Universität Stuttgart
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Item Open Access Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.Item Open Access Untersuchungen zur enzymatischen Enantiomerentrennung von Glykolethern und Etablierung neuer Methoden des synthetischen Shufflings(2004) Rusnak, Monika; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen geeigneten Biokatalysator für die Enantiomerentrennung des Modellsubstrats 1-Methoxy-2-Propanol (MP) bzw. seines Esters 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA) bereitzustellen. In den letzten Jahren stieg das Interesse an den enantiomerenreinen Formen dieser Glykolether enorm. In dieser Arbeit richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Evaluierung verschiedener Strategien zur Identifizierung bzw. Optimierung des Biokatalysators. Hierbei sollten sowohl Methoden der de novo Klonierung und der biochemischen Charakterisierung neuer Enzyme, wie auch der gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns bereits bekannter Biokatalysatoren angewandt werden. Das so erhaltene Enzym sollte das Potenzial zum Einsatz in der chemischen Industrie haben, was hohe Anforderungen sowohl an Enantioselektivität wie auch an die Prozessstabilität eines Biokatalysators stellt. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Lipase A aus Archaeoglobus fulgidus kloniert und charakterisiert werden. Dieses Enzym, welches sehr geringe Homologie zu anderen bekannten Hydrolasen aufwies, zeigte ein interessantes Profil, speziell in Bezug auf sein pH-Optimum, jedoch keine Hydrolyse von MPA. Es war bekannt, dass die Lipase B aus Candida antarctica (CalB) eine hohe Enantioselektivität vor allem bei der Hydrolyse von MPA zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war daher die Abschätzung der Nutzbarkeit und Verfügbarkeit von CalB für die Enantiomerentrennung von MP / MPA. Die industrielle Anwendung von CalB ist durch die Patentierung dieses Enzyms durch Novozymes beschränkt. Die im zweiten Teil dieser Arbeit etablierte Expression von CalB in Pichia pastoris und die Übertragung des Expressionssystems auf den Fermentationsmaßstab schufen optimale Voraussetzungen für nachfolgende Experimente. Die bei dieser Expression erzielten Ausbeuten übertrafen die anderer Gruppen. Die erzeugten rationalen Mutanten zur Verbesserung der Selektivität in der Umesterung konnten keine Erhöhung der Enantioselektivität bewirken. Die hier erstmals gelungene funktionelle Expression von CalB in E.coli eröffnete jedoch die Möglichkeit zur gerichteten Evolution von CalB und dem Screening auch großer Mutantenbibliotheken, sowohl durch die Methode des Plattenscreenings wie auch durch FACS-Screening. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, günstige und schnelle Methode der Gensynthese entwickelt, die zur Darstellung der im vierten Teil der Arbeit verwirklichten Genbank verwendet wurde. Die so gewonnene Lipase 1 aus Moraxella sp. TA144 wurde funktionell in E.coli exprimiert und charakterisiert. Basierend auf der in dieser Arbeit etablierten Methode der Gensynthese konnte eine Genbank der CalB erstellt werden, die durch eine neue Methode des synthetisches Shuffling dargestellt wurde. Durch mehrere Evaluierungsansätze konnte die Sequenz der Genbank den Anforderungen gemäß optimiert werden, so dass das Auftreten ungewollter Mutationen minimiert werden konnte. In dem folgenden Hochdurchsatzscreening von 19000 Klonen der Genbank im vorher etablierten E.coli Expressionssystem konnte kein Klon mit Lipaseaktivität isoliert werden. Nichtsdestotrotz handelte es sich hierbei um einen interessanten neuen Ansatz der gerichteten Evolution, der nach Optimierung der Lipaseexpression bzw. des Screeningsystems und möglicherweise nach Herabsetzung des Degenerationsgrades zu neuen Biokatalysatoren mit interessanten Eigenschaften führen sollte. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass es zur enzymatischen Enantiomerentrennung von MPA im Moment keinen Ersatz zu CalB gibt. Durch die Etablierung der CalB-Expression in E.coli wurde die entscheidende Voraussetzung zur Optimierung der noch verbesserungswürdigen Enantioselektivität, vor allem in der Umesterungsreaktion, sowie der noch geringen Thermostabilität geschaffen. Der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz der gerichteten Evolution zeigte auf, dass bei evolutiven Mutagenesestrategien stets mehrere Variablen existieren, deren Auswirkungen auf das Ergebnis gegeneinander gewichtet werden müssen. So sollte die Variabilität der Mutantenbibliotheken hoch sein, um Klone mit möglichst neuen Kombinationen von gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Gleichzeitig sollte bedacht werden, dass die strukturelle Stabilität der Mutanten mit steigender Variabilität sinkt, so dass der verfügbare Sequenzraum stets begrenzt bleiben muss, um eine zufriedenstellende Ausbeute an funktionellen Klonen zu gewährleisten.Item Open Access Klonierung, Expression und Charakterisierung der Cytochrom P450-Monooxygenase CYP102A3 aus Bacillus subtilis sowie Veränderung ihrer Regioselektivität durch gerichtete Evolution(2004) Lentz, Oliver; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Cytochrom P450-Monooxygenasen sind in der Natur weit verbreitet und besitzen Schlüsselfunktionen im Metabolismus exogener und endogener Verbindungen. Funk-tionell ist allen P450-Enzymen gemeinsam, Sauerstoffatome auf nicht aktivierte aliphatische oder aromatische C-H, N-H oder S-H-Bindungen zu übertragen. Die funktionelle Vielfalt der durch P450-Systeme katalysierten Monooxygenierungen von auf chemischem Wege häufig nur schwer zugänglichen Verbindungen bietet ein enormes biotechnologisches und pharmakologisches Potential. Eine wichtige Voraussetzung zur Nutzung dieser Potentiale ist die Entwicklung geeigneter Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsnachweissysteme, die erlauben P450-Systeme zu charakterisieren und Enzymvarianten mit verbesserten Eigenschaften aufzufinden. Es existieren bereits zahlreiche Untersuchungen zur bakteriellen Fettsäurehydroxylase CYP102A1 aus Bacillus megaterium, die viel versprechende Eigenschaften in Bezug auf Aktivität und Stabilität im Vergleich zu eukaryontischen Systemen aufweist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine weitere bakterielle Monooxygenase der P450-Familie CYP102 kloniert und in E. coli funktionell exprimiert. Bei der Charakterisierung der P450-Monooxygenase CYP102A3 aus Bacillus subtilis wurde entdeckt, dass sie höhere Stabilität bei Raumtemperatur und in Lösungsvermittlern aufweist als CYP102A1 und damit für technische Anwendungen geeigneter erscheint. Durch Mutagenese wurde die Substratspezifität stark erweitert und auf Alkane und Arene ausgedehnt. Um die Regioselektivität der n-Octan-Hydroxylierung durch Mutagenese von rein subterminaler zu terminaler Hydroxylierung zu ändern, wurde ein Hochdurchsatzassay entwickelt, der selektiv für terminale Hydroxylierungen an aliphatischen Verbindungen ist. Er beruht auf der Oxidation des entstandenen primären Alkohols zum Aldehyd durch eine Hefe-Alkoholdehydrogenase. Mit Hilfe des Assays und der Methode der gerichteten Evolution konnte aus 6500 Mutanten eine terminal hydroxylierende Variante identifiziert werden, deren Sequenzinformationen die Erstellung einer stabilen Doppelmutante auf der Basis von CYP102A3 ermöglichte, welche bei der Hydroxylierung von n-Octan einen Produktanteil von 48% 1-Octanol liefert.Item Open Access Entwicklung eines diagnostischen DNS-Mikroarrays zur Genotypisierung der Chinolon-Resistenz von Escherichia coli(2004) Yu, Xiaolei; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Chinolone gehören zu den leistungsfähigsten Antibiotika in der Humanmedizin. Die Resistenz gegen Fluorochinolone hat sich wegen des weltweiten Einsatzes dieses Medikaments schnell erhöht. E. coli ist eine der am meisten betroffene Spezies. Obwohl E. coli von Natur aus gegen Fluorochinolone sensitiv ist, wurde das Auftreten von E. coli Stämmen mit verringerter Empfindlichkeit gegen Fluorochinolone häufig beobachtet, besonders im Urinaltrakt-Bereich. Das vermehrte Scheitern von Behandlungen mit Fluorochinolonen ist darauf zurückzuführen. Die therapeutische Verwendung der Chinolone ohne Rücksicht auf eine mögliche Resistenz des Infektionserregers kann zu einem Behandlungsausfall sowie zu einer Induktion neuer Resistenzen führen. Ein schneller und präziser diagnostischer Resistenztest ist daher in der klinischen Anwendung von großer Bedeutung. Bis jetzt benötigen die Standardmethoden zur Detektion von Antibiotika-Resistenzen mehr als einen Tag. Durch die Verwendung der Mikroarray-Technologie kann die Testzeit in Zukunft bis auf wenige Stunden reduziert werden. Darüber hinaus kann die Detektion auf dem molekularen Niveau für die Überwachung von Patienten mit Langzeit-Antibiotikabehandlung und für die Untersuchung der Mechanismen von Resistenzen nützlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein diagnostischer Mikroarray zur Detektion von Punktmutationen entwickelt. Dieses Mikroarray-System kann die am weitesten verbreiteten Resistenzgenotypen von E. coli identifizieren. Anhand der Analyse von Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken sowie eigener Sequenzierungsdaten von klinischen Isolaten, wurden die Aminosäurepositionen 83 und 87 in der Untereinheit A der DNS-Gyrase (Gen gyrA) sowie die Aminosäurepositionen 80 und 84 in der Untereinheit A der Topoisomerase IV (Gen parC) als Mutationshotspots identifiziert. Die auf diese vier Positionen gerichteten Oligonukleotidsonden wurden so entworfen, dass sie sowohl die wichtigsten resistenzverursachenden Mutationen, als auch die assoziierten stillen Mutationen abdecken. Die Methode der Allel-spezifischen Hybridisierung wurde für den gyrA-Array und die Allel-spezifische primer extension für den parC-Array verwendet. Die Funktionsfähigkeit beider Arrays wurde mit 36 E. coli Isolaten aus vier unterschiedlichen Krankenhäusern in Deutschland validiert. Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse stimmten mit den Resultaten der direkten DNS-Sequenzierung und der phäntotpyischen Untersuchung überein. Um die Assayzeit zu reduzieren und die Sensitivität zu erhöhen, wurden die Markierungs-PCR und die Hybridisierung hinsichtlich dieser zwei Faktoren optimiert. Das optimierte Verfahren war in der Lage, die Resistenz von E. coli bis zu einer Konzentration von 100 CFU/ml (gyrA) bzw. 1000 CFU/ml (parC) nachzuweisen. Außerdem war die Identifikation von resistenten E. coli in Anwesenheit eines zehnfachen Überschusses an sensitivem E. coli möglich. Unter der Verwendung von Hybridisierungsstationen konnte die gesamte Testdauer auf 3.5 Stunden (gyrA) bzw. 4.5 Stunden (parC) reduziert werden. Nach der erfolgreichen Vereinigung des gyrA- und parC-Arrays konnten Mutationen in beiden Genen gleichzeitig nachgewiesen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte diagnostische Verfahren zur Bestimmung der Chinolonresistenz in E. coli bietet somit einen vielversprechenden Ansatz zur Verbesserung der Diagnostik von Infektionskrankheiten des Urogenitaltrakts und wird zukünftig mit der Entwicklung eines kommerziellen Prototyps fortgesetzt.Item Open Access Die Lipase Engineering Database : systematische Analyse familienspezifischer Eigenschaften und der Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehung von alpha/beta-Hydrolasen(2004) Fischer, Markus; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Familie der alpha/beta-Hydrolasen systematisch untersucht. Grundlage dieser Analyse war die Entwicklung eines Data Warehouse Systems zur Integration von Proteinsequenz- und Strukturdaten in Verbindung mit funktionell relevanten Informationen für große Proteinfamilien. Als Anwendung dieses Data Warehouse Systems wurde die Lipase Engineering Database (LED) erstellt, die alle Mitglieder der alpha/beta-Hydrolasen enthält. Das Release 2.3 der LED enthält 3148 Sequenzeinträge für 2313 Proteine, wobei 35% der Proteine als putativ definiert sind. Für 96 Proteineinträge sind 261 Struktureinträge in der LED abgelegt. Aufgrund der Sequenzähnlichkeit wurden die alpha/beta-Hydrolasen in 37 Superfamilien und 103 homologe Familien eingeteilt. Die LED diente zur systematischen Identifikation familienspezifischer Deskriptoren auf Sequenz- und Strukturebene. Die Bestimmung streng konservierter Positionen für acht repräsentative alpha/beta-Hydrolasesuperfamilien half bei der Identifikation des Faltungsnukleus, der den alpha/beta-Hydrolase Fold charakterisiert. Daraus konnte ein Modell für die Faltung dieser Proteine skizziert werden. Anhand der Architektur des funktionell wichtigen oxyanion holes konnten diese in drei Klassen eingeteilt werden: (1) die GGGX Klasse, für die die oxyanion hole bildende Aminosäure am C-terminalen Ende des hoch konservierten Musters GGG lokalisiert ist und von einer streng konservierten, hydrophoben Aminosäure X gefolgt wird, (2) die GX Klasse, für die die oxyanion hole Aminosäure X einem streng konserviertem Glycin folgt und (3) die Y Klasse deren oxyanion hole durch die Hydroxylgruppe eines streng konservierten Tyrosin gebildet wird. Für die strukturelle Stabilisierung des oxyanion holes der GX Klasse wurde die Wechselwirkung der Seitenkette X mit Anker Aminosäuren identifiziert. Dieses Anker-Konzept konnte experimentell durch den Austausch des Anker-Moduls in der Lipase aus Burkholderia cepacia gegen das der Lipase aus Rhizomucor miehei bestätigt werden. Die Form und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Fettsäurebindungsstelle von acht alpha/beta-Hydrolasen wurden untersucht, um deren Substratspezifität auf molekularer Ebene nachzuvollziehen. Diese konnten so in vier Gruppen eingeteilt werden und half bei der Identifikation von Aminosäuren, die für die Vermittlung der Substratkettenlängenspezifität verantwortlich sind. Für die Superfamilie der Carboxylesterasen wurden mit der in CODEHOP implementierten Methode degenerierte familienspezifischen Primer erstellt, die sich zur Identifikation neuer Carboxylesterasen in aus Bodenproben isolierter DNA eignen.