Universität Stuttgart
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Item Open Access Computergestützte Untersuchungen zur Dynamik und Wasserbindung des omega-loops in TEM beta-Lactamasen(2007) Bös, Fabian; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Die Enzyme der TEM ß-Lactamasen stellen in gramnegativen Bakterien die Hauptursache für die Resistenz gegenüber ß-Lactam-Antibiotika dar. Der Omega-loop ist ein in allen Klasse A ß-Lactamasen konserviertes Strukturelement und positioniert eine für den Reaktionsmechanismus essentielle Aminosäure. Der Omega-loop ist durch eine Salzbrücke zwischen den Aminosäuren Arg164 und Asp179 in seiner Form fixiert. Der Grad seiner Flexibilität ist jedoch auf Grund teils widersprüchlicher Ergebnisse bisheriger Untersuchungen unklar. Da bekannt ist, dass Wasser einen großen Einfluss auf die Struktur, Funktion und Dynamik von Proteinen hat, wurde in dieser Arbeit mit computergestützten Methoden der Zusammenhang zwischen der Wasserbindung und der Dynamik des Omega-loops untersucht. Zudem wurde im Rahmen dieser Arbeit an der Automatisierung von multiplen molekulardynamischen Simulationen in Cluster- und Grid-Umgebungen sowie an neuen Methoden zur Analyse der Proteindynamik mitgearbeitet. Die Kristallwassermoleküle aus 49 hochaufgelösten Röntgenkristallstrukturen der ß-Lactamase-Familien TEM, SHV und CTX-M wurden einer Cluster-Analyse unterzogen, um Aussagen über konservierte Wassermoleküle in Klasse A ß-Lactamasen treffen zu können. Es wurden insgesamt 13 Wassermoleküle identifiziert, welche in mehr als 90% der 49 Strukturen konserviert waren; darunter auch zwei zu 100% konservierte Wassermoleküle. Sechs der insgesamt 13 konservierten Wassermoleküle waren am Omega-loop lokalisiert, drei weitere konservierte Wassermoleküle waren mit anderen loop-Elementen in der Proteinstruktur assoziiert. Die am Omega-loop lokalisierten Wassermoleküle befanden sich in einer Aushöhlung, welche der Omega-loop mit den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns formt. Diese konservierten Wassermoleküle ermöglichen die Ausbildung eines Wasserstoffbrückennetzwerks zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und denen des Proteinkerns und stabilisieren somit den Omega-loop. Um die Dynamik und Flexibilität des Omega-loops näher zu charakterisieren und den Einfluss der konservierten Wassermoleküle darauf zu untersuchen, wurden multiple molekulardynamische Simulationen der TEM ß-Lactamase in Wasser als explizitem Lösungsmittel durchgeführt. Es zeigte sich, dass die TEM ß-Lactamase ein hoch geordnetes und rigides Protein ist, dass nur in loop-Bereichen eine erhöhte Flexibilität aufweist. Während der Hauptteil des Omega-loops eine geringe Flexibilität aufweist, sind die Aminosäuren 173 bis 177 durch eine erhöhte Flexibilität gekennzeichnet. Dieses kurze Teilstück des Omega-loops zeigte eine deutliche Bewegung, die einem ¨Offnen und Schließen der Aushöhlung am Omega-loop entspricht. Durch die Kombination mehrerer Simulationen konnte auch gezeigt werden, dass die Ergebnisse früherer Arbeiten über die Flexibilität des Omega-loops keinesfalls im Widerspruch zueinander stehen, sondern jeweils nur unterschiedliche Teilschritte der Omega-loop Bewegung beschreiben, deren Gesamtdauer über die einer einzelnen Simulation hinausgeht. Für vier der sechs in der Kristallstrukturanalyse identifizierten konservierten Wassermoleküle konnte in den multiplen Simulationen reproduzierbar gezeigt werden, dass sie Wasserbrücken zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns ausbilden. Die Aminosäuren 173 bis 177 sind jedoch nicht an der Ausbildung dieser Wasserbrücken beteiligt, was ihre erhöhte Flexibilität erklärt. Die Durchführung multipler Simulationen stellt eine logistische Herausforderung in Bezug auf die Vorbereitung, Durchführung und Auswertung der zahlreichen Simulationen dar, die nur noch sehr schwer von Hand zu bewältigen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher in Zusammenarbeit mit dem Höchstleistungsrechenzentrum der Universität Stuttgart der gesamte Ablauf einer multiplen molekulardynamischen Simulation in ein System zur automatisierten Durchführung wissenschaftlicher Arbeitsabläufe implementiert und erfolgreich in einer Grid-Umgebung getestet. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Visualisierung und Interaktive Systeme der Universität Stuttgart wurde daher eine neuartige Methode zur haptischen Interaktion und Analyse von molekulardynamischen Simulationen entwickelt. Hierzu wurde ein haptisches Eingabegerät, dass Bewegungen in sechs Freiheitsgraden ermöglicht und über einen stiftähnlichen Griff bedient wird, mit einem Visualisierungsprogramm für molekulardynamische Simulationen gekoppelt. Dieser Ansatz ermöglicht durch das Zuweisen von Oberflächeneigenschaften an die betrachtete Proteinstruktur die Übermittlung zusätzliche Informationen. Zudem ist es möglich, über das haptische Eingabegerät direkt mit der Proteinstruktur zu interagieren und somit die Proteindynamik im Verlauf einer molekulardynamischen Simulation interaktiv und zeitabhängig zu analysieren.