Universität Stuttgart
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Item Open Access Measurement of soot precursor particles under atmospheric and low pressure conditions by means of time-of-flight mass spectrometry(2009) González Baquet, Tania; Aigner, Manfred (Prof. Dr.-Ing.)During the last decades a great progress has been achieved in the understanding of the combustion of hydrocarbons. The gas phase reactions governing the first steps in the combustion process are well understood. The existing models describing the growth of soot particles and the formation of soot aggregates are widely accepted, as well. However, the so-called inception, i.e. the mechanism leading to the formation of the first solid particles from gas phase molecules, is still a controversial issue. This is mainly due to the lack of adequate experimental techniques capable of detecting particles in the low nanometer range like those created in the nucleation process in flames. At present most of the combustion models stress the importance of PAH formation and growth in the soot formation process. Other models, however, propose a soot formation mechanism based on the formation of large three dimensional structures without crystallinity. In the present work, the detection and characterization of soot precursor particles, as transition species between gas phase molecules and solid soot particles in the combustion process, is attempted by means of mass spectrometry. To this end a ”custom-built” reflectron time-of-flight mass spectrometer of high sensitivity and with a large mass range is used. Measurements are carried out in different premixed ethylene laboratory flames at different pressures and in a wide range of stoichiometries. Additionally, the exhaust of a gasoline and a diesel engine is investigated. These measurements require the development of a sampling technique capable of transporting the sample from atmospheric conditions to the high vacuum of the mass spectrometer. The resulting fast pulsed sampling system minimizes undesirable sampling line effects while it enables the generation of an optimized molecular beam. Photo ionization of the sample is provided by an excimer laser. The main findings of this work can be summarized as follows: 1. Different types of soot precursor particles can coexist in the flame. For the first time two different types of soot precursor particles with diameters ranging from approximately 1 to 5 nm have been simultaneously detected. The different soot precursor particle modes, in the following referred to as mode A and mode B, show different features. Thus, the existence of at least two different types of soot precursor particles is postulated. Mode A particles are found in a wide range of flame stoichiometries. They are characterized by an ionization order close to two and show a fragmentation threshold of around 0.12 MW/cm2. These particles are considered amorphous, more characteristic of low temperature flames and associated to the soot precursor particles described by D’Alessio et al.. Mode B particles are only observed in a limited stoichiometric range associated with rather high flame temperatures. Mode B particles show an ionization order close to one and a relatively high fragmentation threshold close to 2.24 MW/cm2. These particles are considered to be similar to the ones described by Dobbins et al., i.e. stacks of planar PAHs. 2. Soot precursor particles, although considered to be very reactive, can survive the flame and be emitted. 3. Soot precursor particles are found in significant amounts only at flame stoichiometries above the soot threshold. The lower stoichiometric limit for particle generation is still an issue discussed in the combustion community. All results of this study indicate that the onset of particle formation takes place at flame stoichiometries close to the soot threshold. Consequently, the emission of soot precursor particles seems not to be an outstanding problem in the case of gasoline combustion engines, since the latter work under fairly stoichiometric burning conditions and are characterized by a homogeneous fuel-mixture. This is confirmed by the measurements carried out in the exhaust gas of a gasoline generator. Conventional diesel engines work under globally lean burning conditions but are characterized by a heterogeneous fuel-mixture. Consequently, high particle emissions are expected. The measurements carried out in the exhaust gas of a diesel generator, however, show negligible soot precursor particle emissions. In this case soot precursor particles are oxidized due to the excess of oxygen in the exhaust gas. Soot precursor particle losses due to coagulation with soot particles are also expected. This work demonstrates the utility of time-of-flight mass spectrometry for the detection and study of soot precursor particles. The experimental data presented in this thesis provide new information about the transition region between gas phase molecules and soot particles in the combustion process. This improves the understanding of the soot formation process and stimulates the revision of current combustion models.Item Open Access Bare and indefinite NPs in predicative position in French(2008) Mari, Alda; Martin, FabienneThis paper proposes a new analysis of the use of bare nouns vs. indefinite NPs in predicative position in French. We distinguish between predicational sentences (with the bare noun version) and equative sentences (with the indefinite version). We argue that bare nouns ascribe permanent properties to aspects of entities. As for the indefinites, we claim that they exhibit their specific reading and introduce an individual in a new situation, which is identified with the referent of the subject.Item Open Access Interrelationships of microstructure, stress and diffusion(2008) Kuru, Yener; Mittemeijer, Eric Jan (Prof. Dr. Ir.)Extensive research has been performed on thin metal films due to their interesting mechanical, electrical and magnetic properties. They can exhibit very high residual, internal stresses arising from the film growth and/or external effects. Apart from direct mechanical consequences, several processes such as grain growth and diffusion can be affected by these stresses and their gradients. As a result, it is of cardinal importance to measure and control the residual stresses in thin films. X-ray diffraction (XRD) is one of the most frequently used approaches for (residual) stress measurement. It is non-destructive, highly accurate (stress (variation) of some MPa can be detected) and the stress states of all crystalline phases in a layered structure can be obtained separately. Moreover, additional microstructural information, as the crystallographic texture, the density of crystalline defects, such as dislocations, and the crystal size can be acquired from the collected XRD data. This thesis is dedicated to the investigation of microstructural changes, residual stresses and interdiffusion in thin films by in-situ XRD. A focal point of interest is methodological aspects of in-situ measurements, which are discussed in detail in Chapter 2 and come to application in the following Chapters 3 and 4.Item Open Access Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.Item Open Access Dissertationen und Habilitationsschriften der Universität Stuttgart 2007/2, Juli - Dezember 2007(Stuttgart : Universitätsbibliothek, 2008)Item Open Access Modell-basierte Systemsimulation eines Kleinsatelliten mit einem FPGA-basierten On-board-Computer(2009) Falke, Albert; Röser, Hans-Peter (Prof. Dr.-Ing.)Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit der Systemsimulation des Satelliten Flying Laptop unter Weltraumbedingungen, mit dem Ziel die Funktionalitäten des Satellitensystems als Ganzes zu verifizieren. Simulation bezeichnet allgemein das Nachahmen des Verhaltens eines Systems oder Prozesses zum Zwecke der Analyse von Systemen, die für die theoretische oder formelmäßige Behandlung zu kompliziert sind. Auch im Kontext einer Kleinsatellitenmission ist das Satellitensystem bereits so komplex, dass man ohne die systemweite Simulation keine detaillierte Analyse unter Berücksichtigung der vielen miteinander interagierenden Komponenten mehr durchführen kann. Bereits seit einigen Jahren verwenden renommierte Satellitenhersteller Simulationstechnologien, um bereits während der Satellitenentwicklung und Fertigung den größtmöglichen Missionserfolg zu gewährleisten. Eine dieser Technologien ist die Modell-basierte Entwicklungs- und Verifikationsumgebung der Firma EADS Astrium GmbH aus Friedrichshafen. Sie bietet ein systematisches und standardisiertes Entwicklungs- und Verifikationsrahmenwerk im Sinne eines systemweiten Satellitensimulators an, um die Entwicklung von Satelliten, die Verifikation der On-board Software und den Gesamtfunktionsnachweis des Satelliten zu unterstützen. In diesem Simulator können alle Satellitenkomponenten modelliert und die On-board Software somit auf funktionaler Ebene verifiziert werden. Auf diese Weise können aufwendige und kostenintensive Entwicklungsmodelle einzelner Subsysteme und Schlüsseltechnologien wegfallen. Insbesondere sei hier die Verifizierung der Genauigkeit des Lageregelungssystems angesprochen. Als technologische Voraussetzung bringt gerade diese Entwicklungstechnologie budgetschwache Kleinsatellitenprojekte der Realisierung einen deutlichen Schritt näher und erhöht gleichzeitig die Güte des Systemdesigns des Satelliten. Im Rahmen einer Kooperation wurde diese Simulationsumgebung dem Institut für Raumfahrtsysteme zur Adaption und Anwendung im Stuttgarter Kleinsatellitenprogramm zur Verfügung gestellt. Zur Anwendung der Systemsimulation im Kleinsatellitenprojekt Flying Laptop sind alle relevanten Satellitenkomponenten im Simulator durch entsprechende, detaillierte Softwaremodelle abgebildet worden. Der sukzessiven Entwicklung der Komponentenmodelle ist durch den schrittweisen Aufbau von immer komplexeren Testständen der Software-Verifikations-Einrichtung Rechnung getragen worden. Infolgedessen erweiterten sich die Simulationsfähigkeiten von ersten Orbitsimulationen mit wenigen Komponentenmodellen, aber mit geschlossenem Simulationskreislauf, über die Simulation von Energie- und Thermalbilanzen unter Betriebsbedingungen bis hin zu vollständigen Systemsimulationen unter Einbindung der realen On-board Kontrollalgorithmen auf einem FPGA-Entwicklungsboard. Gerade dieses charakteristische FPGA-basierte On-board Computer System mit den darauf betriebenen Kontrollalgorithmen führt zu einer großen Herausforderung bei der modellhaften Repräsentation derselbigen im Systemsimulator. In diesem Zusammenhang stellt die Einbindung der realen On-board Kontrollalgorithmen auf einem FPGA-Entwicklungsboard in den geschlossenen Simulationskreislauf eine erfolgreich realisierte technische Neuerung dar. Zum Zeitpunkt der Fertigstellung dieser Arbeit steht dem Projekt Flying Laptop durch die Einbindung der realen On-board Kontrollalgorithmen auf dem FPGA-Entwicklungsboard ein umfangreicher Teststand mit großem Potential zur Entwicklung und zum Funktionsnachweis der On-board Kontrollalgorithmen zur Verfügung. Dieser wurde, wie die vorgestellten Simulationsergebnisse zeigen, bereits intensiv zum Testen der ersten Lageregelungsalgorithmen genutzt und kann auch zukünftig sukzessive mit Funktionserweiterungen der On-board Kontrollalgorithmen angewandt werden. Typische Missionsszenarien wie die Transition zwischen zwei Betriebsmodi des Satelliten oder der automatische Übergang in den SAFE Mode bei einem Fehler können jetzt simuliert und getestet werden. Die Ergebnisse dieser Simulationen dienen nicht nur dem reinen Funktionsnachweis der On-board Kontrollalgorithmen, sondern fließen direkt in die Optimierung der Kontrollalgorithmen zurück und führen so zu einem iterativem Verbesserungsprozess. Der Systemsimulator ist mit seiner Datenbank als Teil seiner Infrastruktur ganz gezielt so implementiert worden, dass einzelne Testszenarien einfach und ohne wiederholten Konfigurationsaufwand reproduziert werden können. Somit unterstützt der Systemsimulator den sich in der Softwareentwicklung typischerweise iterativ wiederholenden Verifikationsprozess in einer optimalen Form.Item Open Access Mikroskopische Thermodynamik kolloidaler Teilchen(2008) Blickle, Valentin; Bechinger, Clemens (Prof.)Einhergehend mit der industriellen Revolution des 19. Jahrhunderts entwickelte sich ein neues eigenständiges Teilgebiet der Physik, die Thermodynamik. Im Mittelpunkt des Interesses standen damals Wärmekraftmaschinen und das Verständnis der Umwandlung von Wärme in mechanische Arbeit. Im Rahmen der Thermodynamik lassen sich auch chemische Reaktionen oder biologische Prozesse beschreiben. Dabei bleibt sie auf große Systeme beschränkt, wo eine Vielzahl von inneren Freiheitsgraden dazu führt, dass Fluktuationen vernachlässigt werden können. Mit zunehmender Verfeinerung und Miniaturisierung der physikalischen Prozesse im allgemeinen und der damit verbundenen Ausdifferenzierung der Manipulations- und Messmethoden erlebte das Interesse an thermodynamischen Prozessen - diesmal auf mikroskopischer Ebene - eine Renaissance. Richtungsweisend für diese Verfeinerung sind vor allem Kraftmikroskopie und optische Pinzetten, die es erlauben, Systeme auf einer Nanometer-Skala zu untersuchen. Von Bedeutung sind hierbei biologische Maschinen, Makromoleküle, oder auch miniaturisierte mechanische Bauelemente. Typischerweise sind die charakteristischen Energieskalen dieser Systeme von der Größenordnung her vergleichbar mit der thermischen Energie, so dass Fluktuationen nicht vernachlässigt werden können. Als weitere Kategorie von mesoskopischen Systemen stehen kolloidale Partikel im Blickpunkt dieser Arbeit. Diese in einem Lösungsmittel suspendierte Teilchen erweisen sich dabei als ideale Objekte, um die statistischen Eigenschaften kleiner Systeme zu untersuchen. Hierbei kombinieren kolloidale Systeme zwei Vorteile. Erstens spielen sich die Fluktuationen auf einer Längenskala ab, auf der sie mittels optischer Mikroskopie beobachtet werden können. Zweitens können Wechselwirkungen in kolloidalen Systemen durch Zugabe von Ionen bzw. Polymeren maßgeschneidert werden. Die Wechselwirkung der Kolloidpartikel mit externen Feldern bietet eine weitere Möglichkeit der Manipulation. Dabei eröffnen Laserpinzetten die Möglichkeit, durch Einstellung externer Parameter wie Intensität, Position, Polarisation etc., das System auf einer mikroskopischen Skala schnell und reproduzierbar von außen zu manipulieren. Diese Arbeit wendet sich der experimentellen Überprüfung der stochastischen Thermodynamik zu. In einem ersten Experiment befindet sich das untersuchte Kolloidteilchen vor einer Glasoberfläche und wird von zwei koaxialen antiparallelen optischen Pinzetten festgehalten. Mit Hilfe dieser kann das Partikel aus dem Gleichgewicht heraus getrieben werden, gleichzeitig wird dessen Position durch evaneszente Lichtstreumikroskopie (TIRM, engl.: Total Internal Reflection Microscopy) mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verfolgt. Sowohl die geleistete Arbeit W als auch die ins Wärmebad übertragene Wärme Q können aus der gemessenen Partikeltrajektorie direkt berechnet werden. Somit bringt dieses Experiment den Nachweis, dass der erste Hauptsatz der Thermodynamik auch für fluktuierende Größen erfüllt ist. Charakteristisch ist jetzt nicht mehr der Wert einer Einzelmessung W, sondern die Verteilung p(W), die man erhält, wenn über viele Messungen gemittelt wird. Den theoretischen Vorhersagen entsprechend ist diese Verteilung asymmetrisch und nicht Gauß'sch. Dennoch zeigen die Experimente, dass sowohl die Jarzynski-Relation als auch das das detaillierte Fluktuationstheorem erfüllt sind. In einem zweiten Experiment wird ein Kolloidteilchen mit Hilfe einer rotierenden Laserpinzette so getrieben, dass es sich mit konstanter Geschwindigkeit auf einer Kreisbahn bewegt. Durch Modulation der Laserleistung wird ein zusätzliches schwaches sinusförmiges Potential V entlang der Kreisbahn erzeugt. Der so generierte stationäre Nichtgleichgewichtszustand wird zwar wie ein Gleichgewichtszustand durch eine zeitunabhängige Wahrscheinlichkeitsverteilung charakterisiert, besitzt im Gegensatz zu diesem jedoch einen nicht verschwindenden Strom, permanent wird Energie ins Wärmebad abgegeben. Dies führt zur Verletzung des Boltzmann-Faktors, der im Gleichgewicht das Potential mit der stationären Wahrscheinlichkeitsverteilung verknüpft. Unter Berücksichtigung des Stromes leiten wir eine Erweiterung des Boltzmann-Faktors her, so dass das Potential auch unter stationären Nichtgleichgewichtsbedingungen direkt aus der stationären Wahrscheinlichkeitsverteilung berechnet werden kann. Die diffusive Bewegung des Kolloidpartikels in einem gekippten periodischen Potential unterscheidet sich fundamental von der Brown'schen Bewegung im thermischen Gleichgewicht, wo ein zusätzliches Potential V immer die Diffusionsbewegung eines freien Teilchens einschränkt. Im stationären Nichtgleichgewicht kann diese durch die Anwesenheit eines Potentials verstärkt werden. Wie die Experimente zeigen, durchläuft der Diffusionskoeffizient als Funktion der treibenden Kraft ein Maximum. In dem als Giant Diffusion bekannten Phänomen übersteigt, in guter Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen, der gemessene Diffusionskoeffizient seinen Gleichgewichtswert um das Fünffache. Die beobachtete Kraftabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten hat weitreichende Konsequenzen. Die für das Gleichgewicht so fundamentale Einstein-Relation ist im stationären Nichtgleichgewicht nicht mehr gültig. Die Experimente zeigen eine Abweichung von fast einer Größenordnung. Wir zeigen, dass durch Addition einer Geschwindigkeitskorrelationsfunktion die Einstein-Relation korrigiert werden kann. Deren Gültigkeit umfasst dann auch wieder stationäre Nichtgleichgewichtszustände.Item Open Access The active subunits of the 20S Proteasome in Saccharomyces cerevisiae : mutational analysis of their specificities and a C-terminal extention(2008) Estiveira, Rui José Cabrita; Heinemeyer, Wolfgang (PD Dr.)The proteasome is a large multi-subunit complex ubiquitous in eukaryotes and archaebacteria. It contains proteolytic subunits that function simultaneously to digest protein substrates into oligopeptides. In eukaryotic cells, it is involved in the removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, but additionally it has regulatory functions. For example it is responsible for the degradation of cyclins in cell-cycle control and for the destruction of transcription factors or metabolic enzymes in metabolic adaptation. Finally, the proteasome is also involved in MHC (major histocompatibility complex) class I mediated cellular immune response. These cellular functions are linked to an ubiquitin- and ATPrequiring protein degradation pathway involving the 26S proteasome whose proteolytic core is formed by the 20S proteasome. The 20S proteasome has a cylindrical shape and is composed of four rings, each formed by seven α- or seven β-subunits and stacked in the order αββα. In eukaryotic cells, the 20S proteasome is composed of two copies of 14 different subunits, 7 distinct α-type and 7 distinct β-type subunits. Only three of the β-type subunits are proteolytically active and have N-terminal threonine residues acting as nucleophiles. They differ in their major specificities: β5/Pre2, β2/Pup1 and β1/Pre3 are classified as having "chymotrypsin-like", "trypsin-like" and "peptidylglutamyl peptide hydrolysing" (PGPH or caspase-like) activities, respectively. This classification is based on the preferred amino acid residues found at the site of hydrolysis in peptide or protein substrates. These three active β-type subunits have a fixed location in the proteasome, with the two β5/Pre2 copies separated from the clustered β2/Pup1 and β1/Pre3 subunits. In yeast a hierarchy of individual subunit activities for proteasomal function was established: β5/Pre2>> β2/Pup1 > β1/Pre3. Part of this work aimed at clarifying whether this hierarchy is solely dependent on the specificities or whether topological conditions lead to the dominance of the β5/Pre2 activity over the others, which could involve inter-subunit communication mediated by interjacent inactive β-subunits. Stepwise site-directed mutagenesis of key residues forming the substrate binding pockets was used to swap specificities between the yeast β5/Pre2 and β1/Pre3 active sites. Consequences of these mutations were then analysed in regard to maturation of the modified subunits, their specificities towards peptide substrates diagnostic for chymotrypsin-like and PGPH activity and changes in their rank in the hierarchy of functional importance. By mutating the key residue methionine 45 into an arginine, the β5/Pre2 was able to mature and showed some PGPH activity. Combinations with mutant strains, having the other active subunits inactivated, revealed that Pre2 lost its functional dominance. When other key residues were additionally replaced by those present in β1/Pre3 (A20T, V31T, I35T), instead of an further increase in PGPH activity, the β5/Pre2 subunit showed an overall decrease in activity. An unexpected exception was the pre2-M45R-I35T mutant with a strong increase in chymotrypsin-like activity. Maturation of the Pre2 subunit occurred normally like in wild-type in all combinations of mutations tested. When the residue arginine 45 was mutated into a methionine in Pre3, this subunit lost any detectable peptidase activity. Attempts to stabilise the methionine 45 by introducing strategic point mutations at residue 52 were unsuccessful. Additional alterations in the substrate binding site of β1/Pre3 (T20A, T31V, T35I) completely abolished the autolytic maturation and thus any gain of activity. Strains lacking both the Pre3 propeptide and Nα-acetyltransferase were used to confirm that the mutations result in activity loss, even when the autolytic removal of the propeptide was not required. In a second project, the role of the long C-terminal extension of the yeast β2/Pup1 subunit was examined. This 37 amino acid structure embraces the β-ring neighbor subunit β3/Pup3 and reaches the next subunit β4/Pre1. It also contacts β7/Pre6 of the opposite β-ring. Mutations of residues that could loosen contact to the surface of β3/Pup3 (Y204A, R208G and T211A) where without effect. Complete deletion of this extension or truncation of 25 residues was lethal and deletion of the last 20 amino acids caused a strong cell growth defect. When replacing the last 20 amino acids of this C-terminal extension by a FLAG tag, the growth phenotype was lost. The lethal mutations were over-expressed in wild type strains, but the mutated β2 subunits did not incorporate into proteasomes. This indicates that removal of the distal half from the β2/Pup1 C-terminal extension impedes the integration of this subunit during early assembly stages of the 20S proteasome.Item Open Access Detektion und Charakterisierung von Zellwandproteinen in Candida albicans(2008) Hiller, Ekkehard; Brunner, Herwig (Prof. Dr.)Candida albicans ist ein weit verbreiteter human pathogener Organismus, der sowohl oberflächliche wie auch systemische Infektionen verursacht. Diese treten vor allem bei Personen mit geschwächtem Immunsystem auf. Bei der Infektion spielen die Zellwand und ihre Bestandteile eine besonders wichtige Rolle. Dieses komplexe Netzwerk aus Glucan, Chitin, Mannan und Proteinen stellt die Naht¬stelle der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen dar. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mehrere der in dieses Netzwerk eingebundenen Proteine ausschlaggebend für die Adhäsion und die Interaktion mit dem Wirt und seinem Immunsystem sind. Hinweise auf Änderungen im Zell¬wand-Proteom während des Übergangs vom Wachstum als Blastosporen hin zu Hyphen wurden zuerst im Microarray Experimenten gefunden, und konnten später in Untersuchungen bestätigt werden, die sich auf die Zellwandproteine konzentrierten. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Proben¬vorbereitung verglichen, um die kovalent an die Zellwand gebundenen Proteine oder deren Peptide durch massen¬spektro¬metrische Methoden zu identifizieren. Trypsin, Endo¬proteinase Glu-C und Bromcyan zur Freisetzung von Proteinfragmenten wurden allein oder in Kombination verwendet und miteinander verglichen. Zusätzlich untersucht wurden die Auswirkungen einer Vor¬behandlung der Zell¬wand durch eine β-1,3-Glucanase. Die Identifikation der Peptide erfolgte mittels zweier verschiedener Massenspektrometer. Insgesamt konnten 33 Proteine in der Wachstumsform der Blastosporen identifiziert werden, sechs davon mit vorhergesagtem GPI-Anker. Im Gegensatz dazu wiesen 14 der 18 identifizierten Proteine aus Hyphen-Zellen diese spezifische Ankersequenz auf, 12 davon sind in dieser Wachstumsform transkriptionell induziert. Zwischen den verwendeten Methoden wurde eine hohe Varianz in der Zahl identifizierter Proteine, bzw. der Zahl zu einem Protein gehörender Peptide, gefunden. Zusätzlich wurden die von C. albicans in synthetische Flüssigmedien sekretierten Proteine identifiziert. Unter den sowohl von Blastosporen wie auch Hyphen sekretierten Proteinen befand sich Sun41p. In einer früheren Arbeit wurde gezeigt, dass die Transkription dieses Proteins in Hyphen induziert wird. Die SUN Gen Familie, zu der es gehört, wurde in S. cerevisiae definiert und beinhaltet eine für Pilze spezifische Familie von Proteinen die eine hohe Übereinstimmung in ihrer C-terminalen Domäne aufweisen. Gene dieser Familie sind in unterschiedliche zelluläre Prozesse wie DNS-Replikation, Alterung, mitochondriale Biogenese und Cytokinese involviert. In C. albicans gehören zwei Gene, SUN41 und SIM1, dieser Familie an. Da Sun41p als potentieller Virulenz¬faktor Ziel einer gegen Pilze gerichteten Therapie darstellen kann, wurde seine Funktion durch die Konstruktion einer SUN41 Deletionsmutante untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass C. albicans Mutanten ohne SUN41 ähnliche Defekte aufweisen wie sie auch bei entsprechenden S. cerevisiae Mutanten gefunden wurden. Dies beinhaltet unter anderem Defekte bei der Cyto¬kinese. Zusätzlich zeigten die SUN41 Mutanten eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber der die Zellwand schädigende Substanz Kongorot, wohingegen bei der Anwesenheit von Calcofluor Weiß keine Veränderung beobachtbar war. Im Vergleich mit dem Wildtyp wies der SUN41 Deletions-Stamm Defekte bei der Bildung von Biofilmen auf, zeigte eine reduzierte Adhäsion auf einem epithelialen Gewebemodell und konnte unter den getesteten Bedingungen auf Festmedien keine Hyphen bilden. Die Ergebnisse deuten auf eine Funktion von Sun41p als Glycosidase hin, die an der Zellwand-Biogenese beteiligt ist und dadurch die Cytokinese, die Adhäsion am Wirtsgewebe, die Bildung von Biofilmen und die Virulenz beeinflusst. Dies weist auf eine wichtige Rolle von Sun41p bei der Interaktion des Pathogen mit dem Wirt hin.Item Open Access Identification of novel protein binding partners for the tumor suppressor DLC1(2009) Heering, Johanna; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)Cancer, one of the major chronic health problems worldwide, is a genetic disease, which requires the cooperation of gain-of-function and/or loss-of-function mutations to either oncogenes or tumor suppressor genes, respectively. In the last decade, the Deleted in Liver Cancer (DLC) 1 gene has emerged as a novel tumor suppressor downregulated in a variety of cancer types including breast, liver, prostate and lung. DLC1 is a multidomain protein consisting of an N-terminal sterile alpha motif (SAM), a C-terminal START and an internal Rho GTPase activating (GAP) domain. Due to GAP-dependent and -independent mechanisms that are still poorly understood DLC1 is able to inhibit proliferation, migration and invasion of tumor cells. The goal of this thesis was the identification of novel DLC1 protein binding partners, in order to gain deeper insight into DLC1 regulation and molecular function. Therefore, a yeast-two-hybrid screen based on the Gal4-system was performed, using the DLC1 SAM domain as a bait and a cDNA library derived from human breast tissue as a prey. One of the 16 putative binding candidates identified was the phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN), which is also a tumor suppressor frequently deleted or mutated in sporadic tumors of the breast, prostate, endometrium and brain. PTEN consists of an enlarged catalytic site that acts as a dual-specificity phosphatase for proteins and lipids. By dephosphorylation of its major lipid substrate phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3) the PI3K signaling pathway is downregulated and cell proliferation and survival mediated by Akt/PKB activation are inhibited. Cell spreading and cell motility are also suppressed by PTEN activity. Pulldown assays and coimmunoprecipitation of DLC1 and PTEN confirmed association of the proteins in mammalian cells. The interaction of both proteins was stimulated upon PTEN activation by PDGF treatment, correlating with their colocalization at the plasma membrane. In overexpression experiments synergistic effects of the two proteins with regard to downstream signaling could not be observed. However, simultaneous loss of DLC1 and PTEN in the non-invasive MCF7 breast carcinoma cell line using RNA interference enhanced migration in an additive manner in wounding as well as in chemotactic transwell assays compared to singly depleted cells. These results suggest that the spatio-temporally restricted formation of a DLC1/PTEN complex, simultaneously inhibiting its individual downstream targets, guarantees the synchronization of cell migration processes. Thus, loss of both proteins is proposed to facilitate malignant transformation by increasing the metastatic potential of tumor cells. Another putative DLC1 binding partner identified in the yeast-two-hybrid screen was liprin beta2 that belongs to a protein familiy comprising four alpha- and two beta-type family members, which all contain a C-terminal highly conserved liprin homology (LH) domain consisting of three SAM domains. Association of full-length DLC1 with liprin beta2 as well as with the additional family members liprin alpha1 and beta1 was confirmed biochemically by coimmunoprecipitation. Liprins are multivalent proteins that form complex structures due to homo- and heterodimerization. Additionally, alpha-type liprins interact with the LAR subfamily of receptor protein-tyrosine phosphatases, which are heterophilic receptors involved in cell adhesion and cell motility. Given the function of liprins as adaptor proteins at membrane proximal sites, it is conceivable that they contribute to DLC1 localization and/or scaffolding. It is thus of particular interest to investigate the biological impact of DLC1 binding to liprin proteins in future studies.