Universität Stuttgart
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Item Open Access Specific DNMT3C flanking sequence preferences facilitate methylation of young murine retrotransposons(2024) Dossmann, Leonie; Emperle, Max; Dukatz, Michael; de Mendoza, Alex; Bashtrykov, Pavel; Jeltsch, AlbertThe DNA methyltransferase DNMT3C appeared as a duplication of the DNMT3B gene in muroids and is required for silencing of young retrotransposons in the male germline. Using specialized assay systems, we investigate the flanking sequence preferences of DNMT3C and observe characteristic preferences for cytosine at the -2 and -1 flank that are unique among DNMT3 enzymes. We identify two amino acids in the catalytic domain of DNMT3C (C543 and V547) that are responsible for the DNMT3C-specific flanking sequence preferences and evolutionary conserved in muroids. Reanalysis of published data shows that DNMT3C flanking preferences are consistent with genome-wide methylation patterns in mouse ES cells only expressing DNMT3C. Strikingly, we show that CpG sites with the preferred flanking sequences of DNMT3C are enriched in murine retrotransposons that were previously identified as DNMT3C targets. Finally, we demonstrate experimentally that DNMT3C has elevated methylation activity on substrates derived from these biological targets. Our data show that DNMT3C flanking sequence preferences match the sequences of young murine retrotransposons which facilitates their methylation. By this, our data provide mechanistic insights into the molecular co-evolution of repeat elements and (epi)genetic defense systems dedicated to maintain genomic stability in mammals.Item Open Access Studies on the influence of loop structures on the selective hydroxylation of sesquiterpenes in Rieske Dioxygenases(2025) Berger, Jonathan; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Oxyfunktionalisierte Verbindungen spielen eine zentrale Rolle in der synthetischen Chemie, sei es als Geschmacks- und Duftstoffe, in der Pharmaindustrie oder als Basischemikalien. Besonders bei den Duftstoffen und Pharmazeutika ist die Kontrolle der Selektivität in Oxyfunktionalisierungsreaktionen von großer Relevanz. Jedoch bleibt die selektive Monohydroxylierung und cis-Dihydroxylierung von Arenen ein ungelöstes Problem. Besonders bei Verbindungen mit mehreren ungesättigten Doppelbindungen, wie Sesquiterpenen, ist die Kontrolle der Regioselektivität eine Herausforderung. Wenn die synthetische Chemie an ihre Grenzen stößt, kann die Natur als Vorbild dienen, da Enzyme für ihre hervorragende Selektivitätskontrolle und nachhaltigen Reaktionsbedingungen bekannt sind. Eine vielversprechende Enzymfamilie für Oxyfunktionalisierungen sind die Rieske-non-Häm-Eisen-Dioxygenasen (ROs), die cis-Dihydroxylierungsreaktionen an Aromaten und anderen Substraten sowie allylische Monohydroxylierungen mit hoher Regio- und Stereoselektivität durchführen können. ROs waren das Ziel einiger Enzym-Engineering-Studien, und sind deshalb vielversprechende Mutageneseziele. Ziel dieser Studie war es, das Substratspektrum von ROs auf die sterisch anspruchsvolleren Sesquiterpene auszuweiten, da diese Moleküle und ihre oxyfunktionalisierten Derivate von großem industriellem Interesse sind, beispielsweise als Sandelholzduftstoff Santalol oder Bisabolol-Derivate, die als Pheromone für den Pflanzenschutz eingesetzt werden. Um das Verständnis gegenüber der eingangs erwähnten, hochflexiblen und dynamischen Loop-Strukturen zu verbessern sollten zusätzlich die Loop-Studien von Peter Heinemann aufgegriffen werden, seinen initialen Mutationsansatz für Loops vertiefen und zur besseren Aufklärung molekulardynamische Simulationen einsetzen. Im ersten Teil wurden RO-Wildtypen aus der IBTB-internen Mutantenbibliothek mit den Sesquiterpensubstraten β-Bisabolen 1 und α-Farnesen 2 getestet, wobei die Cumol Dioxygenase aus Pseudomonas fluorescens IP01 als einziges Enzym eine Startaktivität für Bisabolen aufwies. Da die Startaktivität sehr gering war, wurden die Expressionsbedingungen und das Reaktionssystem optimiert, was zu einer 4-fachen Erhöhung der Produktbildung mit β-Bisabolen als Screening-Substrat führte. Im nächsten Schritt wurde der Einfluss von Loop-insertionen und -deletionen auf die Substratspezifität mittels InDel-Scans untersucht, einem in dieser Arbeit entwickelten Screeningverfahren, bei dem alle Aminosäuren eines Loops separat deletiert bzw. ein Glycyl-Prolyl-Fragment zwischen jede Aminosäure eingefügt wird, um eine Screening-Bibliothek zu generieren. Das Screening führte mit β-Bisabolen zu einer interessanten Verschiebung der Regioselektivität, vom Ring-hydroxylierungsprodukt 1a im WT zum terminalen Hydroxylierungs-produktes 1b (Selektivität: 81%) in der Variante I288del. Zur Identifizierung der Produkte durch präparative Biotransformationen wurden verschiedene Bedingungen getestet, die Produkte isoliert und mittels NMR-Analyse charakterisiert (1a: 17 mg, 0.77 mmol, 38,5%; 1b: 24 mg, 0.11 mmol, 54.5%). Um ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden enzymatischen Mechanismen der Selektivitätsverschiebung zu erlangen, wurden molekulardynamische Simulationen in Zusammenarbeit mit den Loschmidt Laboratories in Brünn, Tschechische Republik, durchgeführt. Für den Wildtypen und die Variante I288del wurden molekulardynamische Simulationen mit dem freien Enzym und mit Enzym-Ligand-Komplexen simuliert. Die Simulationen lieferten wertvolle Einblicke in die enzymatischen Eigenschaften: Die B-Faktoren des freien Enzyms und der Enzym-Ligand-Komplexe zeigten, dass die Variante I288del ein rigideres aktives Zentrum besitzt, was den Liganden potenziell besser stabilisieren kann. Zusätzlich ergab die CAVER-Analyse des Substratzugangstunnels, dass der Tunnel jetzt häufiger offen ist, so dass das Substrat leichter in das Enzym eindringen kann, was zu einer höheren Produktbildung führt. Die Analyse der Abstände zwischen dem katalytischen Eisen und den reaktiven Kohlenstoffen im Substrat zeigte, dass der reaktive Schwanzkohlenstoff in der Variante näher am Eisen liegt, was potenziell zu reaktiverenKonformationen führt. Über abschließende adaptive steered molecular dynamics Simulationen, wurden Einblicke in den energetischen Ligandentransport entlang des Substratzugangstunnels erhalten. Diese Simulationen zeigten, dass das Substrat im Wildtyp bevorzugt mit dem Ring zuerst in das Enzym eindringt, was zu einer Ringkonformation im aktiven Zentrum führt. In der Variante I288del ändert sich dies, da der Ligand stark bevorzugt mit dem terminalen Kohlenstoff zuerst in das Enzym eindringt, was zu tail-Konformationen im Enzym und einer starken Präferenz für das terminale Hydroxylierungsprodukt führt. In einem zweiten experimentellen Teil sollte die Produktbildung des terminalen-Hydroxylierungsprodukts 1b durch gezielte Modifikation des aktiven Zentrums mittels Sättigungsmutagenese weiter gesteigert werden, um die Positionierung des Substrats in der aktiven Tasche zu optimieren. Dies führte zu zwei neuen Varianten, I288del_A321T (V1) und N279T_I288del_A321T (V2), mit hoher Selektivität und Produktbildungen von 1,35 mM bzw. 1,58 mM, während die Variante I288del 1,25 mM umsetzte. Weitere Runden der Sättigungsmutagenese führten jedoch weder zu einer Steigerung der Produktbildung noch der Selektivität. Zudem wurden die Sesquiterpene Santalen, Bergamoten, Valencen und Germacren D, welche ursprünglich vom Wildtyp nicht umgesetzt wurden, mit den neu generierten Sättigungsvarianten I288del, V1 und V2 untersucht. Mit diesen Varianten gelang es, drei der vier Substrate umzusetzen. Besonders bemerkenswert war, dass Santalen zu dem industriell relevanten Santalol mit einer GC-Konversion von 0,74 mM umgesetzt werden konnte, was in Zusammenarbeit mit der Firma Isobionics (Geleen, NL) zu einem Patent führte. Im nächsten Teil wurde der InDel-Scan weiter ausgebaut, indem die CDO InDel-Bibliothek mit zwei weiteren Substraten, (R)-Limonen und 2-Phenylpyridin, gescreent wurde. Hierbei lagen Selektivitätsverschiebungen, Generalistenvarianten und erhöhte Produktbildung im Fokus. Mit beiden Substraten wurden Varianten mit erhöhter Selektivität, Aktivität oder neuen Produkten gefunden. Um die Anwendbarkeit nicht nur auf Substratebene, sondern auch auf Enzymebene zu untersuchen, wurde ein weiteres Enzym, die Naphthalin-Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4, getestet. Vier active site-Loops wurden ausgewählt und mit dem InDel-Scan mutiert, was zu einer Bibliothek von 56 Varianten für das Screening mit (R)-Limonen und 2-Phenylpyridin führte. Die Ergebnisse ähnelten den Ergebnissen des Screenings mit dem CDO, zeigten jedoch mehr inaktive Varianten und nur wenige starke Selektivitätsverschiebungen. Einige Varianten zeigten ein komplett verändertes Produktspektrum oder starke Zunahmen in der Produktbildung, und bei 2-Phenylpyridin als Substrat trat mit den InDel-Varianten sogar ein völlig neues, unbekanntes Produkt auf. In einem abschließenden Abschnitt sollte ein direkter Vergleich zu einer computerbasierten Loopmutagenese durchgeführt werden. In Zusammenarbeit mit den Loschmidt Laboratories wurde ein Looptransplantationsansatz unter Verwendung des LoopGrafter-Webtools getestet, welches Loops verschiedener Enzyme vergleicht und Positionen für die Transplantation vorschlägt. Vier verschiedene Designs wurden kloniert und getestet, wobei keine Produktbildung beobachtet wurde. Die Designs wurden überarbeitet, um ihre Stabilität zu erhöhen. Die Expression des Proteins war erfolgreich, aber erneut konnte keine Aktivität festgestellt werden. Zusammenfassend gelang es, im Rahmen dieser Arbeit, Sesquiterpene mit ROs in angemessenen Ausbeuten umzusetzen, wobei sogar Milligramm-Mengen zur Produktidentifizierung erreicht wurden. Eine vollständige Selektivitätsverschiebung in der Hydroxylierung von β-Bisabolen von Ring- zu Terminal-Hydroxylierung wurde erzielt. Die computergestützte Studie lieferte wertvolle Einblicke in den Ligandentransport in ROs und die durch die Loop-Mutation I288del vermittelten Mechanismen, welche zum Selektivitätsshift führten.Item Open Access Visual analysis of large‐scale protein‐ligand interaction data(2021) Schatz, Karsten; Franco‐Moreno, Juan José; Schäfer, Marco; Rose, Alexander S.; Ferrario, Valerio; Pleiss, Jürgen; Vázquez, Pere‐Pau; Ertl, Thomas; Krone, MichaelWhen studying protein‐ligand interactions, many different factors can influence the behaviour of the protein as well as the ligands. Molecular visualisation tools typically concentrate on the movement of single ligand molecules; however, viewing only one molecule can merely provide a hint of the overall behaviour of the system. To tackle this issue, we do not focus on the visualisation of the local actions of individual ligand molecules but on the influence of a protein and their overall movement. Since the simulations required to study these problems can have millions of time steps, our presented system decouples visualisation and data preprocessing: our preprocessing pipeline aggregates the movement of ligand molecules relative to a receptor protein. For data analysis, we present a web‐based visualisation application that combines multiple linked 2D and 3D views that display the previously calculated data The central view, a novel enhanced sequence diagram that shows the calculated values, is linked to a traditional surface visualisation of the protein. This results in an interactive visualisation that is independent of the size of the underlying data, since the memory footprint of the aggregated data for visualisation is constant and very low, even if the raw input consisted of several terabytes.Item Open Access Refined read‐out : the hUHRF1 Tandem‐Tudor domain prefers binding to histone H3 tails containing K4me1 in the context of H3K9me2/3(2023) Choudalakis, Michel; Kungulovski, Goran; Mauser, Rebekka; Bashtrykov, Pavel; Jeltsch, AlbertUHRF1 is an essential chromatin protein required for DNA methylation maintenance, mammalian development, and gene regulation. We investigated the Tandem-Tudor domain (TTD) of human UHRF1 that is known to bind H3K9me2/3 histones and is a major driver of UHRF1 localization in cells. We verified binding to H3K9me2/3 but unexpectedly discovered stronger binding to H3 peptides and mononucleosomes containing K9me2/3 with additional K4me1. We investigated the combined binding of TTD to H3K4me1-K9me2/3 versus H3K9me2/3 alone, engineered mutants with specific and differential changes of binding, and discovered a novel read-out mechanism for H3K4me1 in an H3K9me2/3 context that is based on the interaction of R207 with the H3K4me1 methyl group and on counting the H-bond capacity of H3K4. Individual TTD mutants showed up to a 10,000-fold preference for the double-modified peptides, suggesting that after a conformational change, WT TTD could exhibit similar effects. The frequent appearance of H3K4me1-K9me2 regions in human chromatin demonstrated in our TTD chromatin pull-down and ChIP-western blot data suggests that it has specific biological roles. Chromatin pull-down of TTD from HepG2 cells and full-length murine UHRF1 ChIP-seq data correlate with H3K4me1 profiles indicating that the H3K4me1-K9me2/3 interaction of TTD influences chromatin binding of full-length UHRF1. We demonstrate the H3K4me1-K9me2/3 specific binding of UHRF1-TTD to enhancers and promoters of cell-type-specific genes at the flanks of cell-type-specific transcription factor binding sites, and provided evidence supporting an H3K4me1-K9me2/3 dependent and TTD mediated downregulation of these genes by UHRF1. All these findings illustrate the important physiological function of UHRF1-TTD binding to H3K4me1-K9me2/3 double marks in a cellular context.Item Open Access Structure, activity and function of the NSD3 protein lysine methyltransferase(2021) Rathert, PhilippNSD3 is one of six H3K36-specific lysine methyltransferases in metazoans, and the methylation of H3K36 is associated with active transcription. NSD3 is a member of the nuclear receptor-binding SET domain (NSD) family of histone methyltransferases together with NSD1 and NSD2, which generate mono- and dimethylated lysine on histone H3. NSD3 is mutated and hyperactive in some human cancers, but the biochemical mechanisms underlying such dysregulation are barely understood. In this review, the current knowledge of NSD3 is systematically reviewed. Finally, the molecular and functional characteristics of NSD3 in different tumor types according to the current research are summarized.Item Open Access Biocatalytic allylic oxidation with bacterial P450 monooxygenases(2023) Bogazkaya, Anna Maria; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Diese Forschungsarbeit konzentriert sich auf die Identifizierung und Charakterisierung geeigneter Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) in Streptoyceten. Durch eine Dünnschichtchromatographie (DC)-Methode wurden zwei vielversprechende Streptomyces-Stämme identifiziert. Aus diesen Stämmen wurden die Enzyme CYP105A1, CYP105B1, CYP105D5 und CYP170A1 kloniert und in E. coli zur weiteren Untersuchung exprimiert. Da die natürlichen Redoxpartner dieser CYPs unbekannt sind, wurde ein heterologes Redoxsystem aus Pseudomonas putida verwendet. Diese Arbeit liefert wichtige Einblicke für die industrielle Anwendung dieser Enzyme in der biokatalytischen Oxidation. Interessanterweise zeigten die Studienergebnisse, dass drei der ausgewählten CYPs (CYP105B1, CYP105D5 und CYP170A1) zyklische Modell Substrate wie α- oder β-Ionon auf eine regioselektive Weise zu Allylalkoholen hydroxylierten. Diese Reaktion erzeugt spezifisch Allylalkohole, was eine hohe Regioselektivität zeigt - das heißt, die Enzyme zielten gezielt auf bestimmte Teile der Moleküle ab, um sie zu oxidieren. Andererseits führte die Oxidation von azyklischen Substraten mit diesen Enzymen zu einer Mischung von regioisomeren Epoxiden. Dies zeigt eine Vielseitigkeit der Enzyme, aber auch eine Variation in der Produktverteilung, abhängig von der Struktur des Ausgangssubstrats. Diese Ergebnisse tragen dazu bei, das Verständnis für die Funktionsweise und die potenzielle Anwendung von CYPs in der Synthese von spezifischen und wertvollen Produkten zu erweitern. Sie unterstreichen das Potenzial von CYPs als leistungsstarke Werkzeuge in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie, wo selektive und effiziente Oxidationsmethoden dringend benötigt werden. Zur Vereinfachung der Anwendung dieser Ganzzellkatalysatoren in industriellen Prozessen wurde ein innovativer Ansatz zur Immobilisierung dieser Zellen in einer Latex SF091-Schicht erarbeitet, dank der Zusammenarbeit mit Prof. Michael Flickinger von der NC State University, USA. Nach erfolgreicher Immobilisierung der Zellen zeigten die Reaktionen eine bemerkenswerte Produktselektivität: Bei der Oxidation von Nerol mit CYP154E1 wurden 97% 8-Hydroxynerol und nur 3% 2,3Epoxynerol erzeugt.Item Open Access The Bacteroidetes Aequorivita sp. and Kaistella jeonii produce promiscuous esterases with PET-hydrolyzing activity(2022) Zhang, Hongli; Perez-Garcia, Pablo; Dierkes, Robert F.; Applegate, Violetta; Schumacher, Julia; Chibani, Cynthia Maria; Sternagel, Stefanie; Preuss, Lena; Weigert, Sebastian; Schmeisser, Christel; Danso, Dominik; Pleiss, Jürgen; Almeida, Alexandre; Höcker, Birte; Hallam, Steven J.; Schmitz, Ruth A.; Smits, Sander H. J.; Chow, Jennifer; Streit, Wolfgang R.Certain members of the Actinobacteria and Proteobacteria are known to degrade polyethylene terephthalate (PET). Here, we describe the first functional PET-active enzymes from the Bacteroidetes phylum. Using a PETase-specific Hidden-Markov-Model- (HMM-) based search algorithm, we identified several PETase candidates from Flavobacteriaceae and Porphyromonadaceae. Among them, two promiscuous and cold-active esterases derived from Aequorivita sp. (PET27) and Kaistella jeonii (PET30) showed depolymerizing activity on polycaprolactone (PCL), amorphous PET foil and on the polyester polyurethane Impranil® DLN. PET27 is a 37.8 kDa enzyme that released an average of 174.4 nmol terephthalic acid (TPA) after 120 h at 30°C from a 7 mg PET foil platelet in a 200 μl reaction volume, 38-times more than PET30 (37.4 kDa) released under the same conditions. The crystal structure of PET30 without its C-terminal Por-domain (PET30ΔPorC) was solved at 2.1 Å and displays high structural similarity to the IsPETase. PET30 shows a Phe-Met-Tyr substrate binding motif, which seems to be a unique feature, as IsPETase, LCC and PET2 all contain Tyr-Met-Trp binding residues, while PET27 possesses a Phe-Met-Trp motif that is identical to Cut190. Microscopic analyses showed that K. jeonii cells are indeed able to bind on and colonize PET surfaces after a few days of incubation. Homologs of PET27 and PET30 were detected in metagenomes, predominantly aquatic habitats, encompassing a wide range of different global climate zones and suggesting a hitherto unknown influence of this bacterial phylum on man-made polymer degradation.Item Open Access Active-site loop variations adjust activity and selectivity of the cumene dioxygenase(2021) Heinemann, Peter M.; Armbruster, Daniel; Hauer, BernhardActive-site loops play essential roles in various catalytically important enzyme properties like activity, selectivity, and substrate scope. However, their high flexibility and diversity makes them challenging to incorporate into rational enzyme engineering strategies. Here, we report the engineering of hot-spots in loops of the cumene dioxygenase from Pseudomonas fluorescens IP01 with high impact on activity, regio- and enantioselectivity. Libraries based on alanine scan, sequence alignments, and deletions along with a novel insertion approach result in up to 16-fold increases in activity and the formation of novel products and enantiomers. CAVER analysis suggests possible increases in the active pocket volume and formation of new active-site tunnels, suggesting additional degrees of freedom of the substrate in the pocket. The combination of identified hot-spots with the Linker In Loop Insertion approach proves to be a valuable addition to future loop engineering approaches for enhanced biocatalysts.Item Open Access Harnessing the structure and dynamics of the squalene‐hopene cyclase for (-)‐ambroxide production(2023) Schneider, Andreas; Curado, Christian; Lystbaek, Thomas B.; Osuna, Sílvia; Hauer, BernhardTerpene cyclases offer enormous synthetic potential, given their unique ability to forge complex hydrocarbon scaffolds from achiral precursors within a single cationic rearrangement cascade. Harnessing their synthetic power, however, has proved to be challenging owing to their generally low catalytic performance. In this study, we unveiled the catalytic potential of the squalene‐hopene cyclase (SHC) by harnessing its structure and dynamics. First, we synergistically tailored the active site and entrance tunnel of the enzyme to generate a 397‐fold improved (-)‐ambroxide synthase. Our computational investigations explain how the introduced mutations work in concert to improve substrate acquisition, flow, and chaperoning. Kinetics, however, showed terpene‐induced inactivation of the membrane‐bound SHC to be the major turnover limitation in vivo. Merging this insight with the improved and stereoselective catalysis of the enzyme, we applied a feeding strategy to exceed 10 5 total turnovers. We believe that our results may bridge the gap for broader application of SHCs in synthetic chemistry.Item Open Access Biochemical analysis of DNA- and protein methyltransferases using recombinant designer nucleosomes(2022) Bröhm, Alexander; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)