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Item Open Access Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.Item Open Access Expression, Charakterisierung und Optimierung mikrobieller Laccasen für die Biokatalyse(2008) Koschorreck, Katja; Schmid, Rolf D. (Prof.)Laccasen (E.C. 1.10.3.2.) gehören zu den Multikupferoxidasen und katalysieren die Ein-Elektron-Oxidation von vier Substratmolekülen durch die Vier-Elektronen-Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Besonders aus Weißfäulepilzen wurden viele Laccasen beschrieben und in der Biokatalyse eingesetzt. Bisher wurden jedoch hauptsächlich natürlich vorkommende Mischungen von Laccasen aus Weißfäulepilzen und nicht isolierte Enzyme verwendet. In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb Laccasen aus verschiedenen Mikroorganismen exprimiert und charakterisiert sowie auf ihre Einsetzbarkeit in der Biokatalyse untersucht werden. Die Aktivität der Laccasen bei der oxidativen Kupplung phenolischer Säuren sowie der Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe stand dabei im Vordergrund. Zudem sollte die häufig geringe Expression der Laccasen verbessert und gemeinsam mit der Aktivität der Enzyme über gezielte Mutagenese oder Zufallsmutagenese gesteigert werden. Vier verschiedene Laccasen aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor, Lccalpha, Lccbeta, Lccgamma und Lccdelta, wurden erfolgreich in Pichia pastoris überexprimiert. Die Wahl der Signalsequenz zur Sekretion in P. pastoris sowie die Temperatur hatten einen großen Einfluss auf die Expression der Laccasen. Durch Hochzelldichte-Kultivierungen von P. pastoris wurden hohe Ausbeuten der Laccasen von bis zu 3400 U l–1 erzielt, die den biotechnologischen Einsatz dieser Enzyme realisierbar machen. Die biochemische Charakterisierung der Laccasen ergab, dass Lccalpha und Lccbeta bei Raumtemperatur wie auch bei höheren Temperaturen deutlich stabiler als Lccgamma und Lccdelta waren. Zudem zeigten die Laccasen sehr unterschiedliche katalytische Aktivitäten. Obwohl alle vier Isoenzyme die oxidative Phenolkupplung von 5 mM Sinapinsäure regioselektiv zum Dehydrodisinapinsäuredilakton katalysierten, zeigte Lccdelta mit 98% Umsatz nach 20 min die höchste Aktivität. Lccalpha, Lccbeta und Lccgamma wiesen nach 20 min 34%, 50% bzw. 48% Umsatz auf. Die Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasser-stoffe erfolgte hingegen am effektivsten mit Lccbeta. Durch Einsatz des Redoxmediators 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-Schwefelsäure) (ABTS) wurde mit Lccbeta nach 72 h über 80% Umsatz von 0,1 mM Anthracen, Acenaphthen und Acenaphthylen erzielt und damit deutlich bessere Ergebnisse erreicht als bisher mit Laccase-Mischungen aus T. versicolor und ABTS. Lccbeta wurde somit als stabilste Laccase aus T. versicolor mit hoher Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten identifiziert und ist potenziell für einen Einsatz in der Biokatalyse geeignet. Strukturelle Analysen der Laccasen und anschließende Mutagenese zeigten, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der Laccasen gegenüber polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen durch die Aminosäuren an Position 164 und 265 in der Substratbindetasche verursacht werden. Des Weiteren wurde eine neue Laccase aus Bacillus licheniformis identifiziert und erfolgreich in Escherichia coli überexprimiert. Das Enzym CotA katalysierte die oxidative Kupplung verschiedener phenolischer Säuren, allerdings war die Aktivität des Enzyms stark von der Alkylkettenlänge der Säureseitengruppe wie auch von den Substituenten in ortho-Position der Phenolgruppe abhängig. So wurden 5 mM Sinapinsäure, Kaffeesäure und Ferulasäure von CotA nach 120 min zu 66%, 22% bzw. 15% umgesetzt, während p-Cumarsäure, Zimtsäure und Vanillinsäure nicht oxidiert wurden. Als Hauptprodukte der Kupplungsreaktionen wurden Dimere der Säuren identifiziert. Die höchste Regioselektivität bei der oxidativen Phenolkupplung wurde bei der Oxidation von Sinapinsäure zum Dehydrodisinapinsäure-dilakton erreicht (79% Anteil am Gesamtprodukt). Syringasäure wurde von CotA ausschließ-lich zum 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinon oxidiert (22% Umsatz nach 120 min). CotA wurde durch Zufallsmutagenese (error-prone PCR) verändert und 6000 CotA-Varianten im Hochdurchsatzverfahren auf verbesserte Aktivität gegenüber ABTS untersucht. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurde anschließend über einen rationalen Ansatz die CotA-Variante K316N/D500G erzeugt. Diese konnte 11,4-mal so stark wie der Wildtyp exprimiert werden. Das bedeutet, dass circa 300 mg aktive Laccase aus 1 l E. coli-Kultur erhalten werden können. K316N/D500G zeigte zudem eine um circa 50% höhere spezifische Aktivität bei der oxidativen Phenolkupplung von Ferulasäure als der Wildtyp. Die Aktivität gegenüber Kaffeesäure war leicht erhöht (20% Umsatz gegenüber 18% Umsatz mit CotA). Außerdem wurden die Farbstoffe Remazol Brilliant Blue R, Alizarin Red S und Indigocarmin von K316N/D500G sowohl in An- wie in Abwesenheit des Redoxmediators Violursäure deutlich stärker entfärbt als von CotA-Wildtyp. Die verbesserten Eigenschaften der CotA-Variante K316N/D500G ermöglichen den Einsatz dieser bakteriellen Laccase in der Biokatalyse.Item Open Access DNA microarray based gene expression profiling in human hepatocyte cells to serve as a basis for dynamic modelling of the human liver : a systems biology approach(2008) Reichart, Thomas; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)This thesis provides a holistic overview over the gene expression pattern in human hepatocyte cells after induction with rifampicin. The expression levels of all human genes were determined using full genome microarrays from Affymetrix after several points in time (6, 24 and 72 h) after induction in three individual patients. In addition 151 liver specific genes were monitored more frequently using sub-genome Arrays from Eppendorf. The results were confirmed by Realtime PCR and Western-Blot analysis. Identified genes play a role in carbon metabolism (gluconeogenesis), in heme biosynthesis, in bulirubin-, bile acid- and lipid metabolism as well as xenobiotic-metabolism and transport. The observed cell response on RNA level over time allowed new insights in the regulation of this complex system. Next to the network reconstruction, based on the full genome array data, the highly time resolved measurements enable dynamic modelling of expression and therefore a mathematical reproduction of the cellular response upon the stimulus. Using the developed models predictions concerning the behaviour of the "system hepatocyte" and the associated regulations will be possible in the future. This model based prognosis will especially allow improved drug development and personalized medicine.Item Open Access Cytochrom P450-Monooxygenasen : Modellierung, Datenbankanalyse und experimentelle Charakterisierung neuer Enzymvarianten(2008) Seifert, Alexander; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Cytochrom P450-Monooxygenasen. Vertreter dieser Enzymsuperfamilie sind aufgrund ihrer Beteiligung am Medikamentenstoffwechsel des Menschen, sowie ihrer Fähigkeit eine Vielzahl chemischer Verbindungen stereo- und regioselektiv zu oxidieren Gegenstand intensiver Forschung. Die genaue Vorhersage des von P450-Monooxygenasen verursachten Medikamentenstoffwechsels ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Wirksubstanzen. Weiterhin sind einige Vertreter dieser Enzymsuperfamilie für biotechnologische Anwendungen interessant. Aufgrund ihrer hohen Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten, einem breiten Substratspektrum und relativer Prozessstabilität erweisen sich dabei Varianten der bakteriellen P450-Monooxygenase CYP102A1 (P450 BM-3) als besonders vielversprechend. Für die effiziente Anwendung von P450-Monooxygenasen ist jedoch häufig die Verbesserung bestimmter biochemischer Eigenschaften, wie der Regio-, Stereo- und Chemoselektivität unerlässlich. Eine wichtige Voraussetzung für die gezielte Verbesserung dieser Eigenschaften sowie für genaue Vorhersagen des von P450-Monooxygenasen verursachten Medikamentenstoffwechsels ist das Verständnis der molekularen Grundlagen von Aktivität, Spezifität und Selektivität. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit widmet sich daher der Untersuchung von Substrat-Enzym-Wechselwirkungen von Cytochrom P450-Monooxygenasen zur Identifizierung von selektivitätsbestimmenden Regionen. Hierzu wurde beispielhaft die Dynamik des CYP2C9-Warfarin-Komplexes mittels multipler molekulardynamischer Simulationen untersucht. Die Simulationsexperimente zeigten stark bewegliche Strukturelemente, welche die Bildung von Kanälen von der Proteinoberfläche ins Innere bewirken. Diese Kanäle ermöglichen den Austausch von Substraten und Produkten zwischen der Proteinumgebung und dem aktiven Zentrum. Die Beweglichkeit dieser Strukturelemente erlaubt darüber hinaus die Adaption des Enzyms an Substrate verschiedener Größe und Form. Die Regioselektivität wiederum wird durch einen engen trichterförmigen Hämzugangskanal kontrolliert, welcher vom starren Proteinkern gebildet wird. Dieser gewährt nur den Teilen des Substratmoleküls, die durch den Trichter passen, einen Zugang zum aktivierten Häm-Sauerstoff. Aminosäuren, die den Hämzugangskanal bilden, sind folglich von großer Bedeutung für die Orientierung des Substrats in der Nähe des Häms. Diese Erkenntnis führte zur Vorhersage von Aminosäuren mit starkem Einfluss auf die Regioselektivität in CYP2C9. Daraufhin wurden verschiedene P450-Monooxygenasen in dem für die Kontrolle der Regioselektivität wichtigen Bereich verglichen. Wegen ihrer direkten Nachbarschaft zu dem in der Sequenz und in der Struktur hoch konservierten ExxR-Motiv wurde die Region um die Substraterkennungsstelle 5 (SRS-5) für eine systematische Analyse von 31 Kristallstrukturen und über 6300 Sequenzen ausgewählt. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass P450-Monooxygenasen in dieser Region in Sequenz und Struktur variabel sind. Es wurde eine positiv geladene mit der Hämgruppe interagierende Aminosäure am C-terminalen Ende der SRS-5 Region in 29 Strukturen sowie in 97,7% aller Sequenzen identifiziert. Die Konformation der Region ist abhängig von der Position dieser Aminosäure nach dem konservierten ExxR-Motiv. Dabei zeigte sich, dass P450-Monooxygenasen hinsichtlich der Position dieser positiv geladenen Aminosäuren klassifiziert werden können. Die beobachteten Konformationen unterscheiden sich auch hinsichtlich der Position von zum Hämzentrum ausgerichteten Aminosäuren. Diese Aminosäuren beeinflussen die Orientierung von Substraten in der Nähe der Hämgruppe und haben damit einen starken Einfluss auf die Spezifität und Selektivität. Mit Hilfe der hier aufgeklärten Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehungen können solche Aminosäuren ausschließlich anhand der Proteinsequenz ohne Kenntnis der Proteinstruktur identifiziert werden. Dies erlaubte das Aufstellen von Regeln zur einfachen Identifizierung zweier Positionen mit großem Einfluss auf Spezifität und Selektivität nur anhand von Sequenzinformationen. Die Prädiktivität dieser Regeln wurde mit Hilfe experimenteller Literaturdaten bestätigt. Im letzten Teil der Arbeit wurden die bis dahin gewonnenen Erkenntnisse genutzt, um neue Varianten der für biotechnologische Prozesse vielversprechenden bakteriellen P450-Monooxygenase CYP102A1 zu generieren. Ziel war es hierbei die Regio, Stereo- und Chemoselektivität des Enzyms gegenüber verschiedenen Substraten zu erhöhen, sowie das Produktspektrum zu verändern. Zu diesem Zweck wurde eine Bibliothek von CYP102A1-Varianten erstellt, welche Mutationen in nur zwei Positionen aufweisen. Eine dieser Positionen wurde im Rahmen dieser Arbeit als hotspot für Selektivität und Spezifität identifiziert und kann in der Sequenz fast aller P450-Monooxygenasen lokalisiert werden. Die zweite Position wurde in vorangegangen Arbeiten als hotspot für Selektivität und Spezifität in CYP102A1 identifiziert. Durch Kombination von 5 hydrophoben Aminosäuren in beiden hotspot Positionen wurde eine Mutantenbibliothek minimaler Größe bestehend aus 24 Einfach- und Doppelmutanten generiert. Ziel war es dabei, kooperative Effekte von Mutationen in beiden hotspot Positionen zu induzieren, welche aufgrund der räumlichen Nähe beider Positionen erwartet wurden. Diese Mutantenbibliothek wurde mit vier Terpenen ((4R)-Limonen, (+)-Valencen, Nerylaceton und Geranylaceton) unterschiedlicher Größe und Form durchmustert. Nach der Entwicklung einer umfassenden Analytik zur Identifizierung der gebildeten Oxidationsprodukte konnte gezeigt werden, dass 11 Enzymvarianten ein verändertes Produktspektrum und/oder verbesserte Regio- und Stereoselektivität aufweisen. Zu den gebildeten Oxidationsprodukten gehört der wertvolle Aromastoff (+)-Nootkaton. Weiterhin werden hier erstmalig CYP102A1-Varianten vorgestellt, welche bevorzugt die 11- und 12-Hydroxyprodukte von Geranyl- und Nerylaceton produzieren. Dabei handelt es sich um wertvolle Ausgangsstoffe für die Synthese von Naturstoffen. Es zeigte sich, dass kooperative Effekte von Mutationen in beiden hotspots entscheidend für die Erhöhung der Selektivität von CYP102A1 gegenüber den sperrigeren Substraten (+)-Valencen und (4R)-Limonen sind.Item Open Access Untersuchungen zur selektiven enzymatischen Hydroxylierung von Fettsäuren(2008) Dietrich, Matthias; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)Ziel der vorgelegten Arbeit war die Untersuchung der enzymatischen Oxidation von Fettsäuren mit P450 Monooxygenasen. Dabei stand die Hydroxylierung von gesättigten Fettsäuren bzw. die Veränderung der Hydroxylierungsposition im Vordergrund. Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP) können molekularen Sauerstoff unter Aufnahme von zwei Elektronen aktivieren, wodurch ein Sauerstoffatom auf ein Substrat-Molekül übertragen wird, das andere Sauerstoffatom tritt bei der Reaktion in Form von Wasser aus. Die Elektronen für die Katalyse stammen von Cofaktoren (meist NADH oder NADPH) und werden mittels Elektronentransferproteinen auf das Hämeisen von P450 Monooxygenasen übertragen. Im Gegensatz zu den meisten anderen P450-Enzymen sind die Enzyme der Subfamilien CYP102A und CYP152A nicht von Redoxproteinen abhängig. Bei CYP102A-Enzymen handelt es sich um Fusionsproteine, die aus einer Monooxygenase- und einer FAD/FMN-enthaltenden Reduktasedomäne bestehen. Die Elektronen werden vom Cofaktor NADPH auf die Reduktase übertragen. Der schnelle Elektronentransfer im CYP102A-System führt bei der Umsetzung mit natürlichen Substraten (mittel- und langkettige Fettsäuren) zu den höchsten für P450 Monooxygenasen gemessenen Umsatzraten (>1000 min-1). Bei CYP152A1 handelt es sich genau genommen um eine Peroxygenase, die Wasserstoffperoxid als Elektronen- und Sauerstoffquelle nutzt. Mit langsameren Raten ist jedoch auch eine Katalyse mit molekularem Sauerstoff unter Verwendung von Elektronentransferproteinen möglich. Die CYP102A-Enzyme und CYP152A1 unterscheiden sich in der Regioselektivität der katalysierten Hydroxylierung. Während CYP102A-Enzyme Fettsäuren in subterminalen Positionen (omega-1 bis omega-3) hydroxylieren, erfolgt durch CYP152A1 die Hydroxylierung in alpha- und beta-Position. Die Verschiebung der Hydroxylierung der Capryl-, Caprin- und Laurinsäure nach gamma- und delta-Position würde in Hydroxysäuren resultieren, die direkte Vorläufer von Lactonen darstellen. Lactone sind interessante Geruchs- und Aromastoffe mit fruchtigem Charakter (Pfirsich, Kokosnuss). Für CYP152A1 wurden mit Hilfe des rationalen Protein-Designs verschiedene Mutanten erstellt, die eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Fettsäurebindestelle enthalten. Allerdings erwies sich nur der CYP152A1-Wildtyp als aktiv. Die erstellten Mutanten ließen sich zum Teil exprimieren, waren jedoch für die Umsetzung von Fettsäuren nicht produktiv. CYP102A7 ließ sich erfolgreich exprimieren und konnte in dieser Arbeit charakterisiert werden. CYP102A7 hydroxyliert Fettsäuren hauptsächlich in omega-2-Position, daneben werden noch omega-1- und omega-3-Position hydroxyliert. Daher ist CYP102A7 nicht für die Entwicklung einer gamma- oder delta-Hydroxylase prädestiniert. In Gegenwart des polaren Lösungsvermittlers DMSO zeigt CYP102A7 hohe Aktivität. Die Stabilität gegenüber Lösungsvermittlern ist besonders interessant für die Entwicklung von Prozessen mit hydrophoben Substraten. Neben Fettsäuren akzeptiert CYP102A7 auch Terpenoide als Substrate. Es wurden bereits zahlreiche Untersuchungen an CYP102A1 (P450 BM3) durchgeführt. Verschiedene Kristallstrukturen (mit und ohne Substrat komplexiert) machen das Enzym zugänglich für Methoden des rationalen Protein-Designs. Um die Regioselektivität der Fettsäurehydroxylierung von omega-1- bis omega-3-Position in Richtung gamma- und delta-Position zu verschieben, wurden Methoden der gerichteten Evolution und des rationalen Protein-Designs angewendet. Mit Hilfe eines in der Arbeit entwickelten Assays, mit dem über 6000 Mutanten analysiert wurden, war es nicht möglich eine wesentliche Verschiebung im Vergleich zum Ausgangsenzym zu erhalten. Allerdings wurden durch rationales Protein-Design Positionen identifiziert, die für eine zielgerichtete Veränderung des Produktmusters vorteilhaft sind. Mit der Mutante S72Y V78A F87A wurden, gemessen am Gesamtprodukt, 16% delta-, 5% gamma- und 9% beta-Hydroxylaurinsäure erzeugt.Item Open Access The lipases from Candida antarctica : cloning, expression and their application in the synthesis of structured lipids(2008) Pfeffer, Jan Christoph; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)This work was part of the cooperation "Sturctured Lipids by Bio-Engineering" between the Institute of Technical Biochemistry at the University of Stuttgart and the Nestlé Research Center in Lausanne, Switzerland. In the framework of this project new enzymatic methods for the synthesis of structured triacylglycerides and 2-monoacylglycerides were established and scaled up to a technical scale (> 100 gram product). Additionally a lipase showing high sn2-preference which is an ideal prerequisite for the direct synthesis of 2-monoacylglycerides and structured lipids was expressed in technical scale (5 litre fermenter), purified and generally characterised. For this lipase the prerequisites for an error-prone PCR (epPCR)-based mutagenesis aiming at improvement of the biocatalyst were generated. The chemical synthesis of 2-monoacylglycerides is challenging due to several reaction steps, a costly purification and often results in very low yields. In contrast 2-monoacylglycerides and structured triacylgylcerides are relatively easy to synthesise using lipases with regard to yield and purity. Lipase A from Candida antarctica seemed to be a promising catalyst for the direct esterification of fatty acids and glycerol yielding in 2-monoacylglycerides. This enzyme displays the highest preference for the sn2-position published in scientific literature. The immobilised enzyme showed only a very weak esterification potential and the esterification was - in contrast to the hydrolysis, where CalA showed a clear sn2-preference - unspecific. Different parameters (temperature, solvent, water activity, substrates of different chain lengths, and use of ionic liquids) were changed, but no improvement in activity or specificity could be observed. Therefore optimisation of CalA via directed evolution was planned. As the crystal structure of CalA is not solved yet and also the homology with other lipases is quite low, the only possibility to optimize the enzyme was directed evolution: design of a mutant library by epPCR followed by a high-throughput-screening using a versatile assay system. As the functional expression of CalA in a fast-growing and easy-to-handle-microorganism is a major prerequisite for directed evolution, the expression of the lipase had to be adapted to E. coli. With pUC18 - a standard vector for E. coli - no active protein was expressed. Therefore special expression vectors of the pET- and pCold-series were chosen and the protein folding was supported by co-expression of special folding proteins - so-called chaperones. The combination of the pColdIII-plasmid and the Gro7-chaperone showed best results for hydrolysis activity of CalA yielding in an specific activity of 13.1 U/mg of total soluble protein. Consequently the major bottleneck for directed evolution of CalA was overcome and a following directed evolution generated new mutants of CalA showing an increased sn2-preference. Especially a quadruple mutant showed an increased sn2-prefernce for hydrolysis reactions. In parallel to the CalA-approach, a new process for the synthesis of 2-mono- (2-MAG) and structured triacylgylcerides (TAG) allowing the application of wild-type enzymes was established. However in this process two steps for the synthesis of 2-MAG are necessary. The first reaction step is an esterification of glycerol and free fatty acids catalysed by an unspecific lipase. The product of this first reaction is a homogeneous TAG which is in the second reaction - an alcoholysis reaction - converted to a 2-MAG catalysed by an sn1,3-specific lipase. In a possible third reaction step the outer positions of the glycerol backbone can be blocked with a short- or medium-chain fatty acid to avoid acyl migration of the fatty acid from the sn2 position to an outer position. As the project was mainly focused on the synthesis of 2-MAG of polyunsaturated fatty acids (PUFA), the lipases catalysing the process had to be able to convert such bulky fatty acids. A screening of different lipases showed that the whole process can be catalysed by just one lipase: the lipase B from Candida antarctica (CalB). This enzyme shows an unspecific manner in the esterification reaction, but converts the TAG sn1,3-specifically in an ethanolysis reaction. So by the use of just one biocatalyst two totally different reactions can be performed with different specificity. After the reactions were performed successfully and with high yields, the process was up-scaled in the miniplant of the Institute of Biochemical Engineering (IBVT). In this scale tripalmitin was converted in a two-step process - alcoholysis to the corresponding 2-MAG followed by esterification with oleic acid - to 1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerol (OPO), which is a major component of mother milk.Item Open Access Massenspektrometrische Diagnostik von CYP2B6 Polymorphismen : phänotypische Ausprägung in Lebergewebe und klinische Bedeutung(2008) Blievernicht, Julia; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)Für Fremdstoff- und Arzneimittelstoffwechsel sind hauptsächlich die Cytochrom P450 (CYP) Enzyme der Leber verantwortlich. Diese Superfamilie der Monooxygenasen ist fähig, Arzneimittel und andere potentiell toxische Fremdstoffe in hydrophilere und damit leichter eliminierbare Stoffwechselprodukte umzuwandeln. Das CYP Isoenzym CYP2B6, das im Zentrum dieser Arbeit steht, metabolisiert verschiedene klinisch verwendete Medikamente wie Cyclophosphamid (ein Zytostatikum), Bupropion (Raucherentwöhnungstherapie) oder den reversen Transkriptase Hemmer Efavirenz (HIV-Therapie). Expression und Aktivität dieses Enzyms sind interindividuell hochvariabel, was neben biologischen und Umwelt-Faktoren auch genetische Ursachen hat. Zu Beginn dieser Arbeit waren Ausmaß und Auswirkungen von „single nucleotide polymorphisms“ (SNPs) bislang nur unzureichend untersucht. Dies lag hauptsächlich daran, dass ein geeignetes analytisches Verfahren für die Detektion der immer größeren Zahl von neu entdeckten Varianten und deren phänotypische Korrelation fehlte. Die MALDI-TOF Massenspektrometrie ist ein effizientes und sensitives Hochdurchsatz-Verfahren zur gleichzeitigen Detektion mehrerer SNPs. Der Vorteil gegenüber anderen Verfahren beruht auf der simultanen Genotypisierung mit Hilfe allel-spezifischer Primer-Verlängerungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf dieser Basis eine hocheffiziente Genotypisierungsmethode entwickelt, validiert und etabliert. Die Methode ermöglichte es, für große Probenzahlen viele Mutationen (n=19) des CYP2B6 Gens in kurzer Zeit und mit großer Präzision zu detektieren, wie an einem ausführlichen Vergleichstest nachgewiesen wurde. Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die Untersuchung der möglichen klinischen Relevanz einzelner CYP2B6 Polymorphismen und Allele durch veränderte Proteinexpression bzw. -aktivität, unter Berücksichtigung von nicht-genetischen Faktoren wie Geschlecht, Alter, Rauchverhalten, Kaffee- bzw. Grapefruitsaftgenuss und Medikation. Dies konnte anhand einer umfangreichen Leberbank (n=235) durchgeführt werden. Die Ergebnisse liefern erstmals deutliche Hinweise auf die Assoziation einiger Allele, hier sei das CYP2B6*6 Allel hervorgehoben, mit einem niedrigen Protein-Gehalt und einer erniedrigten Enzymaktivität. Eine signifikante Beeinflussung der Proteinexpression oder der Enzymaktivität durch das Geschlecht, das Alter oder die Umweltfaktoren konnte dagegen nicht nachgewiesen werden. Allerdings wurde ein Induktionseffekt der CYP2B6 Expression bei Patienten beobachtet, die mit dem Antiepileptikum Carbamazepin oder dem Analgetikum Metamizol behandelt wurden. Verschiedene Kooperationen zu klinischen Gruppen ermöglichten die Untersuchung von Polymorphismen des CYP2B6 an Patientenkollektiven mit differentem Krankheitshintergrund. CYP2B6 und Morbus Parkinson: Neurologisch wirksame Substanzen wie Selegilin (Parkinson-Therapie) und andere exogene Umweltstoffe (Nikotin) werden von CYP2B6 metabolisiert. Das Protein ist zudem auch im Gehirn exprimiert. Eine mögliche Assoziation von CYP2B6 mit der Parkinsonschen Krankheit wurde mit Hilfe der Genotypisierung der CYP2B6 Polymorphismen an DNA-Proben einer „case-control“ Studie mit Parkinson Patienten untersucht, in der Polymorphismen in anderen Stoffwechsel-Enzymen als mögliche Risiko-Faktoren beschrieben wurden. Diese Analyse ergab jedoch keinen signifikanten Unterschied der Frequenz der CYP2B6 Genotypen zwischen Patienten und Kontrollgruppe. Dass CYP2B6 für die Entstehung von Morbus Parkinson eine Rolle spielt, kann damit jedoch nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden. Denn möglicherweise wirkt sich der Polymorphismus nur in Zusammenhang mit bestimmten Noxen aus. Dies könnte in spezifischen Studien weiter untersucht werden. CYP2B6 und HIV-Therapie: Neue und seltene CYP2B6 Mutationen waren hinsichtlich ihrer funktionellen Bedeutung in der HIV-Therapie noch weitestgehend unbekannt. Die Ergebnisse der Genotypisierung von DNA-Proben verschiedener HIV-Populationen belegten eindrucksvoll die Assoziation der CYP2B6 Variante *6 sowohl mit erniedrigter Proteinexpression und Efavirenz-Hydroxylierung in vitro als auch im klinischen Umfeld der Efavirenz-Therapie. Zum ersten Mal wurde hier eine umfassende Analyse durchgeführt, die neben dem *6-Allel auch seltenere „loss-of-function“ Allele mit einschloss. Dadurch konnte die Prädiktivität für unerwartet hohe Plasmaspiegel des HIV-Therapeutikums erheblich gesteigert werden. Die technischen Entwicklungen und Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit können zukünftig helfen, die Arzneimitteltherapie mit CYP2B6 Substraten zu optimieren. Sie unterstreichen den Wert der umfassenden prädiktiven CYP2B6 Genotypisierung für eine Anpassung der Medikamentendosis, um Nebenwirkungen zu vermeiden und das Ansprechen zu verbessern.Item Open Access Von der Sequenz zur Funktion : systematische Modellierung verschiedener Proteinfamilien auf Sequenz- und Strukturebene(2008) Knoll, Michael; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Das Verständnis der Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehung ist Voraussetzung, um experimentell beobachtete Unterschiede bei Enzymen hinsichtlich Selektivität und Substratspezifität erklären und verstehen zu können. Eine systematische Analyse der Enzyme innerhalb einer umfassenden Proteinfamilie verwandter Proteine ist zum Verständnis dieser Beziehung von Vorteil. Dadurch können in Sequenz und Struktur konservierte Bereiche aufgedeckt und familienspezifische Parameter abgeleitet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde am Beispiel von drei verschiedenen Proteinfamilien eine systematische Untersuchung der Proteinfamilie oder einzelner Vertreter durchgeführt, um familienspezifische Regeln aufzustellen und diese für das Proteindesign zu nutzen. Unterschiedliche Substratspezifitäten und Selektivitäten konnten mit einfachen Modellen beschrieben werden. Für zwei der Proteinfamilien wurden Proteinfamiliendatenbanken etabliert, die eine erweiterte und umfassendere systematische Analyse dieser Proteinfamilien ermöglichen. Für die Familie der Thiamindiphosphat-abhängigen Enzyme wurden systematische Strukturvergleiche verwandter Proteine durchgeführt, um Unterschiede bezüglich Selektivität und Substratspezifität zu erklären. Für die Familien der mittelkettigen Alkoholdehydrogenasen und der Cytochrom P450 Monooxygenasen wurden umfassende Proteinfamiliendatenbanken etabliert, die eine systematische Analyse dieser Familien ermöglichen.