Universität Stuttgart
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Item Open Access Catalytic hydroxylation in biphasic systems using CYP102A1 mutants(2005) Maurer, Steffen Christian; Kühnel, Katja; Kaysser, Leonard A.; Eiben, Sabine; Schmid, Rolf D.; Urlacher, Vlada B.Cytochrome P450 monooxygenases are biocatalysts that hydroxylate or epoxidise a wide range of hydrophobic organic substrates. To date their technical application is limited to a small number of whole-cell biooxidations. The use of the isolated enzymes is believed to be impractical due to the low stability of this enzyme class, to the stochiometric need of the expensive cofactor NADPH, and due to the low solubility of most substrates in aqueous media. To overcome these problems we have investigated the application of a bacterial monooxygenase (mutants of CYP102A1) in a biphasic reaction system supported by cofactor recycling with NADP+-dependent formate dehydrogenase from Pseudomonas sp 101. Using this experimental setup, cyclohexane, octane and myristic acid were hydroxylated. To reduce the process costs a novel NADH-dependent double mutant of CYP102A1 was designed. For recycling of NADH during myristic acid hydroxylation in a biphasic system NAD+-dependent FDH was used. Stability of the monooxygenase under the reaction conditions is quite high as revealed by total turnover numbers of up to 12850 in NADPH-dependent cyclohexane hydroxylation and up to 30000 in NADH-dependent myristic acid oxidation.Item Open Access Oxidationsreaktionen mittels der Cytochrom P450-Monooxygenase CYP102A1 in Enzymreaktoren(2006) Maurer, Steffen Christian; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Biokatalytische Prozesse werden im Rahmen der Ausrichtung der chemischen Industrie hin zu nachhaltigen und ressourcenschonenden Produktionsverfahren zunehmend in die Praxis übertragen. Die enzymatische Darstellung chiraler Alkohole wird bisher vor allem durch die Reduktion prochiraler Ketone unter Verwendung von Alkoholdehydrogenasen bewerkstelligt. Einen alternativen Zugang zu chiralen Alkoholen und Epoxiden erlauben Oxygenasen. Deren häufigste Vertreter mit 4600 bekannten Sequenzen sind Cytochrom P450-Monooxygenasen (CYPs), die in der Lage sind, Sauerstoff mit teilweise sehr hoher Regio- und Stereoselektivität in nicht aktivierte C-H-Bindungen einzuführen bzw. C-C-Doppelbindungen zu epoxidieren. CYPs werden zur Zeit industriell ausschließlich in Form von Ganzzelbiokatalysatoren eingesetzt. Die Verwendung isolierter CYPs in der organischen Synthese hingegen wurde bisher als nicht praktikabel erachtet, da für die enzymatische Aktivität in den meisten Fällen mehrere Elektronentransportproteine sowie der teure Kofaktor Nicotinamidadenindinucleotid(phosphat) (NAD(P)H) benötigt werden. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit des Einsatzes isolierter Varianten von CYP102A1 in der präparativen organischen Synthese untersucht werden. Grundvoraussetzung für den Einsatz eines Enzyms in der Biokatalyse ist seine effiziente und damit kostengünstige Produktion. Zur Steigerung der Ausbeute bei der rekombinanten Expression von CYP102A1 in Escherichia coli BL21 (DE3) wurde zunächst ein neuer Vektor (pET28a+CYP102A1) konstruiert. In diesem System konnten Expressionsausbeuten von 144 mg CYP102A1 pro Liter Kulturmedium erreicht werden. Durch die Expression als Fusionsprotein mit einer Hexahistidinsequenz konnte eine zeitsparende einstufige Aufreinigungsmethode für CYP102A1 entwickelt werden. Ein großes Problem bei der Etablierung zellfreier, durch P450-Monooxygenasen katalysierter Prozesse ist die Abhängigkeit der Enzymklasse vom Kofaktor NAD(P)H. Da der Ersatz des Kofaktors NADPH durch Wasserstoffperoxid oder der Einsatz von Riboflavin als Elektronenüberträger nicht die für präparative Anwendungen nötigen Umsatzraten lieferte, wurde die Regenerierung von NADPH mittels einer NADP+-abhängigen Formiatdehydrogenase (FDH) untersucht. Dieses Kofaktorregenerierungssystem erwies sich als geeignet, durch CYP102A1 katalysierte Reaktionen über Tage aufrechtzuerhalten. Als Modellreaktionen für die weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen wurden die Hydroxylierung von Cyclohexan, Oktan und Myristinsäure sowie die Epoxidierung von Styrol gewählt. Da noch keine Varianten von CYP102A1 bekannt waren, die die Substrate Cyclohexan und Styrol mit hoher Umsatzrate oxidieren, wurden Varianten von CYP102A1 hinsichtlich ihrer Aktivität in diesen Reaktionen charakterisiert. Herausragendes Ergebnis auf diesem Gebiet ist einerseits die annähernd stereospezifische Epoxidierung von Styrol zu R-Styroloxid (92% ee) durch CYP102A1 F87G. Andererseits konnte die Variante CYP102A1 R47L/Y51F identifiziert werden, die die mit einer Bindungsdissoziationsenergie von 90 kJ/mol äußerst stabile CH-Bindung in Cyclohexan spalten und durch eine Hydroxylgruppe ersetzen kann. Im nächsten Schritt wurden verschiedene Reaktionssysteme für die durch CYP102A1-Varianten katalysierte Reaktion untersucht. Ein Ansatz war dabei die Erzeugung eines heterogenen Katalysatorystems durch Einschluss von CYP102A1 und FDH in einer in situ gebildeten Sol-Gel-Matrix. Durch diese Immobilisierung des Biokatalysators konnte seine Lagerstabilität um eine Größenordnung erhöht werden. Alternativ wurde ein zweiphasiges Reaktionssystem entwickelt, welches an Hand der Hydroxylierung von Cylohexan optimiert wurde. Unter Verwendung dieses Ansatzes konnte Cyclohexanol im Grammmaßstab synthetisiert werden. Um die allgemeine Anwendbarkeit des Zweiphasensystems für CYP-katalysierte Hydroxylierungs-reaktionen zu demonstrieren, wurde die Umsetzung von n-Oktan und Myristinsäure untersucht. Auch in diesen beiden Fällen konnten präparative Mengen der hydroxylierten Produkte isoliert werden. Weiterhin konnte in diesem zweiphasigen Reaktionssystem auch die Epoxidierung von Styrol durchgeführt werden, wobei 4.4 g reines Styroloxid isoliert werden konnten. Bei der Epoxidierung von Styrol erhöhte der Einsatz von statistisch methyliertem -Cyclodextrin zur Erhöhung der Löslichkeit des organischen Substrats in der wässrigen Biokatalysatorphase die Ausbeuten. Auch Myristinsäure kann durch Verwendung von statistisch methyliertem -Cyclodextrin in einer Konzentration von 10 g l-1 in der Reaktionsmischung gelöst werden, was für eine Hydroxylierungsreaktion in homogener wässriger Lösung genutzt wurde. Dabei wurden für die eingesetzte CYP102A1-Variante maximale Zykluszahlen (ttn) von 50600 erreicht.Item Open Access Cloning, expression and characterisation of CYP102A2, a self-sufficient P450 monooxygenase from Bacillus subtilis(2004) Budde, Michael; Maurer, Steffen Christian; Schmid, Rolf D.; Urlacher, Vlada B.The gene encoding CYP102A2, a novel P450 monooxygenase from Bacillus subtilis, was cloned and expressed in Escherichia coli. The recombinant enzyme formed was purified by immobilised metal chelat affinity chromatography (IMAC) and characterised. CYP102A2 is a 119 kDa self-sufficient monooxygenase, consisting of an FMN/FAD–containing reductase domain and a heme domain. The deduced amino acid sequence of CYP102A2 exhibits a high level of identity with the amino acid sequences of CYP102A1 from Bacillus megaterium (59%) and CYP102A3 from Bacillus subtilis (60%). In reduced, CO-bound form, the enzyme shows a typical Soret band at 450 nm. It catalyses the oxidation of even- and odd-chain saturated and unsaturated fatty acids. In all reactions investigated, the products were the respective ù-3, ù-2 and ù-1 hydroxylated fatty acids. Activity was highest towards oleic and linoleic acid (KM=17.4 ± 1.4 ìM, kcat= 2244 ± 72 min-1), linoleic acid (KM=12.25 ± 1.8 ìM, kcat= 1950 ± 84 min-1). Comparison of CYP102A2 homology model to CYP102A1 crystal structure revealed significant differences in the substrate access channels, which might explain the differences in catalytic properties of these two enzymes.Item Open Access Biocatalysts for the epoxidation and hydroxylation of fatty acids and fatty alcohols(2005) Maurer, Steffen Christian; Schmid, Rolf D.Whereas most products of the chemical industry are based on petrochemical feedstocks, considerable efforts have been made during the past few decades to use renewable resources as industrial raw materials. Besides polysaccharides and sugars, plant oils and animal fats play an important role in such programmes because of their ready availability (present production is >100 million t/a, which could be increased on demand) of which the lion’s share is used for nutrition (~85 million t/a), whereas ~ 15 – 20 million t/a are used for the synthesis of polymers, surfactants, emollients, lubricants, bio-diesel, emulsifiers, etc.). From a chemical point of view, most natural triglycerides offer just two reactive sites, the ester group and the double bonds of unsaturated fatty acids. In fact, the chemistry of fats and oils is largely focused on the ester group which can be hydrolyzed or catalytically reduced, leading to glycerol and fatty acids or fatty alcohols, respectively. Reactions involving the alkyl chain or double bonds of triglycerides, fatty acids, fatty alcohols or their derivatives represent far less than 10% of today’s oleochemistry, with the production of sulfonated fatty alcohols and their derivatives being a major process of this kind. Oxidation reactions at the alkyl or alkenyl chains would be highly desirable as they would lead to oleochemicals with new properties, but the methods available today lack selectivity and require harsh conditions. Notable exceptions are the epoxidation of unsaturated plant oils and the synthesis and use of a few hydroxy fatty acids.Item Open Access Immobilisation of P450 BM-3 and an NADP+ cofactor recycling system : towards a technical application of heme-containing monooxygenases in fine chemical synthesis(2003) Maurer, Steffen Christian; Schulze, Holger; Schmid, Rolf D.; Urlacher, Vlada B.Cytochrome P450 monooxygenases are potentially a very useful class of hydroxylation catalysts; they are able to introduce oxygen at activated and non-activated carbon-hydrogen bonds and thus lead to regio- and/or stereochemically pure compounds. However, this potential is lowered by their intrinsic low activity and inherent instability. P450-catalysed biotransformations require a constant supply of NAD(P)H, making the process an expensive one. To render these catalysts more suitable for industrial biocatalysis, the immobilisation of P450 BM-3 (CYP 102A1) from Bacillus megaterium in a sol-gel matrix was combined with a cofactor recycling system based on NADPƒy-dependent formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2) from Pseudomonas sp. 101 and tested for practical applicability. This approach was used for the conversion of £]-ionone, octane and naphthalene to the respective hydroxy-compounds with DMSO as cosolvent using sol-gel immobilised P450 BM-3 mutants.