Universität Stuttgart
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Item Open Access Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.Item Open Access Molekulare Grundlagen der Stereoselektivität Lipase-katalysierter Umsetzungen(2001) Schulz, Tanja; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lipase aus Pseudomonas cepacia ist ein ausgezeichnetes Enzym in der kinetischen Racemattrennung sekundärer Alkohole. Die Stereopräferenz beruht ausschließlich auf der Substratstruktur der Enantiomere, während die Stereoselektivität auf atomaren Wechselwirkungen zwischen Substrat und Lipase beruht. 30 sekundäre Alkohole mit veröffentlichten E-Werten wurden gewählt. Modelle der Ester wurden kovalent in die Bindestelle der Lipase gebunden. Die beiden Enantiomere von 27 Substraten bevorzugten eine von zwei Bindungsmodi: das schnell-umgesetzte Enantiomer in einem produktiven, das langsam-umgesetzte Enantiomer in einem nicht-produktiven Bindungsmodus. Der produktive Bindungsmodus langsam-umgesetzter Enantiomere wird durch abstoßende Wechselwirkungen mit einer starren Wand nahe der Oxyanionen-Bindetasche gestört. Als Folge drückt das Substrat das aktive Histidin aus einer katalytisch effektiven Orientierung und der Abstand d(HNe-Oalc) zwischen Histidin und dem Alkohol-Sauerstoffatom nimmt zu. d(HNe-Oalc) korreliert mit experimentell ermittelten E-Werten: Substrate, die mit der Lipase aus P. cepacia mit hohen E-Werten umgesetzt werden (E > 100), weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) > 2.2 Å auf und eine effektive Katalyse des Enantiomers wird unterbunden. Substrate mit niederer Selektivität (E < 20) weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) < 2.0 Å auf. In diesem Fall werden beide Enantiomere mit ähnlichen Reaktionsraten umgesetzt. Eine vergleichbare Abhängigkeit des Abstands d(HNe-Oalc) und experimentell bestimmten E-Werten wurde für chirale Amine festgestellt. Der Abstand d(HNe-Oalc) ist auch ein entscheidender Parameter in Umsetzungen chiraler, sekundärer Alkohole mit zwei benachbarten Stereozentren mit der Lipase aus Candida rugosa. Die in silico Einführung von Punktmutationen in die Bindestelle der Lipase aus P. cepacia führte z.B. für die Einfachmutante Y29L zu einem verlängerten Abstand d(HNe-Oalc). Die erwartete Steigerung des E-Wertes konnte experimentell bestätigt werden.Item Open Access Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology(2005) Grimm, Verena Ulrike; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals. In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.Item Open Access Selektive Hydroxylierung von alpha- und beta-Ionon durch Streptomyces Stämme und molekulargenetische Arbeiten zur Identifizierung und Isolierung der Ionon-Hydroxylase aus Streptomyces fradiae Tü 27(1999) Lutz-Wahl, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit sollten α- bzw. β-Ionon durch selektive Hydroxylierung mittels Mikroorganismen zu 3-Hydroxyiononen umgesetzt werden, um einen Baustein für die chemisch-enzymatische Synthese von Astaxanthin und Zeaxanthin zu liefern. Über 200 Streptomyceten-Stämme wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, β- und/oder α-Ionon regio- und stereoselektiv zu den jeweiligen 3-Hydroxy-Derivaten umzusetzen. Mit β-Ionon als Substrat zeigten 19 Stämme Umsetzung zu 4-Hydroxy- und nicht zum gewünschten 3-Hydroxy-β-ionon. Unter diesen 19 Stämmen setzten sechs α-Ionon zu 3-Hydroxy-α-ionon um. S. fradiae Tü 27 zeigte mit 75 % die größte Umsatzrate. Aufgrund von GC- und NMR-Daten konnte gezeigt werden, daß die Hydroxylierung von racemischem α-Ionon [(6R)-(-) / (6S)-(+)] nur die Bildung der zwei Enantiomere (3R,6R)- und (3S,6S)-Hydroxy-α-ionon ergab. Die enzymatische Hydroxylierung von α-Ionon durch die getesteten Streptomyceten-Stämme findet sowohl mit einer hohen Regio- als auch mit einer hohen Stereoselektivität statt. Um die Gene, die für diese Hydroxylase kodieren, zu isolieren, wurden P450-Genfragmente aus S. fradiae Tü 27 amplifiziert und sequenziert. Hier konnten zwei P450 Genfragmente identifiziert werden. Die Isolierung der vollständigen P450-homologen Gene mit unterschiedlichen Methoden gelang jedoch nicht. Um nun eine Aussage darüber treffen zu können, ob eines der beiden P450-Genfragmente aus dem Stamm Streptomyces fradiae Tü 27 die Hydroxylase kodiert, die die selektive Hydroxylierung des α-Ionons katalysiert, wurden die P450 homologen Gene durch Integrationsmutagenese inaktiviert. Die Mutanten wurden für die Umsetzung von α-Ionon eingesetzt. Während mit der Integrationsmutante GMP450-27Q eine Umsetzung zu 3-Hydroxy-α-ionon stattfand, allerdings mit Nebenprodukt, konnte mit GMP450-27P keine selektive Hydroxylierung zu 3-Hydroxy-α-ionon nachgewiesen werden. Somit scheint P450-27P für die selektive Hydroxylierung von α-Ionon verantwortlich zu sein.Item Open Access Biochemische Nachweisverfahren auf der Basis genetischer Regulationselemente: vom Reporterassay zum Repressor/DNA-Bindungstest(2000) Köhler, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)In der vorliegenden Arbeit wurde auf der Grundlage von genetischen Regulationselementen ein in vivo Assay und vergleichend hierzu ein in vitro Assay entwickelt. Ein rekombinanter E. coli Stamm wurde beim in vivo Reporterassay zur Detektion von 4-CBA verwendet, der bei Anwesenheit von 4-CBA Luziferase exprimiert. Durch Immobilisierung dieses Stammes konnte ein einfaches und spezifisches Testverfahren im Mikrotiterplattenformat entwickelt werden. Mit den optimierten Immobilisierungsbedingungen und der Verwendung einer Membranmutante von E. coli konnte ein Detektionslimit von 28 µM 4-CBA in 200 min erreicht werden. Zusätzlich wurde ein von den Eigenschaften der Zelle unabhängiges in vitro Assaysystem entwickelt. Da der Mechanismus der Tetrazyklinresistenz in Bakterien bekannt war, wurde Tetrazyklin als Analyt ausgewählt. Im neu zu entwickelnden Assay sollte der durch Tetrazyklin induzierte Abfall des Repressors von der Operator DNA zur quantitativen Bestimmung von Tetrazyklin benutzt werden. Dazu wurde der Tet Repressor mit N-terminal oder C-terminal fusioniertem Tag und nativ in E. coli überexprimiert. Die Funktionalität der Repressoren wurde im Gel-Mobility-Shift Assay untersucht. Nur der Repressor ohne Tag sowie der Repressor mit einem durch Proteaseverdau abgespaltenem Tag zeigten volle biologische Aktivität. Im Hinblick auf eine spätere Assay-Entwicklung wurde der Einfluß eines enzymatischen Markers auf die Repressor/Operator-DNA-Bindung mit derselben Methode getestet. Daraus folgte eine Versuchsdurchführung für den Mikrotiterplatten-Assay. Diese beeinhaltete die Immobilisierung des Repressors, die Bindung von Tetrazyklin an diesen und die Bindung POD markierter Operator-DNA an tetrazyklinfreie Repressoren. Die Bestimmung der POD Aktivität ließ Rückschlüsse auf die vorhandene Tetrazyklinkonzentration zu. Da dieses Assayformat mit sehr großen Standardabweichungen verbunden war, wurden markerfreie Oberflächenplasmonresonanzmessungen vorgenommen.Item Open Access DNA microarray based gene expression profiling in human hepatocyte cells to serve as a basis for dynamic modelling of the human liver : a systems biology approach(2008) Reichart, Thomas; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)This thesis provides a holistic overview over the gene expression pattern in human hepatocyte cells after induction with rifampicin. The expression levels of all human genes were determined using full genome microarrays from Affymetrix after several points in time (6, 24 and 72 h) after induction in three individual patients. In addition 151 liver specific genes were monitored more frequently using sub-genome Arrays from Eppendorf. The results were confirmed by Realtime PCR and Western-Blot analysis. Identified genes play a role in carbon metabolism (gluconeogenesis), in heme biosynthesis, in bulirubin-, bile acid- and lipid metabolism as well as xenobiotic-metabolism and transport. The observed cell response on RNA level over time allowed new insights in the regulation of this complex system. Next to the network reconstruction, based on the full genome array data, the highly time resolved measurements enable dynamic modelling of expression and therefore a mathematical reproduction of the cellular response upon the stimulus. Using the developed models predictions concerning the behaviour of the "system hepatocyte" and the associated regulations will be possible in the future. This model based prognosis will especially allow improved drug development and personalized medicine.Item Open Access Overexpression and protein engineering of lipase A and B from Geotrichum candidum CMICC335426(1999) Catoni, Elisabetta; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im wachsenden Interesse an Produkten mit geringerem Gehalt an gesättigten Fettsäuren liegt die Bedeutung der Lipase B von Geotrichum candidum, die eine hohe Spezifität für Fettsäureester von cis-D9 ungesättigten Verbindungen zeigt. Die Lipase B und die hochhomologe Lipase A aus Geotrichum candidum wurden erfolgreich in Saccharomyces cerevisiae exprimiert, mit einer Ausbeute von 6-8 U/(ml Medium). Die Lipasen wurden funktionell und in hoher Ausbeute auch in Pichia pastoris exprimiert. Da ausschließlich die rekombinanten Proteine von dieser Hefe sekretiert werden, liegen die Proteine bereits in nahezu reiner Form im Medium vor. Die Fermentationen der rekombinanten Lipase B wurden unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Das beste Ergebnis (600.000 U/l Kultur der reinen Lipase B) wurde in einer Hochzelldichtefermentation in billigerem synthetischem Medium erzielt. Die rekombinanten Lipasen A und B wurden hinsichtlich Substratspezifität, Temperatur- und pH-Einfluß charakterisiert. Diese Eigenschaften sind ähnlich wie die der nativen Lipasen A und B von Geotrichum candidum. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B. Dazu wurden Zufallsmutagenese, Punktgerichtete-Mutagenese und Immobilisierung durchgeführt. Durch Zufallsmutagenese und Punktgerichtete-Mutagenese konnten keine Mutanten mit erhöhter Thermostabilität identifiziert werden, während die Immobilisierung auf jeder der verwendeten Matrixen zur Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B führte. Die Halbwertszeit des Enzyms bei einer Temperatur von 50 °C konnte von 30 Minuten für die gelöste Lipase auf bis zu mehreren Stunden für die immobilisierte gesteigert werden. Die Überexpression der Lipase B in Pichia pastoris ermöglicht zusammen mit der entwickelten Immobilisierungsmethode eine billige Nutzung des Enzyms in industriellem Maßstab, beispielsweise zur Modifikation der Zusammensetzung von Ölen.Item Open Access Isolierung des humanen Lactasegens und seine Expression in der Hefe Pichia pastoris(2002) Bethge, Rut; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) katalysiert bei der Verdauung die hydrolytische Spaltung des Milchzuckers Lactose in Glucose und Galactose. Dieses Enzym ist im Bürstensaum des Dünndarms der Säugetiere lokalisiert. Seine Aktivität wird nach dem Ende der Laktationsphase sehr stark gesenkt, bzw. die Synthese in Teilabschnitten des Darms eingestellt, was eine Lactoseintoleranz bei 75 % der Weltbevölkerung zur Folge hat. Eine Ausnahme stellen hierbei Nordeuropäer und einige afrikanische Völker mit traditionellem Konsum von Milch und Milchprodukten dar. Mit dem Lactosemetabolismus sind unter anderem die Stoffwechselkrankheiten Milchunverträglichkeit, die durch einen Defekt in der Lactase-Synthese zustandekommt, und Galactosämie, die auf dem genetischen Defekt der Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase (GALT) beruht, verbunden. Während die Symptome, Durchfall und Erbrechen, der Milchunverträglichkeit weniger schwerwiegend sind, führt der Verlauf von Galactosämie unbehandelt zu geistiger Zurückgebliebenheit und in vielen Fällen zum Tod. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Entwicklung denkbarer Behandlungsstrategien der Galaktosämie durchgeführt. Der Grundgedanke ist, die negativen Folgewirkungen der Galactosämie durch Hemmung des ersten Enzyms des Lactosemetabolismus, der LPH, unter Akzeptanz der Folgen einer Milchunverträglichkeit, zu unterbinden. Hierbei kamen unterschiedliche Glycosidaseinhibitoren zum Einsatz. Erstens wurde die humane Lactase-Phlorizin-Hydrolase in Pichia pastoris exprimiert und die Quantifizierbarkeit ihrer Lactaseaktivität in dem Test auf Disaccharidase-Aktivität nach Dahlqvist untersucht. Zweitens wurde die Anwendbarkeit des Testsystems zur Charakterisierung einer LPH-Hemmung im Allgemeinen, bzw. zur Suche nach neuen spezifischen LPH-Inhibitoren untersucht. Die LPH wurde aus menschlichen Dünndarmgewebeproben isoliert. Dazu wurde ihre Gesamt-RNA isoliert, die mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt wurde. Daraus konnten durch PCR sowohl die Lactase-, als auch die Phlorizin-Hydrolase-Domäne der LPH amplifiziert werden. Durch den Vergleich ihrer DNA-Sequenzen mit der 1988 von Mantei et al. veröffentlichten Sequenz der LPH ergaben sich in beiden Domänen jeweils 6 Basenabweichungen, von denen angenommen wurde, dass es sich dabei um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) handelt. Die Gesamt-LPH wurde durch Zusammenfügen der beiden Einzeldomänen mittels "Overlap-Extension" erhalten. Bei der Sequenzierung der Gesamt-LPH ergaben sich vor allem im hinteren Bereich, am 3'-Ende, Basenabweichungen, die in den ursprünglichen Einzeldomänen nicht vorhanden waren. Es muß demnach davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen Variationen nicht um SNPs sondern um Mutationen handelt. Sowohl die einzelnen Domänen, als auch die Gesamt-LPH wurden in dem eukaryotischen System der Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe des Testes auf Disaccharidaseaktivität nach Dahlqvist auf ihre Lactose-Hydrolyse-Aktivität untersucht. Das Verfahren wurde dabei auf eine Anwendung im Mikromaßstab modifiziert. Während die exprimierte Phlorizin-Hydrolase-Domäne alleine nur geringe Lactaseaktivität zeigte, konnte nach Expression der Lactase-Domäne, sowie der Gesamt-LPH deren hydrolytische Aktivität nachgewiesen werden. Die Lactaseaktivität konnte somit der Lactase-Domäne zugeordnet werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz aktiv. Die Expression in Pichia pastoris ermöglicht es demnach, die Aktivität von Varianten der LPH auf einfache Art und Weise zu testen. Zur Durchführung weiterer Experimente sollte ein mutationsfreies Gen hergestellt werden, um einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, und festzustellen, wie viele Polymorphismen das Gen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modifizierte Dahlqvist-Test eingesetzt, um Verbindungen auf ihre hemmende Wirkung auf die Lactase-Phlorizin-Hydrolase, bzw. ihre Einzeldomänen, zu prüfen. Mit Phlorizin, einem Lactasehemmer, konnte die Zuverlässigkeit des Tests bestätigt werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der Literatur für Inhibitionsversuche geeignet. Das Testsystem erlaubt somit die gezielte Durchmusterung synthetisch hergestellter Verbindungen auf deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Lactaseaktivität und die Untersuchung der Wirkungsweise von Inhibitoren auf verschiedene Varianten der LPH. Auch für einen von dem Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart synthetisch hergestellten ß-Glucosidase- und ß-Galactosidase-Inhibitor konnte eine Hemmung der Lactaseaktivität festgestellt werden. Eine weitere, gezielte Durchmusterung von Verbindungen mit Hilfe des etablierten Systems könnte somit zur Charakterisierung neuer Inhibitoren führen und alternative Ansätze zur therapeutischen Behandlung von Galaktosämie eröffnen.Item Open Access Untersuchung von Lipasen - Elektrostatik, Selektivität und Einfluss von Lösungsmitteln auf Struktur und Dynamik(2008) Trodler, Peter; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Lipasen katalysieren die Hydrolyse von Estern und die Veresterung. Lipasen sind Biokatalysatoren mit hoher Selektivität, einem breiten Substratspektrum unter milden Bedingungen und sind wichtig in der Anwendung in organischen Synthesen. Ein Merkmal der meisten Lipasen ist die Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Die meisten Lipasen haben einen Deckel, das lid, ein bewegliches Strukturelement das den Zugang zum aktiven Zentrum verschließt. Die Grenzflächenaktivierung ist verbunden mit einem Konformationsübergang von der geschlossenen zur offenen Konformation. Bei Kontakt an eine hydrophobe Grenzfläche wird das lid geöffnet und erlaubt dem Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum. Die Eigenschaften von Lipasen, wie Temperaturstabilität, Selektivität oder Aktivität ändern sich beim Wechsel des Lösungsmittels. In dieser Arbeit wurde der Einfluss organischer Lösungsmittel auf die Struktur und die Dynamik von Lipasen durch Simulationen untersucht. Candida antarctica Lipase B (CALB) ist die wichtigste Lipase in der industriellen organischen Synthese. Im Gegensatz zu den meisten anderen Lipasen hat CALB kein lid und zeigt keine Grenzflächenaktivierung. CALB ist in organischem Lösungsmittel stabil und kann Reaktionen bei höheren Temperaturen katalysieren. Durch Simulationen sollte das Verhalten von CALB in den Lösungsmitteln Methanol, Chloroform, Isopentan, Cyclohexan, Toluol und Wasser untersucht werden. Die Struktur war in allen Lösungsmitteln stabil. Das umgebende Lösungsmittel hatte einen großen Einfluss auf die Flexibilität von CALB, bei einer höheren Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels nahm die Flexibilität zu. Bei kleineren Dielektrizitätskonstanten des Lösungsmittels nahm die Zahl der an die Oberfläche gebundenen Wassermoleküle zu. Durch die größere Zahl an langsam ausgetauschten Wassermolekülen an der Oberfläche bildete sich ein umspannendes Wassernetzwerk. Der Grund der verringerten Flexibilität von CALB in unpolaren Lösungsmitteln war die geringere Beweglichkeit von Wassermolekülen an der Oberfläche und deren langsamerer Austausch. Burkholderia cepacia Lipase (BCL) wurde in Simulationen untersucht. BCL hat ein lid und zeigt Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Zur Untersuchung der Grenzflächenaktivierung wurden Simulationen der offenen und geschlossenen Konformation von BCL in Wasser und Toluol durchgeführt. In der geschlossenen Konformation von BCL in Wasser blieb das lid geschlossen. In Simulationen von geschlossenem BCL in Toluol wurde die Öffnung des lids beobachtet. Die vollständige Öffnung des lids wurde in der Simulation durch Helix α6 blockiert und verhinderte die weitere Bewegung von Helix α5 zur geöffneten Konformation. In der Simulation von offenem BCL in Wasser wurde eine Schließbewegung des lids beobachtet die durch Wechsel des Lösungsmittels reversibel war. In der Simulation der offenen Kristallstruktur in Toluol zeigte das lid eine etwas weitere Öffnung als zu Beginn der Simulation. Kristallkontakte verhindern eine vollständig geöffnete Konformation in der Kristallstruktur. Theoretische Untersuchungen wurden auch mit der experimentellen Arbeit verbunden. Durch rationales Design wurde eine neue einstufige Aufreinigungsmethode für CALB entwickelt. Im Allgemeinen können Lipasen durch Ionen-Austausch Chromatographie aufgereinigt werden. CALB konnte jedoch bisher nicht auf Säulen in der Ionen-Austausch Chromatographie oder der Hydrophoben-Interaktions Chromatographie unter den verwendeten Bedingungen gebunden werden. Bei der elektrostatischen Charakterisierung von CALB wurde ein breiter isoelektrischer Bereich, an Stelle eines isoelektrischen Punkts gefunden. Eine einstufige Aufreinigungsmethode durch Ionen-Austausch Chromatographie für CALB mit Bindung bei pH 3 wurde entwickelt. Das rationale Design einer Aufreinigungsmethode kann auch zur Entwicklung von Aufreinigungsmethoden anderer Proteine verwendet werden. Acrylierung dient zur Einführung von Vernetzungs-Funktionalität in Verbindungen. Chemische Prozesse zur Herstellung von acrylierten Estern bei hohen Temperaturen führen gleichzeitig zur teilweisen Polymerisierung der acrylischen Doppelbindungen. Die Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten sollte für einen biotechnologischen Prozess durch CALB etabliert werden. Die Methode des rationalen Designs wurde zur Erhöhung der Aktivität der Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten durch CALB bis zur vollständigen Umsetzung verwendet. Hydroxypropylcarbamat besteht aus zwei Enantiomerenpaaren von denen ein Enantiomer von CALB kaum acryliert wird. Das schlecht umgesetzte Substrat wurde durch Modellierung identifiziert und Mutanten mit höherer Aktivität vorgeschlagen. Die zur Vergrößerung der Bindetasche des sekundären Alkohols vorgeschlagenen Mutanten an Position 278 waren in der Hydrolyse von Tributyrin und der Acrylierung aktiver als der WT.Item Open Access Cloning, expression, characterization and engineering of cytochrome P450 CYP116B3 from Rhodococcus ruber DSM 44319(2007) Liu, Luo; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The Cytochrome P450 monooxygenases are ubiquitous heme-containing proteins, which catalyze regio- and stereo-selective oxidations of non-activated hydrocarbon. Bacterial P450 enzymes are in most cases not membrane-associated, water soluble and exhibit relatively high stability. Several bacterial strains have been tested for their monooxygenase activity. During the in vivo screening, Rhodoccocus ruber DSM 44319 and Rhodococcus erythropolis DSM 43066 strains exhibited oxidation activity towards cyclohexane. Because the genome DNA sequence of the two Rhodococcus strains has not been sequenced, a homology search was applied using known P450 gene sequences from other Rhodococcus strains. A set of degenerate primers was designed to the most similar regions, identified through the DNA sequence alignment of P450RhF from Rhodococcus sp. NCIMB 9784 and P450 CYP116 from Rhodococcus sp. NI86/21. A P450-like gene fragment with 740 base pairs was amplified from Rhodococcus ruber DSM 44319 by PCR using these degenerate primers. The flanking regions of the P450-like DNA fragment were explored by directional genome walking using PCR combined TA-cloning. The entire P450 gene with 2313 bp was isolated. It encodes a protein of 771 amino acids. The primary protein structure suggests that it is a natural self-sufficient fusion protein consisting of a P450 monooxygenase domain, a flavin-containing reductase domain, and a [2Fe2S] ferredoxin domain. This new P450 gene from Rhodococcus ruber DSM 44319 was named by P450 nomenclature committee CYP116B3 and can be considered as a new member of class IV of cytochrome P450 monooxygenases. The cytochrome P450 monooxygenase CYP116B3 was successfully cloned into vector pET28a(+), and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Subsequently, the enzyme was purified using immobilized metal affinity chromatography with a total yield of 18.6 mg l-1 and purity of 85%. Thin layer chromatography detected only FMN within the reductase domain, as the sequence alignment had predicted. The reductase activity was determined using an exogenous electron acceptor cytochrome c. The reductase domain of this P450 CYP116B3 demonstrated a strong preference for NADPH over NADH. As well as P450RhF, P450 CYP116B3 catalyzed O-dealkylation of 7-ethoxycoumarin gave product 7-hydroxycoumarin. Furthermore, in the presence of NADPH, the P450 CYP116B3 demonstrated hydroxylation activity towards aromatic hydrocarbons, naphthalene, indene, acenaphthene, toluene, fluorene, m-xylene and ethyl benzene. The conversion of naphthalene, acenaphthene and fluorene resulted in respective ring monohydroxylated metabolites. Alkyl aromatics like toluene, m-xylene and ethyl benzene were hydroxylated exclusively at the side chains. The highest turnover rate catalyzed by wild-type P450 CYP116B3 is about 1 nmol of 7-ethoxyxoumarin converted per 1 nmol of P450 CYP116B3 per minute. Compare to P450 BM-3, the activity of P450 CYP116B3 is very low. In order to investigate the structure-function relationship, a structure model of P450 CYP116B3 was designed based on the known homologous structures. The position 109 was identified which is located on the ceiling of the substrate binding pocket. The substitution of alanine residue at position 109 by phenylalanine may promote binding and oxidation of smaller alkyl substrates, such as cyclohexane or alpha-pinene. However after the substitution no oxidation activity towards smaller substrates was detected. Only an increase of activity towards 7-ethoxycoumarin and PAHs was observed. Directed evolution provides a useful tool to explore enzyme functions without structural information. Therefore, directed evolution was carried out in this study to improve the enzyme activity. The mutagenesis was limited to the monooxygenase domain of CYP116B3. A mutation library was generated by error-prone PCR. A high throughput screening system was developed based on the O-dealkylation of 7-ethoxycoumarin using whole E. coli cells, which expressed the enzyme in 96-well microtiter plates. Finally, the two best mutants, 70A08 (A86T/T91S/A109F/I179F/I267L) and 74H10 (T91S/A109L/I179F/I267L) were identified after four error-prone PCR rounds with 100-fold increased O-dealkylation activity towards 7-ethoxycoumarin. To investigate the alteration of the substrate spectrum of the two mutants, a wide rang of potential substrates was tested, including known substrates of the wild-type CYP116B3. However, 70A08 and 74H10 did not show increased activity towards any substrate besides 7-ethoxycoumarin.