stattfand, allerdings mit Nebenprodukt, konnte mit GMP450-27P keine selektive Hydroxylierung zu 3-Hydroxy-α-ionon nachgewiesen werden. Somit scheint P450-27P für die selektive Hydroxylierung von α-Ionon verantwortlich zu sein.Item Open Access Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology(2005) Grimm, Verena Ulrike; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals. In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.Item Open Access Biosynthese von Carotinoiden mittels rekombinanten Mikroorganismen(2010) Beuttler, Holger; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Diese Arbeit entstand aus einem gemeinsamen Projekt des Instituts für technische Biochemie (ITB) und des Instituts für Industrielle Genetik (IIG) an der Universität Stuttgart. Während das Institut für Industrielle Genetik für die molekularbiologischen Arbeiten zuständig war, oblagen dem Institut für Technische Biochemie, die Kultivierung und die Analytik. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Synthese von Carotinoiden in rekombinanten Pseudomonas putida KT2440 mit Zeaxanthin als Modellprodukt untersucht werden. Insbesondere sollten limitierende Schritte bei der Biosynthese identifiziert werden. Die Synthese der Carotinoide erfolgt dabei aus der zugefütterten Kohlenstoffquelle, meist Glucose. Aus dieser werden in mehreren Schritten die Vorstufen des Isoprens, das Isopentenylpyrophosphat (IPP) und das Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) gebildet. Aus den beiden Vorstufen wird im bakteriellen Isoprenkatabolismus nun über die Zwischenstufen Geranylpyrophosphat und Farnesylpyrophosphat, Geranylgeranylpyrophosphat gebildet. Die zur Synthese der Carotinoide nötigen Enzyme werden durch Expression von einem Plasmid gebildet. Die Gene stammten aus dem natürlichen Carotinoidproduzenten Pantoea ananatis. Mit Hilfe dieser Enzyme wird dann das Tetraterpen Phytoen und aus diesem, nach einer mehrstufigen Einführung von Unsättigungen, das erste farbige Tetraterpen, das acylclische Lycopin gebildet. In weiteren Modifikationen können die Enden zum ß-Carotin zyklisiert und die Ringe schließlich zum Zeaxanthin hydroxyliert werden. Zur Hydroxylierung des ß-Carotins wurden die Cytochrom-P450-Monooxygenase CYP175A1 aus Thermus thermophilus und die beiden ß-Carotinhydroxylasen aus Pantoea ananatis (CrtZ) und Brevundimonas sp. SD212 (CrtZBrev) verglichen. CrtZBrev und CYP175A1 zeigten deutlich niedrigere Ausbeuten als CrtZ. Zur Analyse der gebildeten Produkte wurde eine Methode der HPLC etabliert und so angepasst, dass eine gute Trennung der Substanzen möglich war. Ferner wurde zur schnellen Untersuchung einer großen Zahl von Proben eine Methode der Dünnschichtchromatographie neu entwickelt. Als bei guter Ausbeute am einfachsten durchführbar erwies sich die Extraktion der Carotinoide mit Aceton. Es wurden Wiederfindungsraten > 97 % erhalten. Mehrere am IIG mit Hilfe der Transposonmutagenese erhaltene Mutanten zeigten eine höhere Transformationseffizienz als dem Wildtyp. Auch die produzierte Zeaxanthinmenge war größer. Die Mutante D7L3 (1,51 mg Zeaxanthin pro Gramm Biotrockenmasse) wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Beim Vergleich der beiden Vollmedien LB- und TB-Medium sowie dem Mineralmedium MEK zeigte sich, dass in TB-Medium mit Glycerin als zusätzlicher Kohlenstoffquelle mit 7,0 mg/g die mit Abstand höchste Zeaxanthinmenge hergestellt werden konnte. In LB-Medium lag die Ausbeute bei 1,3 mg/g und in MEK-Medium mit Glucose bei 2,5 mg/g. Die volumetrische Ausbeute war ebenfalls in TB-Medium mit 51,3 mg/l am höchsten. Bei LB- und MEK-Medium lag sie mit 2,2 mg/l beziehungsweise 1,7 mg/l deutlich niedriger. Während der Produktion stieg die Zeaxanthinmenge kontinuierlich an. Es wurden weiterhin ß-Carotin und ß-Cryptoxanthin in sehr geringen Mengen gefunden. Es konnten 0,1 mg/g ß-Carotin beziehungsweise 0,6 mg/g ß-Cryptoxanthin in TB-Medium gemessen werden. In LB- und MEK-Medium waren die Mengen noch niedriger. Andere Carotinoidvorstufen konnten nicht nachgewiesen werden. Aus den erhaltenen Daten kann abgeleitet werden, dass die Hydroxylierung den Engpass bei der Zeaxanthinsynthese darstellt, da hier die Zwischenstufen gefunden werden konnten, während die anderen Reaktionen ohne Akkumulierung von Zwischenstufen abliefen. Es konnte durch CD-Spektroskopie und chirale Dünnschichtchromatographie gezeigt werden, dass es sich bei dem in P. putida gebildeten Zeaxanthin um das (3R,3’R)-Isomer handelt. Das Expressionssystem wurde auch in E. coli verwendet. Die Ausbeute im besten Fall war hier aber deutlich niedriger und lag bei 2,4 mg/g. Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute in P. putida D7L3 wurden verschiedene Additive zum Medium geprüft. Am vielversprechendsten erwies sich Lecithin. Ein Zusatz von 10 % Lecithin vermochte innerhalb von 24 Stunden die Zeaxanthinmenge um das 10,4fache auf 216 mg/g zu steigern. Die Hochskalierung vom Schüttelkolben in den 5 l-Fermenter war erfolgreich, die Ausbeute blieb jedoch hinter der im Schüttelkolben deutlich zurück. Außerdem wurde die Bildung von Alginat beobachtet. Dies führte dazu, dass die Kultivierung nach spätestens zwei Tagen abgebrochen werden musste. In TB-Medium wurden Zeaxanthinausbeuten von 20 mg/l, in Mineralmedium wurde eine Ausbeute von 1,2 mg/l erreicht. Wurden Teilernten durchgeführt, bei welchem die Hälfte des Mediums einmal täglich gegen frisches Medium getauscht wurde, konnte die Ausbeute auf 5,1 mg/l gesteigert und die Kultivierung über drei Tage geführt werden. Bei Teilernten war das Produkt auch mit Lycopin verunreinigt.Item Open Access Ein GFP-basierter in-vivo-Assay für das Hochdurchsatz-Screening nach Hydrolaseaktivität(2005) Schuster, Sascha; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein effektives intrazelluläres Testsystem zur Identifizierung von Hydrolaseaktivität entwickelt. Die Grundlage dieses in vivo Assays beruht auf dem Auftreten von pH-Änderungen bei Hydrolase-katalysierten Substratspaltungen. Ratiometrisches pHluorin, eine pH-sensitive Mutante von Green Fluorescent Protein (GFP) fungierte als Detektor zur Bestimmung dieser pH-Änderungen. pHluorin besitzt im Gegensatz zu GFP zwei pH-abhängige Peaks bei 395 bzw. 475 nm, deren Maxima sich innerhalb eines pH-Bereichs von 8,0 bis 5,5 reversibel zueinander verschieben. Das aus den beiden Peaks gebildete Fluoreszenzemissionsverhältnis R475/395 kann - gemessen bei einer maximalen Emission bei 508 nm - direkt als Maß für intrazelluläre pH-Änderungen herangezogen werden. Die praktische Anwendung dieses Prinzips wurde zunächst durch Koexpression von pHluorin und der Esterase aus Geobacillus stearothermophilus (BSE) als Modellhydrolase in Escherichia coli (E. coli) Zellen und anschließender Hydrolyse verschiedener Ester untersucht. So zeigten Zellen nach Expression von pHluorin und Esterase, in Abhängigkeit von der Enzymaktivität gegenüber den untersuchten Substraten eine mehr oder weniger starke Änderung des Fluoreszenzemissionsverhältnisses. Daraufhin konnte die Anwendung des Assays auch erfolgreich auf Hydantoinase- sowie Amidase-katalysierte Substrathydrolysen erweitert werden. Außerdem wurden verschiedende Experimente im Mikrotiterplattenformat sowie in der Durchflusszytometrie im Hinblick auf eine erfolgreiche Assayapplikation im Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Enzymbibliotheken durchgeführt. Zur Etablierung im Hochdurchsatz-Screening wurde mittels error-prone PCR eine Mutantentenbibliothek der Esterase I aus Pseudomonas fluorescens (PFE I) aufgebaut und mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Nachweissystems auf erhöhte hydrolytische Enzymaktivität gegenüber g-Butyrolacton (GBL) untersucht. Auf diese Weise wurde eine Mutante mit einer 5,6-fach gesteigerten Umsatzrate von GBL im Vergleich zum PFE I-Wildtyp gefunden. Somit konnte gezeigt werden, daß eine schnelle und zuverlässige Untersuchung von Biokatalysatoren bei Anwendung des pHluorin-Assays zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken möglich ist.Item Open Access Identification of factors impeding the production of a single-chain antibody fragment in Escherichia coli by comparing in vivo and in vitro expression(2003) Ölschläger, Peter; Lange, Stefan; Schmitt, Jutta; Siemann-Herzberg, Martin; Reuss, Matthias; Schmid, Rolf D.In order to produce the atrazine-specific scFv K411B, it was expressed in either the cytoplasm or the periplasm of Escherichia coli BL21(DE3). For periplasmic production, the scFv was N-terminally fused to the pelB leader, whereas the unfused variant resulted in cytoplasmic expression. The extent of protein accumulation differed significantly: The expression level of the scFv with leader was 2.3 times higher than that of the protein without leader. To further investigate this, the respective translation profiles were generated by coupled in vitro transcription/translation assays and gave according results. Periplasmic expression resulted in only 10% correctly folded scFv. The same percentage was obtained when the scFv was expressed in vitro, indicating that the oxidizing environment of the periplasm did not increase proper folding. Thus, the data obtained in vitro confirmed the findings observed in vivo and suggested that the discrepancy in expression levels was due to different translation efficiencies. However, the in vivo production of the scFv with EGFP fused C-terminally (scFv-EGFP) was only successful in the cytoplasm, although in vitro the expression with and without the leader rendered the same production profile. This indicated that neither the translation efficiency nor the solubility but other factors impeded periplasmic expression of the fusion protein.Item Open Access Structural basis of stereoselectivity in Candida rugosa lipase-catalyzed hydrolysis of secondary alcohols(2001) Schulz, Tanja; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenLipases are widely applied catalysts for highly enantioselective resolution of chiral secondary alcohols. While stereopreference is determined predominantly by the substrate structure, stereoselectivity (enantioselectivity and diastereoselectivity) depends on atomic details of interactions between substrate and lipase. Experimentally obtained stereoselectivity and activity in the hydrolysis of butanoic acid esters of two secondary alcohols with two neighbouring stereocenters by Candida rugosa lipase have been investigated by computer-aided molecular modeling of tetrahedral substrate intermediates in complex with the lipase. Breakdown of this intermediate is considered to be the rate-limiting step. Sterical interactions of stereo isomers with the side chain of catalytic histidine led to different orientations of the imidazole. The distance d(HNε-Oalc) between HNε of the imidazole side chain of catalytic histidine and the alcohol oxygen of the substrate was identified to correlate with the experimentally determined reactivity order of the four stereo isomers. Modelled distances d(HNε-Oalc) were short (≤ 1.8 Å) for RR stereo isomers, which were also experimentally found to be hydrolyzed most rapidly; distances d(HNε-Oalc) were about 2 Å for SS and SR stereo isomers, which were converted at similar rates but at lower rate than RR stereo isomers; finally, distances d(HNε-Oalc) for SR stereo isomers were greater than 4 Å, in accordance with very slow conversion of SR stereo isomers.Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.