Universität Stuttgart
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Item Open Access Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access Impact of remote mutations on metallo-beta-lactamase substrate specificity : implications for the evolution of antibiotic resistance(2005) Ölschläger, Peter; Mayo, Stephen L.; Pleiss, JürgenMetallo-beta-lactamases have raised concerns due to their ability to hydrolyze a broad spectrum of beta-lactam antibiotics. The G262S point mutation distinguishing the metallo-beta-lactamase IMP 1 from IMP 6 has no effect on the hydrolysis of the drugs cephalothin and cefotaxime, but significantly improves catalytic efficiency toward cephaloridine, ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem. This change in specificity occurs even though residue 262 is remote from the active site. We investigated the substrate specificities of five other point mutants resulting from single nucleotide substitutions at positions near residue 262: G262A, G262V, S121G, F218Y and F218I. The results suggest two types of substrates: type I (nitrocefin, cephalothin and cefotaxime), which are converted equally well by IMP-6, IMP-1, and G262A, but even more efficiently by the other mutants, and type II (ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem), which are hydrolyzed much less efficiently by all the mutants, with IMP-1 being the most active. G262V, S121G, F218Y, and F218I improve conversion of type I substrates, whereas G262A and IMP-1 improve conversion of type II substrates, indicating two distinct evolutionary adaptations from IMP-6. Substrate structure may explain the catalytic efficiencies observed. Type I substrates have R2 electron donors, which may stabilize the substrate intermediate in the binding pocket and lead to enhanced activity. In contrast, the absence of these stabilizing interactions with type II substrates may result in poor conversion and increased sensitivity to mutations. This observation may assist future drug design. As the G262A and F218Y mutants confer effective resistance to Escherichia coli BL21(DE3) cells (high minimal inhibitory concentrations), they are likely to evolve naturally.Item Open Access Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.Item Open Access A model of the pressure dependence of the enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards (±)-menthol(2001) Kahlow, Ulrich; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenTransesterification of (±)-menthol using propionic acid anhydride and Candida rugosa lipase was performed in chloroform and water at different pressures (1, 10, 50, and 100 bar) to study the pressure dependence of enantioselectivity E. As a result, E significantly decreased with increasing pressure from E=55 (1 bar) to E=47 (10 bar), E=37 (50 bar), and E=9 (100 bar). In order to rationalize the experimental findings, molecular dynamics simulations of Candida rugosa lipase were carried out. Analyzing the lipase geometry at 1, 10, 50, and 100 bar revealed a cavity in the Candida rugosa lipase. The cavity leads from a position on the surface distinct from the substrate binding site to the core towards the active site and is limited by F415 and the catalytic H449. In the crystal structure of the Candida rugosa lipase, this cavity is filled with 6 water molecules. The number of water molecules in this cavity gradually increased with increasing pressure: 6 molecules in the simulation at 1 bar, 10 molecules at 10 bar, 12 molecules at 50 bar, and 13 molecules at 100 bar. Likewise, the volume of the cavity progressively increased from about 1864 ų in the simulation at 1 bar to 2529 ų at 10 bar, 2526 ų at 50 bar, and 2617 ų at 100 bar. At 100 bar, one water molecule slipped between F415 and H449, displacing the catalytic histidine side chain and thus opening the cavity to form a continuous water channel. The rotation of the side chain leads to a decreased distance between the H449-N and the (+)-menthyl-oxygen (non-preferred enantiomer) in the acyl enzyme intermediate, a factor determining the enantioselectivity of the lipase. While the geometry of the preferred enantiomer is similar in all simulations, the geometry of the non-preferred enantiomer gets gradually more reactive. This observation correlates with the gradually decreasing enantioselectivity E.Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.Item Open Access Rapid detection of neurotoxic insecticides in food using disposable acetylcholinesterase-biosensors and simple solvent extraction(2002) Schulze, Holger; Schmid, Rolf D.; Bachmann, Till T.The extensive use of pesticides to protect agricultural crops necessitates reliable tools for the detection of residues in food and water, thus ensuring environmental protection and consumer safety. Neuroinhibitors such as organophosphates and carbamates in particular, represent a potential hazard to human health. These compounds are frequently found in food but conventional methods of analysis are limited as they are either time consuming or not sufficiently sensitive. As a result, a rapid and sensitive biosensor test based on AChE-inhibition was developed. The disposable AChE-biosensor was directly applied in solvent extracts of food samples using isooctane as extraction solvent. A complete assay could be performed in less than 2 hours. Recovery rates of 84 % were obtained in tests with spiked orange juice samples. Tests in food samples with a lower water content resulted in reduced recovery rates (44 % for peach pap baby food). Phosphorothionate insecticides could be detected after direct oxidation in food with N-bromosuccinimide and solvent extraction. The assay displayed a detection limit of 2 μg/kg paraoxon which was sufficient for the monitoring of maximum residue limits in food according to EU regulations.Item Open Access Molekulare Grundlagen der Stereoselektivität Lipase-katalysierter Umsetzungen(2001) Schulz, Tanja; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lipase aus Pseudomonas cepacia ist ein ausgezeichnetes Enzym in der kinetischen Racemattrennung sekundärer Alkohole. Die Stereopräferenz beruht ausschließlich auf der Substratstruktur der Enantiomere, während die Stereoselektivität auf atomaren Wechselwirkungen zwischen Substrat und Lipase beruht. 30 sekundäre Alkohole mit veröffentlichten E-Werten wurden gewählt. Modelle der Ester wurden kovalent in die Bindestelle der Lipase gebunden. Die beiden Enantiomere von 27 Substraten bevorzugten eine von zwei Bindungsmodi: das schnell-umgesetzte Enantiomer in einem produktiven, das langsam-umgesetzte Enantiomer in einem nicht-produktiven Bindungsmodus. Der produktive Bindungsmodus langsam-umgesetzter Enantiomere wird durch abstoßende Wechselwirkungen mit einer starren Wand nahe der Oxyanionen-Bindetasche gestört. Als Folge drückt das Substrat das aktive Histidin aus einer katalytisch effektiven Orientierung und der Abstand d(HNe-Oalc) zwischen Histidin und dem Alkohol-Sauerstoffatom nimmt zu. d(HNe-Oalc) korreliert mit experimentell ermittelten E-Werten: Substrate, die mit der Lipase aus P. cepacia mit hohen E-Werten umgesetzt werden (E > 100), weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) > 2.2 Å auf und eine effektive Katalyse des Enantiomers wird unterbunden. Substrate mit niederer Selektivität (E < 20) weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) < 2.0 Å auf. In diesem Fall werden beide Enantiomere mit ähnlichen Reaktionsraten umgesetzt. Eine vergleichbare Abhängigkeit des Abstands d(HNe-Oalc) und experimentell bestimmten E-Werten wurde für chirale Amine festgestellt. Der Abstand d(HNe-Oalc) ist auch ein entscheidender Parameter in Umsetzungen chiraler, sekundärer Alkohole mit zwei benachbarten Stereozentren mit der Lipase aus Candida rugosa. Die in silico Einführung von Punktmutationen in die Bindestelle der Lipase aus P. cepacia führte z.B. für die Einfachmutante Y29L zu einem verlängerten Abstand d(HNe-Oalc). Die erwartete Steigerung des E-Wertes konnte experimentell bestätigt werden.Item Open Access Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology(2005) Grimm, Verena Ulrike; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals. In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.Item Open Access Biochemische Nachweisverfahren auf der Basis genetischer Regulationselemente: vom Reporterassay zum Repressor/DNA-Bindungstest(2000) Köhler, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)In der vorliegenden Arbeit wurde auf der Grundlage von genetischen Regulationselementen ein in vivo Assay und vergleichend hierzu ein in vitro Assay entwickelt. Ein rekombinanter E. coli Stamm wurde beim in vivo Reporterassay zur Detektion von 4-CBA verwendet, der bei Anwesenheit von 4-CBA Luziferase exprimiert. Durch Immobilisierung dieses Stammes konnte ein einfaches und spezifisches Testverfahren im Mikrotiterplattenformat entwickelt werden. Mit den optimierten Immobilisierungsbedingungen und der Verwendung einer Membranmutante von E. coli konnte ein Detektionslimit von 28 µM 4-CBA in 200 min erreicht werden. Zusätzlich wurde ein von den Eigenschaften der Zelle unabhängiges in vitro Assaysystem entwickelt. Da der Mechanismus der Tetrazyklinresistenz in Bakterien bekannt war, wurde Tetrazyklin als Analyt ausgewählt. Im neu zu entwickelnden Assay sollte der durch Tetrazyklin induzierte Abfall des Repressors von der Operator DNA zur quantitativen Bestimmung von Tetrazyklin benutzt werden. Dazu wurde der Tet Repressor mit N-terminal oder C-terminal fusioniertem Tag und nativ in E. coli überexprimiert. Die Funktionalität der Repressoren wurde im Gel-Mobility-Shift Assay untersucht. Nur der Repressor ohne Tag sowie der Repressor mit einem durch Proteaseverdau abgespaltenem Tag zeigten volle biologische Aktivität. Im Hinblick auf eine spätere Assay-Entwicklung wurde der Einfluß eines enzymatischen Markers auf die Repressor/Operator-DNA-Bindung mit derselben Methode getestet. Daraus folgte eine Versuchsdurchführung für den Mikrotiterplatten-Assay. Diese beeinhaltete die Immobilisierung des Repressors, die Bindung von Tetrazyklin an diesen und die Bindung POD markierter Operator-DNA an tetrazyklinfreie Repressoren. Die Bestimmung der POD Aktivität ließ Rückschlüsse auf die vorhandene Tetrazyklinkonzentration zu. Da dieses Assayformat mit sehr großen Standardabweichungen verbunden war, wurden markerfreie Oberflächenplasmonresonanzmessungen vorgenommen.