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Molekulare Grundlagen der Stereoselektivität Lipase-katalysierter Umsetzungen
(2001) Schulz, Tanja; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Die Lipase aus Pseudomonas cepacia ist ein ausgezeichnetes Enzym in der kinetischen Racemattrennung sekundärer Alkohole. Die Stereopräferenz beruht ausschließlich auf der Substratstruktur der Enantiomere, während die Stereoselektivität auf atomaren Wechselwirkungen zwischen Substrat und Lipase beruht. 30 sekundäre Alkohole mit veröffentlichten E-Werten wurden gewählt. Modelle der Ester wurden kovalent in die Bindestelle der Lipase gebunden. Die beiden Enantiomere von 27 Substraten bevorzugten eine von zwei Bindungsmodi: das schnell-umgesetzte Enantiomer in einem produktiven, das langsam-umgesetzte Enantiomer in einem nicht-produktiven Bindungsmodus. Der produktive Bindungsmodus langsam-umgesetzter Enantiomere wird durch abstoßende Wechselwirkungen mit einer starren Wand nahe der Oxyanionen-Bindetasche gestört. Als Folge drückt das Substrat das aktive Histidin aus einer katalytisch effektiven Orientierung und der Abstand d(HNe-Oalc) zwischen Histidin und dem Alkohol-Sauerstoffatom nimmt zu. d(HNe-Oalc) korreliert mit experimentell ermittelten E-Werten: Substrate, die mit der Lipase aus P. cepacia mit hohen E-Werten umgesetzt werden (E > 100), weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) > 2.2 Å auf und eine effektive Katalyse des Enantiomers wird unterbunden. Substrate mit niederer Selektivität (E < 20) weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) < 2.0 Å auf. In diesem Fall werden beide Enantiomere mit ähnlichen Reaktionsraten umgesetzt. Eine vergleichbare Abhängigkeit des Abstands d(HNe-Oalc) und experimentell bestimmten E-Werten wurde für chirale Amine festgestellt. Der Abstand d(HNe-Oalc) ist auch ein entscheidender Parameter in Umsetzungen chiraler, sekundärer Alkohole mit zwei benachbarten Stereozentren mit der Lipase aus Candida rugosa. Die in silico Einführung von Punktmutationen in die Bindestelle der Lipase aus P. cepacia führte z.B. für die Einfachmutante Y29L zu einem verlängerten Abstand d(HNe-Oalc). Die erwartete Steigerung des E-Wertes konnte experimentell bestätigt werden.
Open Access
Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology
(2005) Grimm, Verena Ulrike; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals. In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.
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Biochemische Nachweisverfahren auf der Basis genetischer Regulationselemente: vom Reporterassay zum Repressor/DNA-Bindungstest
(2000) Köhler, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
In der vorliegenden Arbeit wurde auf der Grundlage von genetischen Regulationselementen ein in vivo Assay und vergleichend hierzu ein in vitro Assay entwickelt. Ein rekombinanter E. coli Stamm wurde beim in vivo Reporterassay zur Detektion von 4-CBA verwendet, der bei Anwesenheit von 4-CBA Luziferase exprimiert. Durch Immobilisierung dieses Stammes konnte ein einfaches und spezifisches Testverfahren im Mikrotiterplattenformat entwickelt werden. Mit den optimierten Immobilisierungsbedingungen und der Verwendung einer Membranmutante von E. coli konnte ein Detektionslimit von 28 µM 4-CBA in 200 min erreicht werden. Zusätzlich wurde ein von den Eigenschaften der Zelle unabhängiges in vitro Assaysystem entwickelt. Da der Mechanismus der Tetrazyklinresistenz in Bakterien bekannt war, wurde Tetrazyklin als Analyt ausgewählt. Im neu zu entwickelnden Assay sollte der durch Tetrazyklin induzierte Abfall des Repressors von der Operator DNA zur quantitativen Bestimmung von Tetrazyklin benutzt werden. Dazu wurde der Tet Repressor mit N-terminal oder C-terminal fusioniertem Tag und nativ in E. coli überexprimiert. Die Funktionalität der Repressoren wurde im Gel-Mobility-Shift Assay untersucht. Nur der Repressor ohne Tag sowie der Repressor mit einem durch Proteaseverdau abgespaltenem Tag zeigten volle biologische Aktivität. Im Hinblick auf eine spätere Assay-Entwicklung wurde der Einfluß eines enzymatischen Markers auf die Repressor/Operator-DNA-Bindung mit derselben Methode getestet. Daraus folgte eine Versuchsdurchführung für den Mikrotiterplatten-Assay. Diese beeinhaltete die Immobilisierung des Repressors, die Bindung von Tetrazyklin an diesen und die Bindung POD markierter Operator-DNA an tetrazyklinfreie Repressoren. Die Bestimmung der POD Aktivität ließ Rückschlüsse auf die vorhandene Tetrazyklinkonzentration zu. Da dieses Assayformat mit sehr großen Standardabweichungen verbunden war, wurden markerfreie Oberflächenplasmonresonanzmessungen vorgenommen.
Open Access
Isolierung des humanen Lactasegens und seine Expression in der Hefe Pichia pastoris
(2002) Bethge, Rut; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) katalysiert bei der Verdauung die hydrolytische Spaltung des Milchzuckers Lactose in Glucose und Galactose. Dieses Enzym ist im Bürstensaum des Dünndarms der Säugetiere lokalisiert. Seine Aktivität wird nach dem Ende der Laktationsphase sehr stark gesenkt, bzw. die Synthese in Teilabschnitten des Darms eingestellt, was eine Lactoseintoleranz bei 75 % der Weltbevölkerung zur Folge hat. Eine Ausnahme stellen hierbei Nordeuropäer und einige afrikanische Völker mit traditionellem Konsum von Milch und Milchprodukten dar. Mit dem Lactosemetabolismus sind unter anderem die Stoffwechselkrankheiten Milchunverträglichkeit, die durch einen Defekt in der Lactase-Synthese zustandekommt, und Galactosämie, die auf dem genetischen Defekt der Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase (GALT) beruht, verbunden. Während die Symptome, Durchfall und Erbrechen, der Milchunverträglichkeit weniger schwerwiegend sind, führt der Verlauf von Galactosämie unbehandelt zu geistiger Zurückgebliebenheit und in vielen Fällen zum Tod. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Entwicklung denkbarer Behandlungsstrategien der Galaktosämie durchgeführt. Der Grundgedanke ist, die negativen Folgewirkungen der Galactosämie durch Hemmung des ersten Enzyms des Lactosemetabolismus, der LPH, unter Akzeptanz der Folgen einer Milchunverträglichkeit, zu unterbinden. Hierbei kamen unterschiedliche Glycosidaseinhibitoren zum Einsatz. Erstens wurde die humane Lactase-Phlorizin-Hydrolase in Pichia pastoris exprimiert und die Quantifizierbarkeit ihrer Lactaseaktivität in dem Test auf Disaccharidase-Aktivität nach Dahlqvist untersucht. Zweitens wurde die Anwendbarkeit des Testsystems zur Charakterisierung einer LPH-Hemmung im Allgemeinen, bzw. zur Suche nach neuen spezifischen LPH-Inhibitoren untersucht. Die LPH wurde aus menschlichen Dünndarmgewebeproben isoliert. Dazu wurde ihre Gesamt-RNA isoliert, die mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt wurde. Daraus konnten durch PCR sowohl die Lactase-, als auch die Phlorizin-Hydrolase-Domäne der LPH amplifiziert werden. Durch den Vergleich ihrer DNA-Sequenzen mit der 1988 von Mantei et al. veröffentlichten Sequenz der LPH ergaben sich in beiden Domänen jeweils 6 Basenabweichungen, von denen angenommen wurde, dass es sich dabei um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) handelt. Die Gesamt-LPH wurde durch Zusammenfügen der beiden Einzeldomänen mittels "Overlap-Extension" erhalten. Bei der Sequenzierung der Gesamt-LPH ergaben sich vor allem im hinteren Bereich, am 3'-Ende, Basenabweichungen, die in den ursprünglichen Einzeldomänen nicht vorhanden waren. Es muß demnach davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen Variationen nicht um SNPs sondern um Mutationen handelt. Sowohl die einzelnen Domänen, als auch die Gesamt-LPH wurden in dem eukaryotischen System der Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe des Testes auf Disaccharidaseaktivität nach Dahlqvist auf ihre Lactose-Hydrolyse-Aktivität untersucht. Das Verfahren wurde dabei auf eine Anwendung im Mikromaßstab modifiziert. Während die exprimierte Phlorizin-Hydrolase-Domäne alleine nur geringe Lactaseaktivität zeigte, konnte nach Expression der Lactase-Domäne, sowie der Gesamt-LPH deren hydrolytische Aktivität nachgewiesen werden. Die Lactaseaktivität konnte somit der Lactase-Domäne zugeordnet werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz aktiv. Die Expression in Pichia pastoris ermöglicht es demnach, die Aktivität von Varianten der LPH auf einfache Art und Weise zu testen. Zur Durchführung weiterer Experimente sollte ein mutationsfreies Gen hergestellt werden, um einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, und festzustellen, wie viele Polymorphismen das Gen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modifizierte Dahlqvist-Test eingesetzt, um Verbindungen auf ihre hemmende Wirkung auf die Lactase-Phlorizin-Hydrolase, bzw. ihre Einzeldomänen, zu prüfen. Mit Phlorizin, einem Lactasehemmer, konnte die Zuverlässigkeit des Tests bestätigt werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der Literatur für Inhibitionsversuche geeignet. Das Testsystem erlaubt somit die gezielte Durchmusterung synthetisch hergestellter Verbindungen auf deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Lactaseaktivität und die Untersuchung der Wirkungsweise von Inhibitoren auf verschiedene Varianten der LPH. Auch für einen von dem Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart synthetisch hergestellten ß-Glucosidase- und ß-Galactosidase-Inhibitor konnte eine Hemmung der Lactaseaktivität festgestellt werden. Eine weitere, gezielte Durchmusterung von Verbindungen mit Hilfe des etablierten Systems könnte somit zur Charakterisierung neuer Inhibitoren führen und alternative Ansätze zur therapeutischen Behandlung von Galaktosämie eröffnen.
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Untersuchung von Lipasen - Elektrostatik, Selektivität und Einfluss von Lösungsmitteln auf Struktur und Dynamik
(2008) Trodler, Peter; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Lipasen katalysieren die Hydrolyse von Estern und die Veresterung. Lipasen sind Biokatalysatoren mit hoher Selektivität, einem breiten Substratspektrum unter milden Bedingungen und sind wichtig in der Anwendung in organischen Synthesen. Ein Merkmal der meisten Lipasen ist die Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Die meisten Lipasen haben einen Deckel, das lid, ein bewegliches Strukturelement das den Zugang zum aktiven Zentrum verschließt. Die Grenzflächenaktivierung ist verbunden mit einem Konformationsübergang von der geschlossenen zur offenen Konformation. Bei Kontakt an eine hydrophobe Grenzfläche wird das lid geöffnet und erlaubt dem Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum. Die Eigenschaften von Lipasen, wie Temperaturstabilität, Selektivität oder Aktivität ändern sich beim Wechsel des Lösungsmittels. In dieser Arbeit wurde der Einfluss organischer Lösungsmittel auf die Struktur und die Dynamik von Lipasen durch Simulationen untersucht. Candida antarctica Lipase B (CALB) ist die wichtigste Lipase in der industriellen organischen Synthese. Im Gegensatz zu den meisten anderen Lipasen hat CALB kein lid und zeigt keine Grenzflächenaktivierung. CALB ist in organischem Lösungsmittel stabil und kann Reaktionen bei höheren Temperaturen katalysieren. Durch Simulationen sollte das Verhalten von CALB in den Lösungsmitteln Methanol, Chloroform, Isopentan, Cyclohexan, Toluol und Wasser untersucht werden. Die Struktur war in allen Lösungsmitteln stabil. Das umgebende Lösungsmittel hatte einen großen Einfluss auf die Flexibilität von CALB, bei einer höheren Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels nahm die Flexibilität zu. Bei kleineren Dielektrizitätskonstanten des Lösungsmittels nahm die Zahl der an die Oberfläche gebundenen Wassermoleküle zu. Durch die größere Zahl an langsam ausgetauschten Wassermolekülen an der Oberfläche bildete sich ein umspannendes Wassernetzwerk. Der Grund der verringerten Flexibilität von CALB in unpolaren Lösungsmitteln war die geringere Beweglichkeit von Wassermolekülen an der Oberfläche und deren langsamerer Austausch. Burkholderia cepacia Lipase (BCL) wurde in Simulationen untersucht. BCL hat ein lid und zeigt Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Zur Untersuchung der Grenzflächenaktivierung wurden Simulationen der offenen und geschlossenen Konformation von BCL in Wasser und Toluol durchgeführt. In der geschlossenen Konformation von BCL in Wasser blieb das lid geschlossen. In Simulationen von geschlossenem BCL in Toluol wurde die Öffnung des lids beobachtet. Die vollständige Öffnung des lids wurde in der Simulation durch Helix α6 blockiert und verhinderte die weitere Bewegung von Helix α5 zur geöffneten Konformation. In der Simulation von offenem BCL in Wasser wurde eine Schließbewegung des lids beobachtet die durch Wechsel des Lösungsmittels reversibel war. In der Simulation der offenen Kristallstruktur in Toluol zeigte das lid eine etwas weitere Öffnung als zu Beginn der Simulation. Kristallkontakte verhindern eine vollständig geöffnete Konformation in der Kristallstruktur. Theoretische Untersuchungen wurden auch mit der experimentellen Arbeit verbunden. Durch rationales Design wurde eine neue einstufige Aufreinigungsmethode für CALB entwickelt. Im Allgemeinen können Lipasen durch Ionen-Austausch Chromatographie aufgereinigt werden. CALB konnte jedoch bisher nicht auf Säulen in der Ionen-Austausch Chromatographie oder der Hydrophoben-Interaktions Chromatographie unter den verwendeten Bedingungen gebunden werden. Bei der elektrostatischen Charakterisierung von CALB wurde ein breiter isoelektrischer Bereich, an Stelle eines isoelektrischen Punkts gefunden. Eine einstufige Aufreinigungsmethode durch Ionen-Austausch Chromatographie für CALB mit Bindung bei pH 3 wurde entwickelt. Das rationale Design einer Aufreinigungsmethode kann auch zur Entwicklung von Aufreinigungsmethoden anderer Proteine verwendet werden. Acrylierung dient zur Einführung von Vernetzungs-Funktionalität in Verbindungen. Chemische Prozesse zur Herstellung von acrylierten Estern bei hohen Temperaturen führen gleichzeitig zur teilweisen Polymerisierung der acrylischen Doppelbindungen. Die Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten sollte für einen biotechnologischen Prozess durch CALB etabliert werden. Die Methode des rationalen Designs wurde zur Erhöhung der Aktivität der Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten durch CALB bis zur vollständigen Umsetzung verwendet. Hydroxypropylcarbamat besteht aus zwei Enantiomerenpaaren von denen ein Enantiomer von CALB kaum acryliert wird. Das schlecht umgesetzte Substrat wurde durch Modellierung identifiziert und Mutanten mit höherer Aktivität vorgeschlagen. Die zur Vergrößerung der Bindetasche des sekundären Alkohols vorgeschlagenen Mutanten an Position 278 waren in der Hydrolyse von Tributyrin und der Acrylierung aktiver als der WT.
Open Access
Ein GFP-basierter in-vivo-Assay für das Hochdurchsatz-Screening nach Hydrolaseaktivität
(2005) Schuster, Sascha; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein effektives intrazelluläres Testsystem zur Identifizierung von Hydrolaseaktivität entwickelt. Die Grundlage dieses in vivo Assays beruht auf dem Auftreten von pH-Änderungen bei Hydrolase-katalysierten Substratspaltungen. Ratiometrisches pHluorin, eine pH-sensitive Mutante von Green Fluorescent Protein (GFP) fungierte als Detektor zur Bestimmung dieser pH-Änderungen. pHluorin besitzt im Gegensatz zu GFP zwei pH-abhängige Peaks bei 395 bzw. 475 nm, deren Maxima sich innerhalb eines pH-Bereichs von 8,0 bis 5,5 reversibel zueinander verschieben. Das aus den beiden Peaks gebildete Fluoreszenzemissionsverhältnis R475/395 kann - gemessen bei einer maximalen Emission bei 508 nm - direkt als Maß für intrazelluläre pH-Änderungen herangezogen werden. Die praktische Anwendung dieses Prinzips wurde zunächst durch Koexpression von pHluorin und der Esterase aus Geobacillus stearothermophilus (BSE) als Modellhydrolase in Escherichia coli (E. coli) Zellen und anschließender Hydrolyse verschiedener Ester untersucht. So zeigten Zellen nach Expression von pHluorin und Esterase, in Abhängigkeit von der Enzymaktivität gegenüber den untersuchten Substraten eine mehr oder weniger starke Änderung des Fluoreszenzemissionsverhältnisses. Daraufhin konnte die Anwendung des Assays auch erfolgreich auf Hydantoinase- sowie Amidase-katalysierte Substrathydrolysen erweitert werden. Außerdem wurden verschiedende Experimente im Mikrotiterplattenformat sowie in der Durchflusszytometrie im Hinblick auf eine erfolgreiche Assayapplikation im Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Enzymbibliotheken durchgeführt. Zur Etablierung im Hochdurchsatz-Screening wurde mittels error-prone PCR eine Mutantentenbibliothek der Esterase I aus Pseudomonas fluorescens (PFE I) aufgebaut und mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Nachweissystems auf erhöhte hydrolytische Enzymaktivität gegenüber g-Butyrolacton (GBL) untersucht. Auf diese Weise wurde eine Mutante mit einer 5,6-fach gesteigerten Umsatzrate von GBL im Vergleich zum PFE I-Wildtyp gefunden. Somit konnte gezeigt werden, daß eine schnelle und zuverlässige Untersuchung von Biokatalysatoren bei Anwendung des pHluorin-Assays zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken möglich ist.
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Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba
(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.
Open Access
Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität
(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.
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The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis
(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.
Open Access
Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution
(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.

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