Universität Stuttgart
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Item Open Access Untersuchungen zur enzymatischen Enantiomerentrennung von Glykolethern und Etablierung neuer Methoden des synthetischen Shufflings(2004) Rusnak, Monika; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen geeigneten Biokatalysator für die Enantiomerentrennung des Modellsubstrats 1-Methoxy-2-Propanol (MP) bzw. seines Esters 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA) bereitzustellen. In den letzten Jahren stieg das Interesse an den enantiomerenreinen Formen dieser Glykolether enorm. In dieser Arbeit richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Evaluierung verschiedener Strategien zur Identifizierung bzw. Optimierung des Biokatalysators. Hierbei sollten sowohl Methoden der de novo Klonierung und der biochemischen Charakterisierung neuer Enzyme, wie auch der gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns bereits bekannter Biokatalysatoren angewandt werden. Das so erhaltene Enzym sollte das Potenzial zum Einsatz in der chemischen Industrie haben, was hohe Anforderungen sowohl an Enantioselektivität wie auch an die Prozessstabilität eines Biokatalysators stellt. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Lipase A aus Archaeoglobus fulgidus kloniert und charakterisiert werden. Dieses Enzym, welches sehr geringe Homologie zu anderen bekannten Hydrolasen aufwies, zeigte ein interessantes Profil, speziell in Bezug auf sein pH-Optimum, jedoch keine Hydrolyse von MPA. Es war bekannt, dass die Lipase B aus Candida antarctica (CalB) eine hohe Enantioselektivität vor allem bei der Hydrolyse von MPA zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war daher die Abschätzung der Nutzbarkeit und Verfügbarkeit von CalB für die Enantiomerentrennung von MP / MPA. Die industrielle Anwendung von CalB ist durch die Patentierung dieses Enzyms durch Novozymes beschränkt. Die im zweiten Teil dieser Arbeit etablierte Expression von CalB in Pichia pastoris und die Übertragung des Expressionssystems auf den Fermentationsmaßstab schufen optimale Voraussetzungen für nachfolgende Experimente. Die bei dieser Expression erzielten Ausbeuten übertrafen die anderer Gruppen. Die erzeugten rationalen Mutanten zur Verbesserung der Selektivität in der Umesterung konnten keine Erhöhung der Enantioselektivität bewirken. Die hier erstmals gelungene funktionelle Expression von CalB in E.coli eröffnete jedoch die Möglichkeit zur gerichteten Evolution von CalB und dem Screening auch großer Mutantenbibliotheken, sowohl durch die Methode des Plattenscreenings wie auch durch FACS-Screening. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, günstige und schnelle Methode der Gensynthese entwickelt, die zur Darstellung der im vierten Teil der Arbeit verwirklichten Genbank verwendet wurde. Die so gewonnene Lipase 1 aus Moraxella sp. TA144 wurde funktionell in E.coli exprimiert und charakterisiert. Basierend auf der in dieser Arbeit etablierten Methode der Gensynthese konnte eine Genbank der CalB erstellt werden, die durch eine neue Methode des synthetisches Shuffling dargestellt wurde. Durch mehrere Evaluierungsansätze konnte die Sequenz der Genbank den Anforderungen gemäß optimiert werden, so dass das Auftreten ungewollter Mutationen minimiert werden konnte. In dem folgenden Hochdurchsatzscreening von 19000 Klonen der Genbank im vorher etablierten E.coli Expressionssystem konnte kein Klon mit Lipaseaktivität isoliert werden. Nichtsdestotrotz handelte es sich hierbei um einen interessanten neuen Ansatz der gerichteten Evolution, der nach Optimierung der Lipaseexpression bzw. des Screeningsystems und möglicherweise nach Herabsetzung des Degenerationsgrades zu neuen Biokatalysatoren mit interessanten Eigenschaften führen sollte. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass es zur enzymatischen Enantiomerentrennung von MPA im Moment keinen Ersatz zu CalB gibt. Durch die Etablierung der CalB-Expression in E.coli wurde die entscheidende Voraussetzung zur Optimierung der noch verbesserungswürdigen Enantioselektivität, vor allem in der Umesterungsreaktion, sowie der noch geringen Thermostabilität geschaffen. Der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz der gerichteten Evolution zeigte auf, dass bei evolutiven Mutagenesestrategien stets mehrere Variablen existieren, deren Auswirkungen auf das Ergebnis gegeneinander gewichtet werden müssen. So sollte die Variabilität der Mutantenbibliotheken hoch sein, um Klone mit möglichst neuen Kombinationen von gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Gleichzeitig sollte bedacht werden, dass die strukturelle Stabilität der Mutanten mit steigender Variabilität sinkt, so dass der verfügbare Sequenzraum stets begrenzt bleiben muss, um eine zufriedenstellende Ausbeute an funktionellen Klonen zu gewährleisten.Item Open Access Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von RERE, einem Gen mit möglicher Relevanz bei der Tumorentstehung(2001) Wärner, Thomas Michael; Pfizenmaier, Klaus (Prof.)RERE (RE repeats encoded) ist ein kürzlich beschriebenes Gen welches in der distalen Region von Chromosom 1p lokalisiert ist. Für diese genomische Region wurde durch molekularbiologische und zytogenetische Studien eine konsistente strukturelle Veränderung in verschiedenen menschlichen Tumoren nachgewiesen. Die Neuroblastom Zelllinie NGP enthält eine reziproke chromosomale Translokation/Duplikation in dieser genomischen Region. Die genomische Sequenz von RERE wurde als die den Bruchpunkt überlagernde Sequenz in der Zelllinie NGP nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die genomische Struktur von RERE beschrieben und die cDNA einer neuen RERE Splicevariante isoliert. In allen untersuchten humanen Geweben wurden mittels Northern blotting zwei dominante RERE-Transkripte nachgewiesen und diese als mögliche Splice Varianten identifiziert. Darüber hinaus wurde in allen untersuchten Tumorzelllinien mittels Western blotting zwei dominante Proteinbanden mit einem RERE Immunserum nachgewiesen. In 2 von 18 untersuchten Tumorzelllinien wurde zusätzlich jeweils eine kleinere dominante Proteinbande detektiert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß überexprimiertes RERE in PML Oncogenic Domains (PODs) lokalisiert ist und mit den pro-apoptotischen Proteinen PML, BAX und mit Mitochondrien kolokalisiert. Bei RERE transfizierten Zellen wurde durch unterschiedliche Methoden Apoptose nachgewiesen. Durch die Untersuchung verschiedener RERE Proteinfragmente (gesamtes RERE und N- oder C-terminale Deletionsmutanten von RERE) konnte die Region beschrieben werden, die eine Kolokalisierung von RERE und PODs unterstützt und nachdem sie in verschiedene Zelllinien transfiziert wurde, mit dem Nachweis von Apoptose korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben einen ersten Hinweis auf die Funktion von RERE. RERE könnte eine Verbindung zwischen PODs und der Kontrolle von Apoptose darstellen und somit eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielen.Item Open Access Molekulare Mechanismen der Antiöstrogenwirkung beim Mammakarzinom(2002) Buck, Miriam; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)Antiöstrogene haben sich als sehr effektiv in der Behandlung hormon-responsiver Mammakarzinome erwiesen. Im Verlauf der Therapie kommt es jedoch in der Regel zu einem Verlust der anithormonellen Wirkung. Die an der Entstehung der Antihormonresistenz beteiligten Mechanismen sind weitgehend ungeklärt. Ein entscheidender Schritt zur Aufklärung der antihormonellen Wirkung war die Beobachtung, dass die Behandlung hormonsensitiver Mammakarzinomzellen zu einer Aktivierung des inhibitorischen Wachstumsfaktors TGFb führt. Am Modell-System hormon-sensitiver MCF-7 Mammakarzinomzellen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Beteiligung des TGFb-Systems an der Wirkung des nicht-steroidalen, partiellen Antiöstrogens 4-Hydroxytamoxifen und des steroidalen, reinen Antiöstrogens ICI 182.780 untersucht. Die Ergebnisse sollen zum besseren Verständnis der Interaktionen zwischen Hormonen und Wachstumsfaktoren und den damit im Zusammenhang stehenden Mechanismen der Antiöstrogenresistenz beitragen. Im Mittelpunkt des ersten Teils der Arbeit stand die antiöstrogene Regulation des TGFb-Systems. Untersucht wurde die Expression der Liganden TGFb1 und TGFb2, der Rezeptoren TbRI und TbRII und von Smad7. Zur genauen Quantifizierung der mRNA-Expression dieser Gene wurden spezifische LightCycler RT-PCRs etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur TGFb2 sondern auch TbRII einer antihormonellen Regulation unterliegt. Die Stärke der Induktion beider Gene korrelierte mit der wachstumsinhibitorischen Wirkung der Antiöstrogene. Smad7 wurde nur schwach durch Antiöstrogen induziert, TGFb1 und TbRI gar nicht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht Aufschluss darüber zu erhalten, welche Zweige des komplexen TGFb Signaltransduktionssystems an der antiöstrogenen Wirkung beteiligt sind. Als Endpunkt wurde u.a. die Aktivierung TGFb-sensitiver Promotoren untersucht. Das Reporterplasmid p3TP-lux wurde durch Antiöstrogene ca. 2fach stärker aktiviert als durch TGFb. Über Koexpression dominant-negativer TGFb-Rezeptoren und dominant-negativer Smad4-Proteine konnte gezeigt werden, dass die anitöstrogene Aktivierung von p3TP-lux TGFb vermittelt ist und über den Smad-Signaltransduktionsweg verläuft. Obwohl das steroidale Antiöstrogen ICI 182.780 einen deutlich stärkeren Effekt auf das TGFb-System hat als das partielle Antiöstrogen 4-Hydroxytamoxifen, war die Aktivierung von p3TP-lux durch beide Antiöstrogene annähernd gleich stark. Für eine vollständige Aktivierung von p3TP-lux ist eine Kooperation zwischen einem TGFb aktivierten Smad-Komplex und c-Jun/c-fos notwendig. Die Induktion von c-fos wird jedoch durch steroidale Antiöstrogene blockiert und kommt daher als Ursache der geringen Induktion von p3TP-lux durch ICI 182.780 in Frage. Da TGFb seine Wirkung neben dem Smad-Signaltransduktionsweg auch über MAP-Kinase-Wege entfalten kann, wurde mit Hilfe spezifischer pharmakologischer Inhibitoren die Beteiligung des MEK/Erk- und des p38-MAP-Kinase-Weges an der antihormonellen Wachstumsinhibition untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der p38-Weg über die Induktion von TGFb2 und TbRII an der antihormonellen Wachstumsinhibition beteiligt ist. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Antiöstrogene verschiedene Gene des TGFb-Signaltransduktionssystems differenziell regulieren. Die Untersuchungen zur Beteiligung der TGFb-Signaltransduktionswege an der antihormonellen Wirkung weisen darauf hin, dass diese differenzielle Regulation, durch die spezifische Aktivierung einiger TGFb-Signaltransduktionswege (Smad, p38) und gleichzeitige Inhibition anderer (MEK/Erk) erreicht wird. Da die Signaltransduktionswege in unterschiedlichem Ausmaß zur Aktivierung der verschiedenen Promotoren beitragen, kommt es unter Antiöstrogeneinfluss zu einer Modifizierung des TGFb induzierten Genexpressionsmusters und der spezifisch antiöstrogenen Wirkung.Item Open Access Beiträge zur Biologie, Chorologie, Ökologie und Taxonomie der neophytischen Melde Atriplex micrantha und verwandter Arten(2004) Schwarz, Oliver Christoph; Kull, Ulrich (Prof. Dr.)Atriplex micrantha ist ein Neopyht, dessen Vorkommen in Mitteleuropa seit fast hundert Jahren belegt werden konnte. Die Verbreitung entlang baden-württembergischer Autobahnen und Bundesstraßen, der Stand ihrer weltweiten Verbreitung, ihre Habitat-Ansprüche und ihre Begleitflora wurden untersucht. Es konnten neue Merkmale identifiziert werden, die in Bestimmungsschlüssel einflossen. Die gültige Nomenklatur wurde für A. micrantha, A. aucheri, A. hortensis, A. sagittata und A. oblongifolia recherchiert und Abbildungen der Typusbelege nachgewiesen. Die Fundgeschichte der A. micrantha am Locus classicus sowie die ersten Funde in Westeuropa wurden dargestellt. Die Qualität der in der Bestimmungsliteratur veröffentlichten Abbildungen der genannten Arten wurde miteinander verglichen und diskutiert. Eine entdeckte Unterart der A. micrantha wurde neu beschrieben. Es konnte anhand den ribosomalen ITS-Gensequenzen von 14 Arten nachgewiesen werden, dass A. micrantha, A. prostrata und A. patula in Übereinstimmung mit der morphologischen Einteilung zur Sektion Teutliopsis Dumort. gehören. A. oblongifolia muss jedoch entgegen ihrer bisherigen Zuordnung zur Sektion Teutliopsis der Sekt Dichospermum Dumort. zugeordnet werden. Außerdem wurden ökophysiologische Untersuchungen (Salztoleranz, Keimung, Wasserhaushalt, Photosynthese) von Atriplex micrantha und anderen Melden durchgeführt.Item Open Access Das konservierte Zellproliferationsgen CDC123 kodiert für einen Initiationsfaktor der Translation: 2gamma-AP(2006) Richter, Frank; Seufert, Wolfgang (Prof. Dr.)Das Genprodukt von CDC123 in Saccharomyces cerevisiae ist essentiell und hochkonserviert. Es existieren Homologe in anderen niederen Eukaryonten ebenso wie in der Ackerschmalwand, dem Zebrafisch, der Maus oder auch dem Menschen. Ergebnisse zu dem orthologen Gen D123 aus einer Ratten-Fibroblastenzelllinie (3Y1) wurden erstmals 1984 publiziert. Es wurden konditionale Mutanten erzeugt, denen es bei restriktiver Temperatur nicht möglich war, in den Zellzyklus einzutreten und die DNA-Replikation zu initiieren. Das Interesse galt dabei der Identifikation neuer Regulatoren der Zellproliferation, um den Vorgang der Transformation hin zu unkontrolliert proliferierenden Zellen zu verstehen. Bei der Mutante 3Y1tsD123 konnte nach Inkubation bei restriktiver Temperatur ein Arrest in der G1-Phase des Zellzyklus beobachtet werden. Das mutierte Gen konnte kloniert und ein Nukleotidaustausch, der zu einem Aminosäureaustausch führte (A109V), nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen wiesen eine Proteasom-abhängige Instabilität dieses mutierten Proteins nach. Ebenso wurde eine teilweise granuläre Lokalisation von D123 im Cytoplasma und ein Kernausschluss beobachtet. Mögliche Phosphorylierungsstellen wurden ebenso beschrieben wie eine Homologie zu dem bis zum Beginn dieser Arbeit unbekannten ORF YLR215C in S. cerevisiae. YLR215C erhielt den Namen CDC123 in der Saccharomyces Genom Datenbank. In dieser Arbeit sollte CDC123 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht und eine molekulare Erklärung für die in Säugerzellen beobachteten Phänotypen gefunden werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Homologie von Cdc123 zu D123 nicht nur auf Sequenzebene existiert, sondern dass eine Deletion von CDC123 in Hefe durch das humane orthologe D123 komplementiert werden kann. Ebenso wie D123 in Säugerzellen ist auch Cdc123 in Hefe essentiell für den Eintritt in den Zellzyklus und das Verlassen der G1-Phase. Mit Hilfe der SGA-Analyse, der systematischen Suche nach synthetisch genetischen Interaktionen mit den ca. 4700 zur Verfügung stehenden Deletionen nicht essentieller Gene in S. cerevisiae, konnten 50 Gene identifiziert werden, die mit CDC123 in Verbindung stehen. Es waren Gene unterschiedlichster Bereiche zellulärer Funktion und Lokalisation dabei, die eine funktionale Einordnung von CDC123 allein aufgrund dieser Interaktionen unmöglich machte. Eine Gruppe von 6 Genen (GCN3, TIF1, TIF2, TIF3, TIF4631, TIF4632), allesamt Translationsinitiationsfaktoren, erschien vor dem Hintergrund einer publizierten Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 vielversprechend. Daraufhin konnte ebenfalls eine synthetische Interaktion (letal, bzw. krank) zwischen cdc123-Mutanten und GCD11- bzw. SUI2-Allelen (Untereinheiten gamma und alpha des Initiationsfaktors eIF2) gefunden werden. Interaktionsstudien mit verschiedenen an der Translationsinitiation beteiligten Faktoren zeigten, dass Cdc123 ausschließlich mit eIF2 interagiert, nicht aber mit dessen Nukleotidaustauschfaktor eIF2B oder eIF3, Teil des Multifaktorkomplexes (MFC) und des 43S Präinitiationskomplexes. Die Interaktion kann in einem von Ribosomen geklärten Überstand, frei von der 40S oder 60S ribosomalen Untereinheit, stattfinden. Zusammen deutet dies auf eine Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 in einem frühen Stadium der Translationsinitiation vor der Assoziation von eIF2 mit eIF3, d.h. dem MFC oder der 40S ribosomalen Untereinheit hin. Nach Inaktivierung von Cdc123-1 kann ein Verlust an Polysomen und eine Derepression der GCN4-Expression beobachtet werden. Sowohl das veränderte Polysomenprofil als auch die derepremierte GCN4-Expression sind Hinweise auf eine reduzierte Translationsinitiation. eIF2gamma wird, anders als die Untereinheiten alpha und beta, nach dem Verlust der Cdc123-Aktivität bei 25°C leicht und bei 37°C vermehrt instabil. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Abnahme der Gcd11-Menge nicht den primären Grund für die Wachstumsbeeinträchtigung der Cdc123-Mutanten darstellt. Vielmehr ist die Interaktion von eIF2gamma mit eIF2alpha und eIF2beta durch den Verlust der Cdc123-Aktivität stark reduziert. Dieser molekulare Befund wird als Ursache sowohl für den Arrest in der G1-Phase als auch für die reduzierte Translationsinitiation in Cdc123-Mutanten angesehen. In Übereinstimmung damit kann eine Deletion von CDC123, d.h. eine geringere Verfügbarkeit von eIF2 durch die Überexpression der Untereinheiten von eIF2 bedingt gerettet werden. Eine Überexpression der einzelnen Untereinheiten ermöglicht nur minimales Wachstum, wohingegen eine Kombination von eIF2gamma mit eIF2alpha oder aller drei Untereinheiten annähernd Wildtypwachstum zulässt. Cdc123 stellt somit einen neuen, für die Translationsinitiation essentiellen Faktor dar. Es ist notwendig für die effiziente Bereitstellung des eIF2-Komplexes, auf die möglicherweise über Cdc123 regulatorisch eingewirkt werden kann.Item Open Access Modellierung der Adsorption von Proteinen an Oberflächen(2009) Steudle, Alexander Patrick; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Die Adsorption von Proteinen an Oberflächen ist ein äußerst komplexer Prozess, der in vielen Bereichen, wie der Medizin, Pharmazie, Nanotechnologie und Biotechnologie, von großer Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Methoden zur Vorhersage der Orientierung und des Bindungsverhaltens von Proteinen bei der Adsorption entwickelt. Die Arbeit konzentrierte sich hierbei auf die Gebiete der Ionenaustauschchromatografie, der hydrophoben Interaktionschromatografie und der Immobilisierung. Als untersuchte Proteine wurden Hühnereiweiß-Lysozym, die Hämdomäne der bakteriellen Cytochrom P450-BM3 Monooxygenase und humane monoklonale Antikörper verwendet. Lysozym gehört zu den am besten charakterisierten und meisten analytisch verwendeten Proteinen, da es billig und in großen Mengen hergestellt werden kann. Viele bisherige Untersuchungen wurden mit Lysozym durchgeführt und die adsorbierte Orientierung auf Kationenaustauschern konnte experimentell bestimmt werden. Der Adsorptionsvorgang von Cytochrom P450-BM3 ist von Interesse bei Immobilisierungen, welche zu verbesserten Eigenschaften bei Betrieb und Lagerung sowie zu einer einfachen Separation des Produkts führen. Wichtig ist hierbei eine Orientierung des Enzyms mit freiliegendem Substratzugang. Auch bei der Bindung auf beschichteten Elektroden, durch welche sich die Möglichkeit der Entwicklung analytischer und biokatalytischer Anwendungen sowie eine einfache und billige Elektronenquelle ergibt, ist die Orientierung wichtig. Ebenso wie der Substratzugang ist hier die korrekte Orientierung des elektronenakzeptierenden Bereichs wichtig, da dieser mit der Elektrodenoberfläche in Kontakt stehen sollte. Antikörper gehören zu den am häufigsten eingesetzten therapeutischen Proteinen. Ihre Produktion ist teuer, da sie meist über Protein A aufgereinigt werden. Es besteht großes Interesse an billigeren alternativen Verfahren, wie der Ionenaustauschchromatografie. Früher wurden Adsorptionsprozesse meist mit vereinfachten Modellen eines Proteins, beispielweise als kugelförmiges Gebilde, modelliert. Durch die zunehmende Aufklärung der Proteinstrukturen in atomarer Auflösung wurden auch weiter entwickelte Adsorptionsmodelle erstellt, jedoch wurden Proteine dabei meist als unflexible Objekte modelliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es durch ein unflexibles Modell des Proteins, abhängig von der verwendeten Struktur und dem Abstand zur Oberfläche, bei der Modellierung von Adsorptionen zu Abweichungen von der experimentell bestimmten Orientierung kommen kann. Eine grobe Abschätzung der Bindungsorientierung ist bei einem kurzen Abstand aber noch möglich. Durch multiple Molekulardynamische Simulationen (MD-Simulationen), in welchen das Protein frei und flexibel an die Oberfläche binden konnte, hat sich am Beispiel Lysozym gezeigt, dass der Mittelwert der festgestellten gebundenen Orientierungen mit der experimentell bestimmten Orientierung, unabhängig von der zu Beginn verwendeten Proteinstruktur, übereinstimmte. Im Vergleich zeigten verschiedenen Proteine auch ein unterschiedliches Bindungsverhalten. Während bei Lysozym die Simulationen über einer negativ geladenen Oberfläche nur ein ähnliches Bindungsverhalten mit ähnlichen Bindungsorientierungen zeigte, erfolgte die Bindung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne auf einer positiv geladenen Oberfläche aufgrund ihres starken Dipolmoments immer in gleicher Weise und mit gleicher Orientierung. Die Orientierung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne in der frühen Phase der Bindung konnte auch mittels der rigiden Bestimmungsmethode festgestellt werden. Ein Kippen der kompletten Proteinstruktur nach dem ersten Kontakt zur Oberfläche wurde jedoch nur mittels MD-Simulationen vorhergesagt. Es konnte am Modell gezeigt werden, dass die adsorbierte Orientierung auf einer positiv geladenen Oberfläche zu einer Beeinträchtigung des Substratzugangs führt und, im Falle der Immobilisierung auf einer positiv geladenen Adsorberoberfläche, welche beispielsweise bei beschichteten Elektroden eingesetzt wird, eine ungünstige Ausgangsorientierung für die Elektronenübertragung vorliegt. Mittels MD-Simulationen der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne über verschiedenen Anionenaustauscherliganden konnte eine Korrelation der Bindungsenergien bei verschiedenen Salzkonzentrationen mit experimentell gemessenen chromatografischen Daten bestimmt werden. MD-Simulationen mit Antikörper waren durch die rechenintensiven, langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen Adsorber und Protein im Rahmen der zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten nicht durchführbar. Es konnten dennoch die Regionen, die bei der Aufreinigung mittels Ionenaustauschchromatografie Einfluss auf die Retention nehmen und somit für eine Optimierung des Proteins für den Aufreinigungsprozess infrage kommen, beispielsweise durch gezielte Mutationen in diesem Bereich, an der Proteinoberfläche mittels eines starren Modells bestimmt werden.Item Open Access Molekulare Mechanismen der pro-apoptotischen Kooperation zwischen TNF-R1 und Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie(2002) Fotin-Mleczek, Mariola; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der apoptotischen Kooperation zwischen dem Todesrezeptor TNF-R1 und den Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie, insbesondere dem TNF-R2, aufzuklären. Es wurde hier gezeigt, dass die Art der zellulären Antwort, die vom TNF-R1 ausgeht, stark von der Dauer der TNF-Stimulation abhängen kann. So reicht ein TNF-Puls aus um den Transkriptionsfaktor NF-kB zu aktivieren, ist aber nicht hinreichend, um die apoptotische Zellmaschinerie in Gang zu setzen. Die Ko- und Vorstimulation des TNF-R2 konnten die TNF-vermittelte Apoptose-Induktion erhöhen und beschleunigen. Die Verstärkung der Apoptose korrelierte dabei mit der Zeitkinetik der TNF-R2-induzierten TRAF2-Depletion. Eine TNF-R2-Stimulation von 6 Stunden führte zu einer fast vollständigen Depletion von TRAF2 aus dem Zytoplasma, verstärkte den TNF-R1-vermittelten Zelltod dramatisch und inhibierte gleichzeitig die TNF-R1-induzierte NF-kB-Aktivierung zu 90%. Wurden die beiden TNF-Rezeptoren gleichzeitig aktiviert, so konnte noch immer eine beträchtliche Verstärkung der TNF-R1-induzierter Apoptose beobachtet werden, während die TNF-R1-vermittelte NF-kB-Aktivierung unbeeinflusst blieb. Mit Hilfe von der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die Stimulation der Nicht-Todesrezeptoren CD40 und TNF-R2 zur TRAF2-abhängigen Rekrutierung der anti-apoptotischen Moleküle cIAP1 und cIAP2 an die Rezeptoren führte. Dies zeigt, dass der TNF-R1 und die Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie nicht nur um TRAF2 sondern auch um die mit TRAF2 assoziierten Schutzproteine kompetieren können. Diese Kompetition bildet den Kern des Modells zur apoptotischen Kooperation der beiden TNF-Rezeptoren. Demnach kann die Stimulation des TNF-R2 die TNF-R1-induzierte Apoptose auf zwei Ebenen verstärken: über die Inhibierung der NF-kB-abhängigen Induktion von Schutzproteinen und durch die Inhibition ihrer Schutzwirkung auf der post-transkriptionellen Ebene durch Kompetition. In beiden Fällen wird die Ausbildung eines Caspase-8-aktivierenden TNF-R1-Signalkomplexes ermöglicht. In vivo werden die Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie auch durch membranständige Liganden aktiviert. Daher wurden im zweiten Abschnitt dieser Arbeit die Interaktionen zwischen TNF-R2, CD40 und ihren membranständigen Liganden analysiert. Unter Anwendung der Laser-Scanning-Mikroskopie und von Kokulturen konnte demonstriert werden, dass in Zell-Zell-Kontakten die Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie mit ihren membranständigen Liganden Superaggregate bilden. Diese Aggregate entstehen innerhalb von 30 Minuten nach dem Zusammentreffen zweier Zellen, von denen eine den Rezeptor und die andere den membranständigen Ligand exprimiert. Die Rezeptor-Ligand-Superaggregate bleiben über mehrere Stunden stabil, wobei sich ihre Form und Lage stets verändern. Im Weiterem wurde beobachtet, dass die Rezeptor-Ligand-Superaggregate signalfähige Rezeptor-Komplexe enthalten. So wurde z.B. TRAF2 in die TNF-R2/memTNF-Aggregate rekrutiert. Wurde der CD40 mit einem löslichen CD40-Ligand stimuliert, so wurde die Internalisierung und möglicherweise der Abbau des Rezeptors beobachtet, nicht jedoch nach der Stimulation mit dem membranständigen Ligand. Dies deutet darauf hin, dass sich die Qualität der Bindung zwischen dem Rezeptor und seinem membranständigen Liganden wesentlich von der Interaktion des Rezeptors mit den löslichen Reagenzien unterscheidet.Item Open Access Herstellung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol: Konstruktion und Charakterisierung einer Mutante des Lösungsmittel tolerierenden Pseudomonas putida Idaho(2002) Germer, Andrea; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)Zur biotechnologischen Produktion der Bulkchemikalie Phenol wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Mutante des Bakterienstammes P. putida Idaho konstruiert, mit welcher aus Toluol Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol als Precursor für die weitere Umsetzung zu Phenol hergestellt werden sollte. In P. putida Idaho ist das gewünschte Produkt Metabolit des Abbauweges von Toluol. Im Wildtypstamm P. putida Idaho wird Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durch zwei Dehydrogenasen, die in verschiedenen Genclustern codiert sind, zu Brenzcatechin umgesetzt. Die Toluat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase XylL, die im meta-Operon codiert ist, wurde durch eine Deletion im Gen xylL inaktiviert, in Gen benD der Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase des b-Ketoadipatweges wurde zusätzlich zu einer Deletion ein Antibiotikaresistensmarker, das W-Fragment, eingefügt. Mit dieser Mutante P. putida Idaho BDH2 wurden Umsatzexperimente von Toluol zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Mutante trotz Inaktivierung der beiden Gene, welche das Produkt in Wildtypstamm weiter abbauen, immer noch in der Lage ist, Toluol als Wachstumssubstrat zu nutzen. Aus dem angebotenen Toluol entstand außerdem nur 25-40 % des erwarteten Produktes, das nach etwa 4 Tagen unter weiterer Bildung von Biomasse wieder abgebaut wurde. Wurde statt Toluol Benzylalkohol oder Benzoat angeboten, wurde Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol zu nahezu 100 % gebildet. Auch während des Umsatzes dieser beiden Substrate konnte eine sehr schwache Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden. Wie im Ansatz mit Toluol wurde auch in diesen Ansätzen das gebildete Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol nach einigen Tagen unter Wachstum der Zellen wieder abgebaut. Durch Enzymtests mit Rohextrakten der Doppelmutanten von P. putida Idaho konnte eine sehr schwache aber signifikante Aktivität eines Enzyms, das Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol umsetzen kann, nachgewiesen werden, was den Abbau des gebildeten Produktes erklärt. Ob die Bilanzlücke bei der Bildung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol allein dieser Aktivität zugrunde liegt, ist nicht geklärt. Ein zusätzlicher Abbauweg von Toluol in P. putida Idaho der nicht über die Metabolite Benzylalkohol und Benzoat geht, konnte nicht nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass die Mutante P. putida Idaho BDH2, deren Biomasse mit dem Substrat Glucose produziert wurde, sich nur sehr schlecht mit Toluol induzieren ließ. Eine technische Produktion von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol mit P .putida Idaho ist, abgesehen vom unvollständigen Umsatz von Toluol ausgehend, weiterhin problematisch. Die Sequenzierung der beiden Gencluster mit den Dehydrogenasen zeigte, dass beide für den Umsatz zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol erforderlichen Dioxygenasen vorhanden waren. Die Gencluster aus P. putida Idaho zeigten Abweichungen von den sonst fast identischen Clustern, nämlich dem meta-Operon aus pWW0 und dem ß-Ketoadipatweg aus P. putida PRS2000. Diese Abweichungen könnten Hinweise auf eine andersartige Regulation für den Aromatenabbau als in den Wegen aus pWW0 oder P. putida PRS2000 bergen. Auch ist die Rekrutierung einer cis-1,2-Dihydrodiol-Dehydrogenase aus einem der beiden Gencluster an einen anderen Lokus des Chromosoms aus P. putida Idaho nicht ausgeschlossen.Item Open Access Charakterisierung der Regulation der gerichteten Migration und Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen durch den neuronalen Wachstumsfaktor GDNF(2002) Veit, Christine; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Die starke Infiltration intra- und extrapankreatischer peripherer Nerven gilt als Hauptursache für das Auftreten lokaler Rezidive und die äußerst schlechte Prognose von exokrinen Pankreaskarzinomen. Die hohe Affinität der Tumorzellen zu peripherem Nervengewebe und die bereits in frühen Tumorstadien einsetzende perineurale Invasion machen eine spezifische Interaktion zwischen den Pankreaskarzinomzellen und den peripheren Nerven wahrscheinlich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher nach Signalmolekülen gesucht, die an der Induktion der perineuralen Invasion humaner Pankreaskarzinomzelllinien beteiligt sein könnten. Der Einfluss konditionierter Medien neuronaler und glialer Zellen sowie spezifischer rekombinanter neuronaler Faktoren auf die Proliferation und Chemotaxis humaner Pankreaskarzinomzelllinien wurde analysiert. Hierbei wurde der neurotrophe Faktor GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) als Chemotaxis-induzierender Faktor für PANC-1-Zellen identifiziert. Da GDNF bei neuronalen Zellen seine spezifische Wirkung durch Bindung an den GDNF-Rezeptor-Komplex entfaltet, wurde die Expression dieses Rezeptor-Komplexes, bestehend aus der Rezeptortyrosinkinase Ret und dem GPI-Anker-Protein GFRa, in PANC-1-Zellen nachgewiesen. Mittels RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion)- und Western blot-Analysen konnte die Expression der beiden GDNF-Rezeptor-Komponenten Ret und GFRa1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene demonstriert werden. Eine nähere Charakterisierung des GDNF-Rezeptor-Komplexes in PANC-1-Zellen durch RT-PCR-Analysen ergab, dass die Transkripte von zwei GFRa-Proteinen, GFRa1 und GFRa2, und den drei bekannten Ret-Isoformen, Ret9, Ret43, Ret51, in PANC-1-Zellen nachweisbar sind. Durch Sequenzanalyse des Ret51-Transkriptes aus PANC-1-Zellen konnte die Expression der wildtypischen Sequenz in diesen Zellen bestätigt werden. Nachfolgend wurde die vollständige kodierende Ret51-DNA-Sequenz in den pEGFP-N1-Vektor kloniert und die Expression der Ret-EGFP-Fusionsproteine in PANC-1- und HEK293-Zellen in Fluoreszenz- und Western blot-Analysen überprüft. Zur Untersuchung Ret-abhängiger Signaltransduktionswege in PANC-1-Zellen wurden Ras- und Rac-GTP-Präzipitationsversuche und Kinaseaktivitätsanalysen der MAP-Kinasen ERK2 und JNK anhand von in vitro Phosphorylierungsexperimenten durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung der Zellen mit GDNF zu einer Steigerung der N-Ras- und Rac-GTP-Menge in PANC-1-Zellen führt und die Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK2 und JNK induziert. Durch Migrationsexperimente in Anwesenheit des MEK1-Inhibitors PD98059 und des PI3-Kinase-Inhibitors LY294002 konnte die Relevanz der Ras- Raf-MEK-ERK-Kaskade und der PI3-Kinase für die gerichtete Migration von PANC-1-Zellen herausgestellt werden. Um den Einfluss verschiedener Rho-Proteine auf Migrations- und Invasionsprozesse humaner Pankreaskarzinomzelllinien analysieren zu können, wurde die RhoC-cDNA-Sequenz aus BxPC-3-Zellen amplifiziert und PANC-1-Zellklone generiert, welche EGFP-RhoC- oder EGFP-RhoA-Fusionsproteine stabil überexprimieren. Das Migrationsverhalten dieser Zellklone wurde im Boyden-Kammer-System analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass die Expression von EGFP-RhoC im Gegensatz zu EGFP-RhoA zu einer deutlichen Steigerung der Chemotaxis bei PANC-Zellen führt. Somit wurden entscheidende molekulare Mechanismen aufgedeckt, die für die GDNF-induzierte Migration von PANC-1-Zellen relevant sind. Es wäre darüber hinaus möglich, dass das GDNF/Ret/GFRa-System sowie die kleine GTPase RhoC an der perineuralen Invasion von Pankreaskarzinomzellen in vivo beteiligt sind.Item Open Access Etablierung einer biologischen vaskularisierten Matrix als Grundlage für ein in-vitro-Lebertestsystem(2007) Schanz, Johanna Elisabeth; Brunner, Herwig (Prof. Dr. techn.)Die Leber spielt eine zentrale Rolle im Stoffwechsel eines Organismus. Sie ist aus einer Vielzahl hochspezialisierter Zellen aufgebaut und übernimmt komplexe, für den gesamten Organismus lebensnotwendige Stoffwechselfunktionen. Eingenommene Medikamente und Substanzen gelangen im Menschen über das Blutkreislaufsystem zur Leber und werden dort von den Hepatozyten um- und abgebaut (Biotransformation). Hierbei entstehen sogenannte Metabolite, die oft eine ganz andere (mitunter toxische) Wirkung haben als das ursprüngliche Medikament. Aus diesem Grund sind Leberzellen (Hepatozyten) bzw. das gesamte Organ "Leber" von besonderem Interesse als Analysesystem für Substanzen, Wirkstoffe und ihre Metabolite. Es gibt für Metabolismusstudien verschiedene, relativ einfache in vitro Testsysteme jedoch noch kein humanes organähnliches Lebermodell, das Langzeitstudien an primären Hepatozyten ohne Funktionsverlust ermöglicht. Damit isolierte Hepatozyten in der Kultur ihre Funktionalität behalten, ist die Bereitstellung einer möglichst in vivo ähnlichen Mikroumgebung wichtig. Dazu gehören einerseits die Co-Kultur mit nicht-parenchymalen Leberzellen und andererseits die Gewährleistung der Zellversorgung sowie eine geeignete Trägerstruktur (Matrix), die eine 3-Dimensionalität der Kultur schafft. Zur Aufbau eines Co-Kultursystems wurden in dieser Arbeit Endothelzellen eingesetzt, da sie eine Filtrationsbarriere für Makromoleküle zwischen dem Blut und den Gewebszellen bilden und an der Regenerationsprozessen beteiligt sind. Als Trägerstruktur wurde eine azellularisierte, vaskularisierte Matrix aus Schweinedarm, das so genannte "Biological Vascularized Scaffold" (BioVaSc), verwendet. Sie basiert auf einem 10 - 15 cm langen Stück porcinen Jejunums, welches sich unter Erhalt der Gefäßsystemstrukturen inklusive des arteriellen Zuflusses sowie des venösen Abflusses chemisch azellularisieren lässt. Eine ausreichende Versorgung der Hepatozyten mit Nährstoffen und Sauerstoff sowie der Abtransport von Toxinen und Metaboliten nach Medikamenten-/Wirkstoff-Umsetzung ließen sich durch ein computergesteuertes Bioreaktorsystem gewährleisten. Zum Aufbau eines Lebermoduls wurde die BioVaSc in zwei Schritten mit Zellen besiedelt: Im ersten Schritt erfolgte die Rebesiedelung der Gefäßstrukturen mit primären mikrovaskulären Endothelzellen oder endothelialen Vorläufer über den arteriellen Zufluss. Im zweiten Besiedlungsschritt folgte die Besiedlung des Matrixlumens (ehemaliger Darm) mit primären Hepatozyten. Dazu wurden die Zellen in einer Kollagen-I-Suspension ins Matrixlumen pipettiert und selbiges an beiden Seiten mit Klemmen verschlossen. Das so entstandene Co-Kultursystem ließ sich über einen Zeitraum von 2-3 Wochen im Bioreaktor kultivieren. Eine Probenentnahme zur Überwachung der Zellfunktionen erfolgte wochentäglich. Nach Versuchsende fand eine Fixierung der BioVaSc für die Herstellung von Paraffinpräparaten statt. Anhand der Expression der endothelzellspezifischen Marker CD 31 und FLK-1 konnte im Rahmen dieser Arbeit die Differenzierung porciner Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane Endothelzellen ließen sich unter Erhalt der genannten Marker in das Gefäßsystem integrieren und waren der Ursprung für neu entstandene Blutgefäße (Neoangiogenese). Die ins System integrierten Hepatozyten exprimierten ebenfalls zellspezifische Marker (CKLP 34, Hepatocyte), bildeten wichtige Zell-Zellkontakte wie Tight Junctions und Adherens Junctions aus und proliferierten. Durch die Anfärbung von Tight Junctions ließen sich zwischen den Zellen Gallenkanälchenstrukturen sichtbar machen. Eine Kommunikation zwischen Endothelzellen und Hepatozyten (cellular Cross-Talk) konnte über die Expression von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) belegt werden. Anhand der Mediumproben ließ sich nachgeweisen, dass die Hepatozyten bis zum Ende der Kultur Harnstoff sowie Albumin synthetisierten und Laktat bildeten. Der Phase-I- und Phase-II-Metabolismus von Dextrometorphan war im porcinen Modell ohne Enzyminduktion nachweisbar. Die Etablierung des Lebermoduls erfolgte zunächst aufgrund der besseren Verfügbarkeit auf Basis porciner Zellen. Die Ergebnisse ließen sich jedoch anschließend auf das humane Modell übertragen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die BioVaSc als Grundlage für ein Lebertestsystem eignet. Das hier aufgebaute System hat als erstes Modell ein Gefäßsystem zur Co-Kultur von Endothelzellen und Hepatozyten unter physiologischen Bedingungen. Erstmals stellt ein Lebermodell damit die Möglichkeit in Aussicht den Transport von im Blut gelösten Molekülen durch die sinusoidale Endothelzellschicht zu den Hepatozyten bzw. von Metaboliten durch die sinusoidale Endothelzellschicht zum Blut zu untersuchen.