Universität Stuttgart
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Item Open Access Mechanistic studies on the DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B(2021) Dukatz, Michael; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)In this work, both regulatory and catalytic mechanisms of de novo methyltransferases were investigated, which include interactions with other proteins and the specific recognition of the substrate sequence. Another part of this work strived to elucidate how enzymatic generation of 3-methylcytosine by DNMT3A can occur.Item Open Access Studien zur biotechnologischen Anwendung und ökologischen Funktion von Pyrrolochinolinchinon(PQQ)-abhängigen Alkoholdehydrogenasen(2021) Wehrmann, Matthias; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Lokalisation, Speicherung und Synthese von Polyphosphat in Agrobacterium tumefaciens C58(2021) Hellenbroich, Celina; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr. rer. nat.)Polyphosphat (PolyP) besitzt eine ubiquitäre Verbreitung und erfüllt, je nach Organismus, unterschiedliche und extrem vielfältige Aufgaben. In Prokaryonten liegt PolyP in sogenannten Granula vor, während in einzelligen Eukaryonten, eine Membran das PolyP von dem Cytoplasma abtrennt. Vorangegangene Arbeiten weisen darauf hin, dass sogenannte Acidocalcisomen, eben jene membranumschlossene PolyP-Speicher aus Eukaryonten, auch in dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens vorhanden sein könnten. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch, dass sich in A. tumefaciens, wie in Bakterien übliche, PolyP-Granula befinden, die nicht von einer Membran umschlossen sind. Im weiteren Verlauf wurde die Synthese von PolyP sowie die Lokalisation der Polyphosphatkinasen (PPKs) und anderer aus der Literatur bekannter, PolyP-assoziierter Proteine untersucht. Die PPK1At stellte sich hierbei als PolyP-Syntheseenzym heraus. Es folgte eine biochemische Charakterisierung der PPKs in vitro, bei der für die PPK2At, neben der Bildung von NDP und NTP, eine oligophosphorylierende Funktion bis hin zu nonaphosphorylierten Nukleosiden entdeckt wurde. Außerdem stellte sich heraus, dass das PolyP-Granulum während des Zellzyklus wanderte und vielleicht durch die PPK1At mit der DNA assoziiert sein könnte. Aufgrund dieser Erkenntnisse konnte ein Modell des PolyP-Granulums und den in dieser Arbeit identifizierten, assoziierten Proteinen erstellt werden. Eine Deletion der ppk1 hatte zudem Auswirkungen auf die Zellmorphologie, die Infektionsrate von Pflanzenzellen und die Generationszeit von A. tumefaciens.Item Open Access Development and application of fluorescent reporter assays for the investigation of chromatin regulation(2021) Pinter, Sabine; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)Item Open Access Numerische Simulationen von bioinspirierten und natürlichen Materialien(2021) Schäfer, Immanuel; Schmauder, Siegfried (Prof. Dr. rer. nat. Dr. h. c.)Die Arbeit befasst sich mit Finite-Elemente-Simulationen und Modellierungen von natürlichen und bioinspirierten Materialien. Die bioinspirierten Materialien sind künstliche Materialien, die ein oder mehrere Prinzipien der biologischen Vorbilder erfolgreich umgesetzt haben. Die natürlichen Materialien sind biologischen Ursprungs. Zu Beginn benötigt man immer eine funktionelle Analyse des Systems, um dann die notwendigen Reduzierungen für die Modellierungen herstellen zu können. Wenn das Modell steht, werden Eigenschaften wie zum Beispiel die Dämpfung oder der Widerstand gegen eine lineare Krafteinwirkung in Finite-Elemente-Simulationen analysiert. Die daraus gewonnenen Ergebnisse werden zur Beurteilung des Versagenverhaltens (z. B. des natürlichen Materials) oder zur Erklärung der Eigenschaften des bioinspirierten Materials genutzt. Die vorliegende Arbeit ist in die Analyse und die Diskussion der Ergebnisse verschiedener Materialien in neun Veröffentlichungen unterteilt. Zu Beginn werden die Ergebnisse des ersten bionischen Projektes präsentiert sowie die Lichtaufnahme, Lichtleitung- und Lichtverarbeitungsmöglichkeiten einer sukkulenten Art, der Fensterpflanze diskutiert. Die Perlmuttschale einer Schnecke bzw. ihr bioinspiriertes Produkt ist das Thema der anschließend vorgestellten Arbeiten. Daraus hervor ging auch die Veröffentlichung zu Enzymen und deren Bindungsaffinitäten zu Zinkoxid. Die Schale der Pomelo, die die kiloschwere Frucht beim Herunterfallen von den ca. 15 m hohen Bäumen vor Beschädigungen schützt, ist das Vorbild für einen Metallschaum im nächsten Beispiel. Als letztes werden die Vorbilder Kokosnuss und Seeigelstachel präsentiert, die im Rahmen eines Transregios (einem von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderten Sonderforschungsbereich, TRR 141) betrachtet wurden. Für den TRR 141 wurde auch eine Ausstellung im Naturkundemuseum Stuttgart organisiert. Im Kapitel 12 wird eine Präsentationsstation beschrieben, die mit NFC(Near-Field-Communication)-Chips gesteuert werden kann. Die Präsentationsstation wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt und mit dem Museum zusammen gebaut. Mit ihr werden Filme und Präsentationen zu dem Thema des TRR mit Ausstellungsgegenständen (z. B. eine 3D gedruckte Struktur des Seeigelstachels in Vergrößerung) kombiniert. Auf diese Weise zeigt die vorliegende kumulative Dissertation einen Überblick über die gesamten bionischen Arbeiten, die am Institut für Materialprüfung, Werkstoffkunde und Festigkeitslehre bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Dr. h. c. Siegfried Schmauder mit meiner Beteiligung entstanden sind.Item Open Access Investigation of the interaction of PRMT6 and LEF1/β-catenin in hematopoiesis(2021) Schneider, Lucas; Lausen, Jörn (Prof. Dr.)Item Open Access Enzymkatalysierte regioselektive N-Methylierung und N-Alkylierung von Pyrazolen(2021) Bengel, Ludwig L.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Development of a novel Escherichia coli production platform with uncoupled stringent response(2021) Kahlig, Annette Margarete; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Aerobe Kultivierungsprozesse im großskaligen Industriemaßstab werden oftmals durch gegebene technische Grenzen der Fermentationsanlagen limitiert. Die vorliegende Arbeit präsentiert die genetisch modifizierte Mutante E. coli HGT (‘high glucose throughput’) mit einer ausbalancierten Stringenten Kontrolle, welche eine erhöhte Stresstoleranz unter nährstoffreduzierten Bedingungen zusammen mit einer verstärkten Glukoseaufnahme- und Produktbildungsrate in ruhenden Zellen ermöglicht.Item Open Access Untersuchung der molekularen Determinanten für Fructose-6-phosphat-Aldolasen und Transaldolasen(2021) Stellmacher, Lena; Sprenger, Georg (Prof. Dr.)Die eng verwandten Modellenzyme Transaldolase B (TalB) und Fructose-6-phosphat-Aldolase A (FSAA) von Escherichia coli sind C-C-Bindung-knüpfende Enzyme. Die Transferase TalB katalysiert die Übertragung einer Glyceryl-Einheit von D-Fructose-6-phosphat (D-F6P) auf D-Erythrose-4-phosphat wobei D-Sedoheptulose-7-phosphat (D-S7P) und D-Glycerinaldehyd-3-phosphat (D-GAP) entstehen. Für die Lyase FSAA ist die Additionsreaktion von D-GAP mit Dihydroxyaceton zu D-F6P namensgebend. Die beiden Enzyme sind sich sehr ähnlich, wobei der Austausch von einer Aminosäure zu Aldolaseaktivität in der TalB F178Y führt. Die molekularen Determinanten für die unterschiedlichen Reaktionstypen waren bis zum Beginn dieser Arbeit unklar. In FSAA ist das katalytische Wassermolekül im Aktiven Zentrum durch Wasserstoffbrücken an die Seitenketten von drei Resten (Gln59, Thr109 und Tyr131) gebunden, während in TalB nur zwei Seitenketten (Glu96 und Thr156) beteiligt sind. Die Doppelvariante TalB E96Q F178Y zeigte verbesserte Aldolaseaktivität. Nicht das Wasserstoffbrückennetzwerk des aktiven Wassermoleküls diskriminiert zwischen FSAA und TalB: Die Unterschiede im pKa-Wert des katalytischen Lys und des generellen Säure-Base-Katalysators, sowie die Substratbindung sind die Basis zur Differenzierung zwischen Lyase und Transferase. Der generelle Säure-Base-Katalysator Tyr in Kombination mit der Stereochemie am C4-Atom von D-T6P resultieren in der Inhibition von Enzymen mit F6P-Aldolaseaktivität. Beschrieben ist dies hier vorliegend in den Mechanismuspostulaten für die TalB, die FSAA und der Inhibition.Item Open Access Regulation of basal and activity-mediated AMPAR endocytosis by Protein Kinase D (PKD)(2021) Oueslati Morales, Carlos Omar; Hausser, Angelika (PD Dr.)AMPARs are one of the four different types of glutamate-gated ion channels in the mammalian brain, allowing influx of Na+ and efflux of K+ and thus depolarisation of the neuronal membrane. They are critical for correct brain functioning, as they represent the main mediators of excitatory synaptic transmission and as such are key for intercellular communication, brain development and, importantly, learning and memory. AMPARs are highly motile, undergoing constitutive and activity-mediated endocytosis, recycling and surface lateral diffusion among their different cellular pools. Notably, regulation of this trafficking is instrumental to mediate long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD), cellular mechanisms of synaptic plasticity, which promote a long-lasting enhancement or decrease in synaptic strength, respectively, and are widely believed to be the main contributors to learning and memory. However, the mechanisms behind that regulation are not fully understood yet. The protein kinase D family of serine/threonine kinases consists of three isoforms in mammalian cells, and is activated downstream of DAG and PKC to participate in the regulation of processes such as vesicle fission from the trans-Golgi network and actin cytoskeleton remodelling. All three isoforms are expressed in neurons from an early embryonic stage, where they modulate tissue-specific processes such as the establishment and maintenance of neuronal polarity, neuroprotection against early oxidative stress and, importantly, synaptic plasticity through stabilisation of filamentous actin via cofilin inactivation during the expression of LTP and the phosphorylation of remaining surface NMDARs during the expression of LTD. Despite these observations, PKD has not been linked yet to AMPAR trafficking regulation. Therefore, in this thesis I aimed to elucidate whether PKD controls AMPAR trafficking in primary neuronal cells in basal and/or in activity-mediated conditions, and to shed light on the molecular mechanism that underlies this regulation. This work presents compelling evidence that PKD acts as a promoter of AMPAR endocytosis in primary hippocampal neurons in both basal and activity-mediated conditions. Short-term pharmacological inhibition of PKD via treatment with the small-molecule inhibitor CRT0066101 led to an increase in surface and synaptic AMPAR levels and slowed down AMPAR surface trafficking dynamics. Conversely, expression of a constitutively active PKD mutant promoted a decrease in AMPAR synaptic levels while increasing its localisation at early endosomes. Moreover, it was found that PKD activity is necessary for the decrease in surface AMPAR levels in response to both agonist- and NMDA treatments. Finally, I provide evidence that phosphorylation of the PKD substrate and Rab5 effector Rabaptin-5 at S407, the PKD phosphorylation site, is necessary for the correct regulation of basal AMPAR synaptic levels and for the endocytosis of AMPAR in response to NMDA treatment. Together, these findings identify PKD as a novel regulator of AMPAR endocytosis, presumably through the phosphorylation of Rabapatin-5 and subsequent Rab5 activation.