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Subject: search.filters.subject.540Institute: search.filters.UBSInstitut.Institut für BioverfahrenstechnikPublication Type: search.filters.UBSTyp.Dissertation

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    Biotransformationen an Derivaten ungewöhnlicher, cyclischer Aminosäuren
    (2003) Vielhauer, Oliver; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)
    Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Biotransformationsverfahren für die Darstellung von enantiomerenreinen Derivaten zweier cyclischer Aminosäuren entwickelt werden: (i) ß-Amino-cyclopropancarbonsäure (ß-ACC) und (ii) Pipecolinsäure (Pip, Piperidin-2-carbonsäure). Beide Stoffe sind als Synthesebausteine für pharmazeutisch wirksame Verbindungen von Interesse. Ausgehend von dem bisher nur racemisch zugänglichem ß-ACC-Syntheseintermediat N-tert-Butyloxycarbonyl-2-Azabicyclo[3.1.0]hex-3-en-6-carbonsäuremethylester [(rac)-1] wurden stereoselektive enzymatische Esterspaltungen und Umesterungen untersucht. Hydrolytische Biotransformationen erwiesen sich dabei als vorteilhafter. Mit dem aktivsten und selektivsten Enzym, der Lipase B aus Candida antarctica, wurde nach Optimierung der Reaktionsbedingungen ein präparatives Verfahren für die Racematspaltung von [1] entwickelt und angewandt. Dabei konnte eine Enantioselektivität der Reaktion von E = 34 erreicht werden. Die dargestellten Produkte [(-)-1] und (+)-N-tert-Butyloxycarbonyl-2-Azabicyclo[3.1.0]hex-3-en-6-carbonsäure dienten als Edukte für die Synthese von enantiomerenreinen cis- und trans-ß-ACC-Derivaten. Da bisher beschriebene biokatalytische Verfahren zur Darstellung von Pip-Derivaten durchweg Ausbeuten unter 50 % lieferten, lag der Schwerpunkt auf der Entwicklung eines Verfahrens, das prinzipiell Ausbeuten von 100 % enantiomerenreinem Produkt ermöglicht. Dazu sollte die spontane Racemisierung von N-p-Toluolsulfonyl-pipecolinaldehyd [(rac)-2] mit einer möglichst hochselektiven Biotransformation gekoppelt werden. Bei einem Screening erwies sich die Bioreduktion von [2] mit der Alkoholdehydrogenase aus Pferdeleber als hochaktiv und enantiospezifisch. Nach Kopplung mit einer enzymatischen NADH-Regenerierung wurde das resultierende Batch-System reaktionskinetisch charakterisiert und optimiert. In einer präparativen Umsetzung wurde enantiomerenreiner N-p-Toluolsulfonyl-D-pipecolinalkohol in 73 % Ausbeute gewonnen.
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    ItemOpen Access
    Interloping frontiers of systems biology : mass spectrometry in bioprocesses optimization
    (2017) Sánchez-Kopper, Andrés; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
    System biology as the understanding and prediction of how intracellular machinery works, needs new technological support in order to observe cell metabolism at all its levels. From organism genome to its transcription to proteins and how these proteins regulate metabolite pools as the final response to determined stimuli, are needed to have a close look into specific metabolic states. Mass spectrometry is used here to obtain intracellular information at a metabolomics, peptidomics and proteomics level for specific questions concerning bioprocesses optimization. First, a ZIC-HILIC tandem mass spectrometric method was established to allow the intracellular quantitation of about 50 polar metabolites of the central carbon metabolism without extra derivatization steps, increasing detection limits using alkaline mobile phase, considering “wrong-way-around” ionization, as a basis to perform metabolic flux analysis, needed to evaluate metabolic engineering approaches over titer production. Also, culture performance boosting dipeptide uptake was for the first time revealed by intracellular dipeptide pools quantification in CHO cells, by means of high-resolution mass spectrometry, with which tracking its uptake rates, shows the presence of two possible mechanisms for dipeptide uptake in CHO-DP12 cells. Dipeptide metabolization inside the cell was additionally revealed, as amino acids coming from the dipeptides uptake are directly metabolized or expelled out of the cell proving that, in order to optimize mammalian cells bioprocesses, by means of dipeptide medium supplementation, there is a need to understand specific dipeptide uptake and metabolization. Furthermore, protein turnover of a reference molecular antibody, produced in CHO cells, was also chased by a novel methodology. Out of the traditional stable isotope labeling with amino acids (SILCA), production-like conditions were evaluated, the intracellular mAb degradation was for the first time partially quantified, as intracellular peptides produced by Anti-interleukin-8 monoclonal antibody proteolysis were identified by high-resolution mass spectrometry and the measurement of 13C- labeled L-lysine incorporation in the mAb fragments, during exponential cell growth, allowed the calculation of mAb specific degradation rates, where this approach would lead to quantifying how much product is lost by intracellular proteolysis and how this loss could be controlled under high productivity conditions. By means of mass spectrometry, considering the approaches disclosed in the present dissertation, improved bioprocesses optimization could be reached as we are able to quantitatively observe cell metabolism, from metabolomics to proteomics, allowing further understanding and prediction of biological systems.
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    ItemOpen Access
    Untersuchungen zur Substratspezifität und Enantioselektivität mikrobieller Hydantoinasen
    (2000) Waniek, Thomas; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)
    Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745. Für die Standardumsetzung von 5-Benzylhydantoin wurden die spezifische Aktivität und die Enantioselektivität ermittelt und mit anderen Hydantoinen bzw. hydantoinanalogen Substanzen verglichen. Die Enantioselektivität der Umsetzung von 5-Benzylhydantoin zeigte weder eine Abhängigkeit von der Temperatur noch vom pH-Wert. Bei Hydantoinen mit Ethylgruppen wie 5-(Methylthioethyl)-hydantoin und 5-(Phenylethyl)-hydantoin konnte für diese Hydantoinase eine Umkehrung der Enantioselektivität festgestellt werden. Der gleiche Effekt konnte beim Austausch der Phenyl- gegen eine Trimethylsilygruppe gefunden werden. 5-(Trimethylsilyl)-hydantoin wurde D-spezifisch mit einer Enantioselektivität von E > 100 umgesetzt. Um den Einfluß einzelner Strukturelemente im Hydantoinring zu untersuchen, wurden verschiedene Hydantoinanaloga synthetisiert. 5-Benzyl-1,3-oxazolidin-2,4-dion, welches ein Sauerstoffatom anstelle der 1-NH-Gruppe besitzt, wurde von der Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745 mit einer geringen Aktivität D-selektiv zu Carbamoylphenylmilchsäure umgesetzt. Benzylsuccinimid, welches eine Methylengruppe anstelle der 1-NH Gruppe trägt, wurde mit einer sehr geringen Aktivität zu D-3-Benzylbernsteinsäurehalbamid umgesetzt. 3-substituierte Hydantoinanaloga wurden nicht als Substrate akzeptiert. Benzylbernsteinsäurehalbamid zeigte auf Umsetzungen mit der Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745 einen starken inhibitorischen Einfluß (Ki = 0.34 mM). Umsetzungen mit weiteren Hydantoinasen aus Bacillus thermoglucosidasius, Thermus species (beides rekombinante Enzyme aus Escherichia coli) und aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 verliefen ausschließlich D-selektiv oder D-spezifisch. Alle Hydantoinanaloga wurden an derselben Position hydrolysiert wie das unveränderte Hydantoin.
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    ItemOpen Access
    Scale-up of gas fermentations : modelling tools for risk minimisation
    (2020) Siebler, Flora
    The reduction of greenhouse gas emissions is a global endeavour supported by society, politics and industry. In recent years, circular economy, reducing the exploitation of fossil energy sources, have increased the demand for new solutions when producing commodities and fine chemicals. Caboxydotrophic fermentations with acetogenic bacteria are potential processes in order to reach these goals. They convert gaseous substrates such as CO, and CO2/H2 mixtures. However, gases as sole substrate are rather challenging, not only in small lab-scales but especially in large-scale. Transferring an efficient fermentation process from experimental to industrial scales often results in unpredictable performance losses. This study presents an in silico concept minimising possible risks in gas fermentations up-scaling. First, the economical feasibility of various fermentation methods is investigated. Then, two computational tools are presented using Clostridium ljungdahlii as model organism and synthesis gas as substrate in a 125 m3 bubble column reactor. The combination of economical investigation with modelling tools show high potential for successful scale-up of gas fermentations. With this concept feasibility, reactor design, operation mode and general risk minimisation can be analysed and specified.