Universität Stuttgart
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Item Open Access Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.Item Open Access Studie zur Entwicklung eines neuen Biokatalysators zur Darstellung von vicinalen Aminoalkoholen(2015) Stahmer, Juliane; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Das Ziel der Biokatalyse ist der Einsatz von Enzymen in der chemischen Industrie, um großtechnische Verfahren nachhaltiger und umweltfreundlicher zu gestalten. Oft werden zur Herstellung von Bausteinen für Pharmazeutika oder Kosmetika metallabhängige oder Organokatalysatoren eingesetzt, die in ihrer Herstellung meist teuer und toxisch sind. Obwohl es bereits einige Enzyme gibt, die Anwendung finden, gibt es noch sehr viele Reaktionen, für die es noch kein enzymkatalysiertes Pendant gibt. Die Aufgabe der modernen Biokatalyse besteht also darin, Enzyme für neue nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wird daher die Entwicklung eines neuen Biokatalysators für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen untersucht und studiert. Die dabei resultierenden vicinalen Aminoalkohole sind wichtige Zwischenprodukte für verschiedene Anwendungsgebiete der chemischen Industrie. Ihre chemische Herstellung basiert auf der Verwendung von teuren und toxischen Katalysatoren oder sie laufen nicht genügend selektiv ab. Eine Möglichkeit der Entwicklung neuer Enzyme für nicht-natürliche Reaktionen stellt die Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren dar. Dies ist eine gute Option, da viele in der organischen Synthese verwendeten Aktivierungstriebkräfte, wie zum Beispiel Säurekatalyse, auch in Enzymen auffindbar sind. Die organische Chemie und das Enzymdesign finden so einen Kontaktpunkt, der im Zuge dieser Arbeit ausgenutzt werden soll. So wurden drei Ansätze entwickelt, von denen zwei auf der Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren beruhen und die dritte auf dem computerbasierten de novo Enzymdesign. Es wurden zwei Enzyme ausgewählt, die bereits ein aktives katalytisches Zentrum zur Epoxidringöffnung mit Nukleophilen, wie Wasser oder Halogeniden, besitzen. Zum einen wurde die Halohydrindehalogenase aus Agrobacterium radiobacter AD1 ausgewählt, um das vorhandene Nukleophilspektrum um NH-Nukleophile, wie Amide, Amidine oder Harnstoff zu erweitern. Zum Anderen sollte das Nukleophilspektrum der Limonen-1,2-epoxidhydrolase aus Rhodococcus erythropolis DCL14 um primäre und sekundäre Amine erweitert werden. Die bestehende Konkurrenz eines neuen nicht-natürlichen Nukleophils zum Wassernukleophil sollte durch gezieltes Ändern der aktiven Taschen mittels site-directed mutagenesis und durch Immobilisationstechniken abgeschwächt oder unterdrückt werden. Allerdings führten die Reaktionen der Varianten der genannten Enzyme mit verschiedenen Epoxiden und den genannten NH-Nukleophilen nicht zum gewünschten Erfolg. Als dritter Ansatz diente die Verwendung der Rosetta Methode, die in Zusammenarbeit mit Dr. Sinisa Bjelic (University of Washington, Seattle, USA) benutzt wurde, um Enyzmmodelle in silico zu erstellen, welche gewünschte Eigenschaften für die bimolekulare Epoxidringöffnungsreaktion enthielten. Die gewählten Substrate 3-Nitrostyroloxid und 3,4-Chloromethoxyanilin zeigten bereits eine geringe unselektive Hintergrundreaktion, deren Aktivität und Selektivität durch die Verwendung von de novo Enzymen gesteigert werden sollte. Sechs der 13 synthetischen de novo Gene konnten exprimiert und aufgereinigt werden. Gegenüber der Wunschreaktion zeigten sie allerdings keine Aktivität. Mittels STD-NMR konnte gezeigt werden, dass die gewählten Substrate an eines der Enzyme binden, allerdings konnte keine Aussage darüber getroffen werden, ob sie in der aktiven Tasche binden. Eine anschließende Untersuchung der verwendeten Übergangszustände gab Aufschluss über die nicht vorhandene Aktivität. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit die auftretenden Schwierigkeiten des Enzymdesigns für neue nicht-physiologische Reaktionen gezeigt werden. Es konnte zwar kein neuer Biokatalysator für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen entwickelt werden, jedoch zeigten die Untersuchungen die Schwachstellen auf, die nun in zukünftigen Arbeiten in diesem Gebiet umgangen werden können.Item Open Access Enzymatische und chemische Studien zur Veresterung und Löslichkeit von Cellulose in ionischen Flüssigkeiten(2017) Hinner, Lars Pieter; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Cellulose ist der Hauptbestandteil der pflanzlichen Zellwand und daher die häufigste organische Verbindung auf unserem Planeten. Dieses nachwachsende Biopolymer wird heutzutage hauptsächlich für die Produktion von Papier und Zellstoff verwendet oder verbrannt und somit als billiger Energieträger genutzt. Viele alternative Anwendungsgebiete sind aufgrund von unzureichenden Materialeigenschaften schwierig zu realisieren. Insbesondere thermoplastische Anwendungen sind nicht durchführbar, da Cellulose keinen Schmelzpunkt besitzt. Auch die chemische Modifikation der Cellulose - mit dem Ziel, andere Materialeigenschaften zu generieren - ist schwierig, da Cellulose nicht in Wasser oder in üblichen organischen Lösungsmitteln gelöst werden kann. Bis dato wurden daher industriell heterogene Synthesen entwickelt, um Cellulose im nicht gelösten Zustand zu modifizieren. Hierbei sind allerdings aufwendige mechanische und chemische Vorbehandlungen notwendig, um eine effiziente Verarbeitung bzw. Modifizierung der Cellulose zu gewährleisten. Zusätzlich sind heterogene Synthesen zur Produktion von Celluloseestern, aufgrund der starken sterischen Hinderung der nicht gelösten Cellulose, auf kurzkettige Acyldonoren (C2-C4) beschränkt. Somit ist es mit heterogenen Prozessen nicht möglich, das komplette Spektrum an potenziellen Celluloseestern zu erzeugen. Es gibt allerdings ein steigendes Interesse an neuartigen Celluloseestern, da beispielsweise Celluloseacetat nur eine schlechte thermoplastische Prozessierbarkeit aufweist. Die Herstellung von neuartigen Celluloseestern kann in homogenen Synthesen besser realisiert werden, in denen Cellulose vollständig gelöst vorliegt. Als Reaktionsmedium können unter anderem spezielle ionische Flüssigkeiten genutzt werden, welche in der Lage sind, Cellulose zu lösen. In diesem Kontext wurden verschiedene Synthesen entwickelt, welche reaktive Acyldonoren verwenden. Der Einsatz von derartigen Acyldonoren, wie beispielsweise Carbonsäurechloriden ist allerdings problematisch, da diese sowohl das Cellulosegrundgerüst, als auch die ionische Flüssigkeit zersetzen können. Daher erscheint eine homogene enzymatische Synthese von Celluloseestern als interessante Alternative, da durch die Verwendung von enzymatischen Katalysatoren weniger reaktive Acyldonoren, wie beispielsweise Ester, genutzt werden können. Angesichts der Herausforderung, unter moderaten Bedingungen zu katalysieren, lag ein Fokus der hier vorgelegten Arbeit in der Entwicklung einer enzymatischen Synthese von Celluloseestern mit langen Seitenketten. Da die Analytik von niedrig substituierten Celluloseestern schwierig ist, wurden zunächst leichter zu analysierende Modellreaktionen untersucht. Einfache Veresterungs- und Umesterungsreaktionen können in Cellulose-lösenden ionischen Flüssigkeiten erfolgreich enzymatisch katalysiert werden. Die enzymatische Synthese von Glucoseestern war jedoch nur in ionischen Flüssigkeiten erfolgreich, welche Cellulose nicht lösen. Als möglicher Grund hierfür wird eine mangelnde Interaktion zwischen Enzym und Glucose in diesen polaren ionischen Flüssigkeiten postuliert. Um die Interaktion zwischen Enzym und Glucose zu steigern, wurde die Glucosekonzentration erhöht, was allerdings zu keiner erfolgreichen Synthese von Glucoselaurat führte, da die große Viskosität von hoch konzentrierten Zuckerlösungen den Massentransfer und damit die Reaktion zusätzlich inhibiert. Eine Steigerung der Interaktionswahrscheinlichkeit zwischen Enzym und Glucose durch die Erhöhung der Glucosekonzentration ist allerdings in dem ebenfalls polaren Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) erfolgreich und erzeugt ab einer Glucosekonzentration von 60 % w/v signifikante Mengen an Glucoselaurat. Um sich in einem nächsten Schritt an den polymeren Charakter der Cellulose weiter anzunähern, wurde die enzymatische Veresterung des Dimers der Cellulose, d.h. der Cellobiose, als weitere Modellreaktion untersucht. Hierbei katalysiert das Enzym Candida antarctica Lipase B (CAL-B) die Synthese von nur sehr geringen Mengen an Cellobioseestern, wobei andere, ebenfalls aus Glucose aufgebaute Disaccharide wie Maltose und Trehalose, deutlich besser umgesetzt werden. Neunzehn verschiedene Enzympräparationen wurden auf die Fähigkeit untersucht, Cellobioselaurat zu synthetisieren. Den höchsten Umsatz katalysiert die Schweineleberesterase (PLE), jedoch zeigte dieses Enzym keine Aktivität gegenüber Cellulose als Ausgangssubstrat. Neben der enzymatischen Katalyse wurde eine chemische Synthese, basierend auf Vinylestern, entwickelt. Diese Vinylester-basierte Synthese ermöglicht erstmals die Acylierung von Cellulose mit Vinylestern in der biologisch abbaubaren ionischen Flüssigkeit 1-Ethyl-3-methylimidazoliumacetat ([EMIM]OAc). Die Reaktion läuft in Abwesenheit von zusätzlichen Katalysatoren ab und erlaubt die Synthese von Glucoseestern und Celluloseestern mit unterschiedlich langen Seitenketten. Es war möglich, Celluloseester mit Substitutionsgraden von 0,24 bis 3,00 zu erzeugen. Um die Reaktion zu charakterisieren, wurden verschiedene Reaktionsparameter wie Reaktionszeit, Temperatur und die Menge an Acyldonor systematisch variiert und mittels 1H-NMR, FT-IR und HPLC-GPC analysiert. Der höchste Veresterungsgrad ergibt sich bei einer Synthese-temperatur von 80°C und einer Reaktionszeit von zwei Stunden. Um die Synthese mit anderen Reaktionen aus der Literatur zu vergleichen, wurde eine Fettsäurechlorid-basierte Synthese von Barthel und Heinze in der ionischen Flüssigkeit 1-Butyl-3-methylimidazoliumchlorid ([BMIM]Cl) reproduziert. Beide Reaktionen zeigen vergleichbare Substitutionsgrade (DS), jedoch ist der Polymerisationsgrad (DP) von Celluloselaurat nach der Fettsäurechlorid-basierten Synthese erheblich reduziert, während die Vinylester-basierte Synthese deutlich schonender ist und die Produktion von signifikant größeren Celluloseestern erlaubt. Bei der Vinylester-basierten Synthese in [EMIM]OAc wurde eine zusätzliche Acetylierung der Cellulose als unerwünschte Nebenreaktion identifiziert. Der Acetylierungsgrad steigt mit abnehmender Polarität und steigender sterischer Hinderung der eingesetzten Vinylester. Allgemein ist der Acetylierungsgrad nach der Vinylester-basierten Synthese in [EMIM]OAc allerdings deutlich niedriger als bei bereits beschriebenen Synthesen in [EMIM]OAc, welche Anhydride oder Fettsäurechloride als Acyldonoren nutzen. Das Produktspektrum der Vinylester-basierten Synthese konnte durch Verwendung zusätzlicher Acyldonoren wie Benzoesäurevinylester, Pivalinsäurevinylester, Neodecansäurevinylester und 2-Ethylhexansäurevinylester erfolgreich erweitert werden. Des Weiteren wurden die thermoplastischen und rheologischen Eigenschaften der Celluloseester im Rahmen einer Kooperation mit Linda Göbel vom Institut für Kunststofftechnik untersucht, wobei die thermoplastische Verarbeitbarkeit prinzipiell bestätigt wer-den konnte. Es wurde außerdem ein Upscaling der Synthese mit anschließendem Recycling der ionischen Flüssigkeit durchgeführt. Das Upscaling wurde in einem Laborreaktor mit 2,5 kg ionischer Flüssigkeit durchgeführt, wobei 233,25 g Celluloselaurat mit einem Substitutionsgrad von 2,3 synthetisiert werden konnte. Die ionische Flüssigkeit wurde mit einer durchschnittlichen Effizienz von 91 % w/w recycelt und konnte in einer nach-folgenden Synthese als Lösungsmittel eingesetzt werden. Insgesamt wurden drei Synthese-Recyclingzyklen durchgeführt, wobei der Substitutionsgrad nach den ersten zwei Synthesen bei 2,3 lag, bei der dritten bzw. vierten Synthese allerdings auf 1,8 bzw. 1,4 sank. Parallel zur Verringerung des Substitutionsgrades verkürzte sich die Lösezeit von Cellulose in der ionischen Flüssigkeit mit jedem weiteren Recyclingzyklus signifikant. Als Grund für die verbesserte Löslichkeit wurde die Bildung von 1-Ethyl-2-hydroxyethyl-3-methylimidazolium (EHEMIM) identifiziert, das durch die Reaktion einer Carben-Spezies des 1-Ethyl-3-methylimidazoliums (EMIM) mit Acetaldehyd - welches als Nebenprodukt bei der Vinylester-basierten Synthese auftritt - entsteht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein von Wasser für das verbesserte Lösungsvermögen des [EHEMIM]-[EMIM]OAc-Systems essentiell ist. Die besten Lösungseigenschaften wurden bei einem Kationenanteil von 50 mol-% EHEMIM bzw. 50 mol-% EMIM und einem Wassergehalt von 8,5 % w/w beobachtet. Dieses optimierte [EHE-MIM]-[EMIM]OAc-Wasser-System ermöglicht das Lösen von 14 % w/w Cellulose bei 80°C innerhalb von 3 Stunden. Im Gegensatz dazu löst die ursprüngliche ionische Flüssigkeit [EMIM]OAc bzw. [EMIM]OAc mit einem optimalen Wassergehalt von 10 % w/w unter den gleichen Bedingungen lediglich 1 % w/w bzw. 2 % w/w Cellulose.Item Open Access Biosynthese von Carotinoiden mittels rekombinanten Mikroorganismen(2010) Beuttler, Holger; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Diese Arbeit entstand aus einem gemeinsamen Projekt des Instituts für technische Biochemie (ITB) und des Instituts für Industrielle Genetik (IIG) an der Universität Stuttgart. Während das Institut für Industrielle Genetik für die molekularbiologischen Arbeiten zuständig war, oblagen dem Institut für Technische Biochemie, die Kultivierung und die Analytik. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Synthese von Carotinoiden in rekombinanten Pseudomonas putida KT2440 mit Zeaxanthin als Modellprodukt untersucht werden. Insbesondere sollten limitierende Schritte bei der Biosynthese identifiziert werden. Die Synthese der Carotinoide erfolgt dabei aus der zugefütterten Kohlenstoffquelle, meist Glucose. Aus dieser werden in mehreren Schritten die Vorstufen des Isoprens, das Isopentenylpyrophosphat (IPP) und das Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) gebildet. Aus den beiden Vorstufen wird im bakteriellen Isoprenkatabolismus nun über die Zwischenstufen Geranylpyrophosphat und Farnesylpyrophosphat, Geranylgeranylpyrophosphat gebildet. Die zur Synthese der Carotinoide nötigen Enzyme werden durch Expression von einem Plasmid gebildet. Die Gene stammten aus dem natürlichen Carotinoidproduzenten Pantoea ananatis. Mit Hilfe dieser Enzyme wird dann das Tetraterpen Phytoen und aus diesem, nach einer mehrstufigen Einführung von Unsättigungen, das erste farbige Tetraterpen, das acylclische Lycopin gebildet. In weiteren Modifikationen können die Enden zum ß-Carotin zyklisiert und die Ringe schließlich zum Zeaxanthin hydroxyliert werden. Zur Hydroxylierung des ß-Carotins wurden die Cytochrom-P450-Monooxygenase CYP175A1 aus Thermus thermophilus und die beiden ß-Carotinhydroxylasen aus Pantoea ananatis (CrtZ) und Brevundimonas sp. SD212 (CrtZBrev) verglichen. CrtZBrev und CYP175A1 zeigten deutlich niedrigere Ausbeuten als CrtZ. Zur Analyse der gebildeten Produkte wurde eine Methode der HPLC etabliert und so angepasst, dass eine gute Trennung der Substanzen möglich war. Ferner wurde zur schnellen Untersuchung einer großen Zahl von Proben eine Methode der Dünnschichtchromatographie neu entwickelt. Als bei guter Ausbeute am einfachsten durchführbar erwies sich die Extraktion der Carotinoide mit Aceton. Es wurden Wiederfindungsraten > 97 % erhalten. Mehrere am IIG mit Hilfe der Transposonmutagenese erhaltene Mutanten zeigten eine höhere Transformationseffizienz als dem Wildtyp. Auch die produzierte Zeaxanthinmenge war größer. Die Mutante D7L3 (1,51 mg Zeaxanthin pro Gramm Biotrockenmasse) wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Beim Vergleich der beiden Vollmedien LB- und TB-Medium sowie dem Mineralmedium MEK zeigte sich, dass in TB-Medium mit Glycerin als zusätzlicher Kohlenstoffquelle mit 7,0 mg/g die mit Abstand höchste Zeaxanthinmenge hergestellt werden konnte. In LB-Medium lag die Ausbeute bei 1,3 mg/g und in MEK-Medium mit Glucose bei 2,5 mg/g. Die volumetrische Ausbeute war ebenfalls in TB-Medium mit 51,3 mg/l am höchsten. Bei LB- und MEK-Medium lag sie mit 2,2 mg/l beziehungsweise 1,7 mg/l deutlich niedriger. Während der Produktion stieg die Zeaxanthinmenge kontinuierlich an. Es wurden weiterhin ß-Carotin und ß-Cryptoxanthin in sehr geringen Mengen gefunden. Es konnten 0,1 mg/g ß-Carotin beziehungsweise 0,6 mg/g ß-Cryptoxanthin in TB-Medium gemessen werden. In LB- und MEK-Medium waren die Mengen noch niedriger. Andere Carotinoidvorstufen konnten nicht nachgewiesen werden. Aus den erhaltenen Daten kann abgeleitet werden, dass die Hydroxylierung den Engpass bei der Zeaxanthinsynthese darstellt, da hier die Zwischenstufen gefunden werden konnten, während die anderen Reaktionen ohne Akkumulierung von Zwischenstufen abliefen. Es konnte durch CD-Spektroskopie und chirale Dünnschichtchromatographie gezeigt werden, dass es sich bei dem in P. putida gebildeten Zeaxanthin um das (3R,3’R)-Isomer handelt. Das Expressionssystem wurde auch in E. coli verwendet. Die Ausbeute im besten Fall war hier aber deutlich niedriger und lag bei 2,4 mg/g. Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute in P. putida D7L3 wurden verschiedene Additive zum Medium geprüft. Am vielversprechendsten erwies sich Lecithin. Ein Zusatz von 10 % Lecithin vermochte innerhalb von 24 Stunden die Zeaxanthinmenge um das 10,4fache auf 216 mg/g zu steigern. Die Hochskalierung vom Schüttelkolben in den 5 l-Fermenter war erfolgreich, die Ausbeute blieb jedoch hinter der im Schüttelkolben deutlich zurück. Außerdem wurde die Bildung von Alginat beobachtet. Dies führte dazu, dass die Kultivierung nach spätestens zwei Tagen abgebrochen werden musste. In TB-Medium wurden Zeaxanthinausbeuten von 20 mg/l, in Mineralmedium wurde eine Ausbeute von 1,2 mg/l erreicht. Wurden Teilernten durchgeführt, bei welchem die Hälfte des Mediums einmal täglich gegen frisches Medium getauscht wurde, konnte die Ausbeute auf 5,1 mg/l gesteigert und die Kultivierung über drei Tage geführt werden. Bei Teilernten war das Produkt auch mit Lycopin verunreinigt.Item Open Access Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology(2005) Grimm, Verena Ulrike; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals. In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.Item Open Access Zur Anwendbarkeit von Squalen-Hopen-Zyklasen als chirale Brønsted-Säuren in der asymmetrischen Katalyse(2014) Hammer, Stephan C.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die Anwendung von Enzymen und Mikroorganismen als Katalysatoren in der organischen Synthese hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten als eine ernsthafte Ergänzung zur rein chemischen Katalyse etabliert. Jedoch ist die Bandbreite an biokatalytisch durchführbaren Reaktionen sehr gering. Für eine Vielzahl an synthetisch wertvollen Reaktionen wurden entsprechende Enzyme von der Natur nicht evolviert oder bisher nicht entdeckt. Die Entwicklung solcher Enzyme für die Katalyse nicht-physiologischer chemischer Transformationen ist ein zum größten Teil unerforschtes Arbeitsgebiet. Ein Ansatzpunkt ist die Nutzbarmachung bereits vorhandener enzymatischer Katalysezentren. Dies ist auch von besonders großer Bedeutung, da viele der in der organischen Chemie divers eingesetzten Aktivierungsmodi Bestandteil des enzymatischen Repertoires sind. Jedoch werden diese hoch-entwickelten enzymatischen Katalysezentren von der Natur häufig nur sehr spezialisiert eingesetzt und im Labor nur selten gezielt für nicht-natürliche Reaktionen entwickelt. In diesem Grenzgebiet, zwischen der organischen Synthesechemie und dem Enzymdesign, befindet sich der Fokus der hier vorliegenden Arbeit. Ziel war die Entwicklung einer Plattform für die enzymatische Brønsted-Säure-Katalyse. Dies ermöglicht einen potentiellen biokatalytischen Zugang zu einer Vielzahl an nicht-physiologischen, jedoch synthetisch wertvollen chemischen Transformationen, da die chirale Brønsted-Säure-Katalyse in der organischen Chemie zur Durchführung einer Vielzahl an wichtigen C-C-bindungsknüpfenden Reaktionen verwendet wird. Dieser Ansatz verbindet die leistungsstarke Brønsted-Säure-Katalyse mit den Vorteilen der Biokatalyse, namentlich den oft exzellenten Selektivitäten zusammen mit hohen Aktivitäten basierend auf einer Synthese in Wasser als „grüneres“ Lösungsmittel. Biokatalysatoren sind genetisch kodiert und lassen sich somit mikrobiell synthetisieren und einfach durch genetische Manipulation optimieren. Während die allgemeine Brønsted-Säure-Katalyse bei Enzymen eine wichtige Rolle spielt (z. B. bei der Stabilisierung von Übergangszuständen durch Bildung von Wasserstoffbrücken-bindungen) ist die enzymatische, spezifische Brønsted-Säure-Katalyse nicht beschrieben. Eine Ausnahme bilden hier die Squalen-Hopen-Zyklasen (SHCs), welche die kationische Polyzyklisierung von Squalen zu den pentazyklischen Produkten Hopen und Hopanol katalysieren. Zur Protonierung der terminalen C=C-Bindung des Substrates nutzen SHCs eine Asparaginsäure mit biologisch ungewöhnlich hoher Acidität. Während dieser Doktorarbeit wurde das katalytische Potential dieser einzigartigen Protonierungsmaschinerie studiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das natürliche Reaktionsspektrum dieses katalytischen Zentrums (ausgestattet mit der hoch-aciden Asparaginsäure) untersucht. Durch die Verwendung verschiedener bioinformatischer Methoden wurden Proteinsequenzen evolutionär verwandter Enzyme ermittelt. Somit wurde eine Superfamilie an protonierenden Enzymen (Protonasen) identifiziert und bezüglich deren beschriebener Funktionen analysiert. Diese Studien zeigen, dass sich das Reaktionsspektrum dieser Protonase-Superfamilie in der Natur auf die Polyzyklisierung einiger weniger linearer Terpene beschränkt, ganz im Gegensatz zu der enormen Diversität Brønsted-Säure-katalysierter Reaktionen in der organischen Chemie. Das Substratspektrum der SHCs und dabei besonders des Enzymes aus Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) wurde in der Vergangenheit mehrfach adressiert, wobei sich die Studien auf Polyzyklisierungen Squalen-artiger Substratanaloga beschränkten. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Substratspektrum für Polyzyklisierungsreaktionen auf funktionalisierte Polyprenoide erweitert. Insbesondere wurde gezeigt, dass Aromaten und Amide als Nukleophile in der kationischen Polyzyklisierung verwendet werden können, um die Reaktionen zu terminieren. Somit sind formal die stereoselektive Friedel-Crafts-Alkylierung sowie die Hydroamidierung Bestandteil des Reaktionsportfolios der SHCs. Neben der AacSHC wurde in diesem Teil der Arbeit auch eine weitere SHC aus Zymomonas mobilis (ZmoSHC1) verwendet, wobei sich beide Enzyme nur minimal in ihren Funktionen unterschieden. Das Substratspektrum der SHCs ist bezüglich der Substratgröße beschränkt. Während sich mittelgroße Sesqui- und Diterpen-Derivate selektiv und mit guter Aktivität zu bi- und trizyklischen Verbindungen umsetzen lassen, werden Monoterpen-Derivate von den Wildtyp-Enzymen nicht zu den entsprechenden chiralen Cyclohexanoiden zyklisiert. Synthetisierte Modellsubstrate wurden in einem dritten Teil dieser Arbeit verwendet, um diese Limitierung zu untersuchen. Hierzu wurden die Aktivitäten bei enzymatischen Umsetzungen mit molekulardynamischen Simulationen verglichen. Somit wurde ein Zusammenhang zwischen der Substratbindung in einer reaktiven Konformation und der jeweiligen Aktivität aufgezeigt. Daraus lässt sich ableiten, dass vermutlich nicht die katalytische Maschinerie die SHCs auf die Polyzyklisierungschemie beschränkt, sondern die Struktur des hochselektiven aktiven Zentrums. Dieses aktive Zentrum diskriminiert nicht-natürliche Substrate durch die limitierte Fähigkeit diese in einer reaktiven Konformation zu binden. Um SHCs zu „Protonasen“ für unterschiedliche nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln, ist deshalb ein breites Set an unterschiedlichen Geometrien des aktiven Zentrums nötig. Dementsprechend lassen sich potentielle Substrate für unterschiedliche Reaktionstypen mit einer höheren Wahrscheinlichkeit in einer reaktiven Konformation binden. Jedoch sind die aktiven Zentren der SHCs und auch verwandter Triterpen-Zyklasen hochkonserviert. Die nötige Diversität an Enzymen lässt sich somit nicht aus dem natürlichen Pool an Katalysatoren rekrutieren. Aus diesem Grund wurde in einem vierten Teil der Arbeit eine Mutantenbibliothek der AacSHC erstellt. Mit einer rationalen Mutationsstrategie (hydrophobe Substitution) wurde die AacSHC zu einem Set an hochselektiven „Protonasen“ entwickelt und damit die Anwendbarkeit als chirale Brønsted-Säure in der asymmetrischen Katalyse untersucht. Die erzeugten Varianten zeigten Aktivitäten für unterschiedliche chemische Transformationen bei gleichzeitiger Protonierung verschiedener funktioneller Gruppen (Alken, Epoxid und Carbonyl). Dies ermöglichte die Darstellung interessanter Cyclohexanoide mit guten Aktivitäten und exzellenten Stereoselektivitäten (>99 % ee/de). Die praktische Anwendbarkeit wurde in semi-präparativen Umsetzungen aufgezeigt. So wurde zum Beispiel 512 mg Geraniol mit der Variante AacSHC G600F zu einem Cyclohexanoid umgesetzt (32 % isolierte Ausbeute). Demzufolge wurde durch die Einführung einer Punktmutation ein beinahe inaktives Wildtyp-Enzym zu einem praktisch anwendbaren Katalysator evolviert. Verdeutlicht werden die exzellenten Selektivitäten (Regio-, Stereo- und Produktselektivitäten) durch die exklusive Umsetzung von (S)-6,7-Epoxygeraniol aus dem entsprechenden Racemat (inklusive der regioselektiven Deprotonierung des Carbokation-Intermediates), die hochstereoselektive Synthese (>99 % de) von (-)-iso-Isopulegol aus (S)-Citronellal oder durch die stereoselektive Wasseraddition an das Carbokation-Intermediat der Zyklisierung von Geraniol. Der Ursprung der hohen Selektivitäten liegt in der Geometrie des aktiven Zentrums. Ausgehend von unterschiedlichen reaktiven Konformationen (welche zu unterschiedlichen Produkten führen können), werden die Substrate von den „Protonasen“ selektiv in einer bestimmten reaktiven Konformation gebunden und dadurch selektiv aktiviert. Zusammenfassend wurde die einzigartige Protonierungsmaschinerie der SHCs von der Polyzyklisierungschemie befreit und für nicht-natürliche Reaktionen in die asymmetrische Katalyse eingeführt. Darüber hinaus leistet diese Arbeit einen methodischen Beitrag in der Entwicklung neuer Biokatalysatoren, da sie aufzeigt, dass Enzyme und deren Katalysezentren systematisch für nicht-physiologische Reaktionen entwickelt werden können. Dies ist interessant für die Etablierung neuer Biosynthesewege sowie für die Erweiterung der Reaktionsportfolios in der organischen Synthese (Stichwort: chirale Brønsted-Säure-Katalyse in Wasser).Item Open Access Studien zum Einsatz von enzymatischen Lewis- und Brønsted-Säuren in Carbonyl-aktivierten organischen Reaktionen(2016) Bischoff, Jennifer N.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access DNA microarray based gene expression profiling in human hepatocyte cells to serve as a basis for dynamic modelling of the human liver : a systems biology approach(2008) Reichart, Thomas; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)This thesis provides a holistic overview over the gene expression pattern in human hepatocyte cells after induction with rifampicin. The expression levels of all human genes were determined using full genome microarrays from Affymetrix after several points in time (6, 24 and 72 h) after induction in three individual patients. In addition 151 liver specific genes were monitored more frequently using sub-genome Arrays from Eppendorf. The results were confirmed by Realtime PCR and Western-Blot analysis. Identified genes play a role in carbon metabolism (gluconeogenesis), in heme biosynthesis, in bulirubin-, bile acid- and lipid metabolism as well as xenobiotic-metabolism and transport. The observed cell response on RNA level over time allowed new insights in the regulation of this complex system. Next to the network reconstruction, based on the full genome array data, the highly time resolved measurements enable dynamic modelling of expression and therefore a mathematical reproduction of the cellular response upon the stimulus. Using the developed models predictions concerning the behaviour of the "system hepatocyte" and the associated regulations will be possible in the future. This model based prognosis will especially allow improved drug development and personalized medicine.Item Open Access The Lipase Engineering Database – a navigation and analysis tool for protein families(2003) Fischer, Markus; Pleiss, JürgenThe Lipase Engineering Database (http://www.led.uni-stuttgart.de) integrates information on sequence, structure, and function of lipases, esterases, and related proteins. Sequence data on 806 protein entries are assigned to 38 homologous families, which are grouped into 16 superfamilies with no global sequence similarity between each other. For each family, multisequence alignments are provided with functionally relevant residues annotated. Pre-calculated phylogenetic trees allow navigation inside superfamilies. Experimental structures of 45 proteins are superposed and consistently annotated. The Lipase Engineering Database has been applied to systematically analyze sequence-structure-function relationships of this vast and diverse enzyme class. It is a useful tool to identify functionally relevant residues apart from the active site residues, and to design mutants with desired substrate specificity.Item Open Access How to find soluble proteins : a comprehensive analysis of alpha/beta hydrolases for recombinant expression in E. coli(2005) Koschorreck, Markus; Fischer, Markus; Barth, Sandra; Pleiss, JürgenBackground: In screening of libraries derived by expression cloning, expression of active proteinsin E. coli can be limited by formation of inclusion bodies. In these cases it would be desirable to enrich gene libraries for coding sequences with soluble gene products in E. coli and thus to improve the efficiency of screening. Previously Wilkinson and Harrison showed that solubility can be predicted from amino acid composition (Biotechnology 1991, 9(5):443-448). We have applied this analysis to members of the alpha/beta hydrolase fold family to predict their solubility in E. coli. alpha/beta hydrolases are a highly diverse family with more than 1800 proteins which have been grouped into homologous families and superfamilies. Results: The predicted solubility in E. coli depends on hydrolase size, phylogenetic origin of the host organism, the homologous family and the superfamily, to which the hydrolase belongs. In general small hydrolases are predicted to be more soluble than large hydrolases, and eukaryotic hydrolases are predicted to be less soluble in E. coli than prokaryotic ones. However, combining phylogenetic origin and size leads to more complex conclusions. Hydrolases from prokaryotic, fungal and metazoan origin are predicted to be most soluble if they are of small, medium and large size, respectively. We observed large variations of predicted solubility between hydrolases from different homologous families and from different taxa. Conclusion: A comprehensive analysis of all alpha/beta hydrolase sequences allows more efficient screenings for new soluble alpha/beta hydrolases by the use of libraries which contain more soluble gene products. Screening of hydrolases from families whose members are hard to express as soluble proteins in E. coli should first be done in coding sequences of organisms from phylogenetic groups with the highest average of predicted solubility for proteins of this family. The tools developed here can be used to identify attractive target genes for expression using protein sequences published in databases. This analysis also directs the design of degenerate, family- specific primers to amplify new members from homologous families or superfamilies with a high probability of soluble alpha/beta hydrolases.