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Subject: search.filters.subject.570End date: 2021Institute: search.filters.UBSInstitut.Institut für Biochemie und Technische Biochemie

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    Mechanistic studies on the DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B
    (2021) Dukatz, Michael; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)
    In this work, both regulatory and catalytic mechanisms of de novo methyltransferases were investigated, which include interactions with other proteins and the specific recognition of the substrate sequence. Another part of this work strived to elucidate how enzymatic generation of 3-methylcytosine by DNMT3A can occur.
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    Assembly of a Rieske non-heme iron oxygenase multicomponent system from Phenylobacterium immobile E DSM 1986 enables pyrazon cis-dihydroxylation in E. coli
    (2021) Hunold, Andreas; Escobedo-Hinojosa, Wendy; Potoudis, Elsa; Resende, Daniela; Farr, Theresa; Syrén, Per-Olof; Hauer, Bernhard
    Phenylobacterium immobile strain E is a soil bacterium with a striking metabolism relying on xenobiotics, such as the herbicide pyrazon, as sole carbon source instead of more bioavailable molecules. Pyrazon is a heterocyclic aromatic compound of environmental concern and its biodegradation pathway has only been reported in P. immobile. The multicomponent pyrazon oxygenase (PPO), a Rieske non-heme iron oxygenase, incorporates molecular oxygen at the 2,3 position of the pyrazon phenyl moiety as first step of degradation, generating a cis-dihydrodiendiol. The aim of this work was to identify the genes encoding for each one of the PPO components and enable their functional assembly in Escherichia coli. P. immobile strain E genome sequencing revealed genes encoding for RO components, such as ferredoxin-, reductase-, α- and β-subunits of an oxygenase. Though, P. immobile E displays three prominent differences with respect to the ROs currently characterized: (1) an operon-like organization for PPO is absent, (2) all the elements are randomly scattered in its DNA, (3) not only one, but 19 different α-subunits are encoded in its genome. Herein, we report the identification of the PPO components involved in pyrazon cis-dihydroxylation in P. immobile, its appropriate assembly, and its functional reconstitution in E. coli. Our results contributes with the essential missing pieces to complete the overall elucidation of the PPO from P. immobile.
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    Modeling of biocatalytic reactions: a workflow for model calibration, selection, and validation using Bayesian statistics
    (2019) Eisenkolb, Ina; Jensch, Antje; Eisenkolb, Kerstin; Kramer, Andrei; Buchholz, Patrick C. F.; Pleiss, Jürgen; Spiess, Antje; Radde, Nicole
    We present a workflow for kinetic modeling of biocatalytic reactions which combines methods from Bayesian learning and uncertainty quantification for model calibration, model selection, evaluation, and model reduction in a consistent statistical frame-work. Our workflow is particularly tailored to sparse data settings in which a considerable variability of the parameters remains after the models have been adapted to available data, a ubiquitous problem in many real-world applications. Our workflow is exemplified on an enzyme-catalyzed two-substrate reaction mechanism describing the symmetric carboligation of 3,5-dimethoxy-benzaldehyde to (R)-3,3',5,5'-tetramethoxybenzoin catalyzed by benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens. Results indicate a substrate-dependent inactivation of enzyme, which is in accordance with other recent studies.
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    Development of artificial single and double reading domains to analyze chromatin modification patterns
    (2018) Mauser, Rebekka; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)
    The unstructured N-terminal tails of histone proteins carry many different post-translational modifications (PTMs), like methylation, acetylation or phosphorylation. These PTMs can alter the chromatin structure, influence the interaction of adjacent nucleosomes and serve as specific binding sites for histone interacting domains. Currently, the investigation of histone tail PTMs is mainly based on antibodies, however concerns about the specificity of these antibodies and reproducibility of data arouse. Therefore, it was one aim of this thesis to develop alternative approaches to histone tail PTM antibodies. Previous studies already showed that histone modification interacting domains (HiMIDs) can replace histone tail antibodies in a highly effective manner. As part of this work, the TAF3 PHD domain was established as new H3K4me3 specific HiMID. In peptide array binding and Far-western blot assays, the domain showed a specific interaction with H3K4me3 modifications. Also in ChIP like experiments (CIDOP: Chromatin Interacting Domain Precipitation) coupled to qPCR and next generation sequencing, the domain showed a similar performance as validated H3K4me3 antibodies. With the proposal of the histone code hypothesis the question was raised if combinations of histone modifications carry specific biological functions. However, so far, the experimental analysis of the co-occurrence of histone modification on the same nucleosome in a genome-wide manner is a challenging task. For this reason, the main aim of this work was to develop double reading domains in which two histone reading domains are fused together with a flexible linker to achieve simultaneously readout of dual histone tail modifications in a single CIDOP experiment. To validate the concept, the Dnmt3a PWWP domain and the MPP8 Chromo domain were fused together and their specific recognitions of H3K36me2/3 and H3K9me3 histone tail modifications were analyzed. Biochemical investigations like peptide arrays, Far-western blot and western blot experiments showed that both domains specifically interact with their targets and preferentially interact with double modified chromatin. Additionally, the preferred interaction with double modified chromatin could be further verified with binding pocket mutants and methyl-lysine analogues. The newly generated double domain was used in chromatin precipitation experiments to identify genome regions where both modifications are present. The genome-wide distribution of the H3K36me2/3-H3K9me3 showed that this combination of histone marks represents a novel bivalent chromatin state, which is associated with weakly transcribed genes and is enriched for binding sites of ZNF274 and SetDB1. Also in this work, mixed peptide arrays were introduced as new screening method for the efficient analysis of double reading domains. The naturally occurring double reading domain of the BPTF protein was used to demonstrate the capability of this new screening tool. BPTF contains a PHD domain, which binds to H3K4me3 and a Bromo domain, which interacts with acetyl groups of the H4 tail. Synergistic binding to both peptides was shown using the newly developed mixed peptide arrays. Additionally, in the course of this work mixed peptide arrays were used to optimize several of the designed double reading domains. Furthermore, some other double reading domains were generated in this work, like PWWP-ATRX, MPP8 Chromo domain-L-double Tudor and CBX7 Chromo domain-L-MPP8 Chromo domain and analyzed for specific dual readout. Also double reading domains with dual specificity for DNA methylation and histone marks were generated. The firstly used methyl-DNA binding domain of the MBD2 protein showed a strong binding, dominating the effect of the HiMIDs. Therefore, the weaker but still specific methyl-DNA binding domain of the MBD1 protein was used. First experiments with this new fusion constructs showed a simultaneously interaction with chromatin which is associated with DNA methylation and histone PTMs. In summary, the studies with double reading domains showed that with this novel method precipitation of double modified chromatin is possible and that the genome-wide investigation of newly studied bivalent chromatin states is feasible. Therefore, this novel approach makes it possible to analyze many different combinations of histone modifications, investigate their influence on chromatin and gain a deeper understanding of the biological role behind histone tail modification patterns.
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    Identifikation und Charakterisierung neuer Biokatalysatoren für die C-H-Oxyfunktionalisierung
    (2018) Klenk, Jan M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
    Die Enzymklasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen stellt in der modernen Biokatalyse eine umweltfreundliche Alternative zu der oftmals unter harschen Reaktionsbedingungen und mit limitierter Selektivität ablaufenden chemischen Synthese dar. Weiterhin sind P450s in der Lage, auch nicht-aktivierte Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen selektiv zu oxyfunktionalisieren und somit synthetische Methoden zu komplementieren sowie wertvolle natürliche Produkte unter milden Reaktionsbedingungen zu generieren. Bei dieser Enzymklasse handelt es sich um ubiquitär vorkommende, promiskuitive, hoch diverse und hoch evolvierbare Biokatalysatoren. Trotz vielseitiger Anwendungsmöglichkeiten und der einzigartigen katalytischen Eigenschaften von P450s ist aufgrund der Komplexität des Multikomponentensystems allerdings eine schrittweise Verbesserung für eine industrielle Anwendung unabdingbar, die sich verhältnismäßig aufwändig gestaltet. Die Etablierung neuer P450 Biokatalysatoren zur Generierung wertvoller oxyfunktionalisierter Medikamentenmetaboliten sowie für die Duft- und Aromastoffindustrie interessante Produkte waren Ziele der vorliegenden Dissertation. Die Natur hält in der hoch diversen P450-Superfamilie ein enormes Repertoire potenzieller Biokatalysatoren für spezifische Anwendungen bereit, jedoch ist mit bislang etwa 5000 charakterisierten P450s nur ein geringer Teil der rapide wachsenden Anzahl annotierter Sequenzen (> 38000) untersucht worden. Für die Implementierung in industrielle Prozesse sind letztendlich P450-Ganzzellbiokatalysatoren aufgrund ihrer Cofaktorabhängigkeit obligat. Der Transfer der komplexen P450-basierten Prozesse in den Bioreaktormaßstab mit dem Ziel, leistungsfähige Katalysatoren unter prozessrelevanten Bedingungen zu etablieren, wurde bis dato erst sehr selten durchgeführt. Für einen solchen Ansatz wurde in einem ersten Teil dieser Arbeit die Möglichkeit zur effizienten Herstellung von oxyfunktionalisierten Medikamentenmetaboliten untersucht, deren Bereitstellung essenziell für toxikologische und ökologische Studien ist. Als Biokatalysator wurde das natürliche Fusionskonstrukt P450 RhF aus Rhodococcus sp. eingesetzt. In vorhergehenden Arbeiten konnte festgestellt werden, dass P450 RhF das nicht-steroidale Antirheumatikum (NSAID) Diclofenac unter NADPH-Verbrauch selektiv zu 5-Hydroxydiclofenac funktionalisieren kann. Dieses Enzymsystem wurde in den Bioreaktormaßstab transferiert, wobei hohe und reproduzierbare Expressionen und Produkttiter von bis zu 0,58 g L-1 erzielt werden konnten. Die Aktivität variierte dabei stark zwischen ruhenden und wachsenden Zellen. Eine Ursache hierfür stellt vermutlich die Limitierung der NADPH-Verfügbarkeit in den E. coli Zellen in Abhängigkeit vom Zellstatus dar. Darüber hinaus wurde ein weiterer Metabolit (Quinonimin) detektiert, dessen Bildung nicht-enzymatisch in Abhängigkeit von der Salzkonzentration sowie der Temperatur katalysiert wird. Die oxyfunktionalisierten Medikamentenmetaboliten sind chemisch oftmals schwer zugänglich und besitzen deshalb, ihre Verfügbarkeit vorausgesetzt, einen hohen Marktwert von mehreren hundert Euro pro mg, weshalb in dieser Arbeit neben P450 RhF an einer Plattform unterschiedlicher Katalysatoren für NSAID Hydroxylierungen gearbeitet wurde. Mit den filamentösen Pilzen Beauveria bassiana, Clitocybe nebularis und Mucor hiemalis gelang es, unterschiedliche Diclofenacmetabolite bei einer Substratkonzentration von 0,6 g L-1 in isolierten Ausbeuten über 50% in einem einfachen und günstigen Verfahren herzustellen. Darüber hinaus konnte eine bisher nicht bekannte Verbindung 3’,4’-Dihydroxydiclofenac synthetisiert werden. Auch von weiteren NSAID-Medikamenten wie Ibuprofen, Naproxen oder Mefenaminsäure wurden hohe isolierte Ausbeuten von über 99% (1 g L-1 Substrat) der hydroxylierten Metabolite erhalten; diese Ausbeuten respektive Produkttiter übertreffen bisherige Verfahren mit Mikroorganismen und heterolog exprimierten P450s um über 250%. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Identifizierung neuer Biokatalysatoren für die Oxyfunktionalisierung komplexer und sperriger Terpene, die bislang nur unzureichend biokatalytisch oder chemisch zugänglich sind. Hierbei sollten P450 Enzyme letztlich in Terpene produzierenden E. coli Ganzzellsystemen den letzten Schritt in der Biosynthese zu wertvollen Terpenoiden katalysieren. Unterschiedliche Strategien wurden zu diesem Zweck verfolgt: I) Untersuchung promiskuitiver Aktivitäten von P450s, II) Anpassung der P450s durch rationale Mutagenese, III) Suche nach neuen P450s aus Terpene metabolisierenden Organismen und IV) Suche nach homologen zu Terpene hydroxylierenden P450s. In einem ersten Ansatz wurden mit bereits charakterisierten P450-Fusionsproteinen zunächst keine promiskuitiven Aktivitäten gegenüber den Terpenen festgestellt. Aus diesem Grund wurde angestrebt, das bakterielle natürliche Fusionskonstrukt CYP116B3 aus Rhodococcus ruber dergestalt zu verändern, das breite Substratspektrum des Enzyms auf ausgewählte Terpene auszuweiten. Dies war jedoch nicht erfolgreich, weshalb als weitere Strategie nach neuen P450s in Terpen-metabolisierenden Organismen gesucht wurde. In Biotransformationen mit B. bassiana wurden erste hydroxylierte Terpene festgestellt, die auf eine Funktionalisierung durch P450s hinweisen. Durch eine Proteomanalyse konnte die Anzahl von 83 potenziellen P450s in B. bassiana pro Substrat auf ein bis vier vermutlich verantwortliche P450s reduziert werden. Allerdings misslang die funktionale heterologe Expression der eukaryotischen Gene in E. coli. Auf der Suche nach neuen P450s wurde weiterhin ein interessanter Papaverin abbauender Organismus, das gram-positive Bakterium Arthrobacter sp., getestet, das auf einigen Terpenen als alleinige C-Quelle wachsen konnte. Da die Hydroxylierung durch P450s häufig den ersten Schritt im Metabolismus von beispielsweise xenobiotischen Verbindungen darstellt, wurde Arthrobacter sp. mittels Proteomanalyse auf die verantwortlichen Enzyme hin untersucht. Die Auswertung führte zur Identifikation eines potenziellen Clusters aus zwei P450s mit den putativen elektronenliefernden Redoxpartnern, die mit dem Papaverinabbau in Verbindung gebracht werden konnten. Hinsichtlich der Terpene wurden dagegen keine Hinweise erhalten. Mit Hilfe von physiologischen oder heterologen Redoxpartnern konnte mit drei P450s aus Arthrobacter sp. eine Aktivität rekonstituiert werden, die eine weitere Charakterisierung der entsprechenden Enzyme ermöglichte. Ähnlich zu anderen Mitgliedern der CYP199A Familie akzeptierte CYP199A25 bevorzugt Benzoesäuren als Substrat, die regioselektiv in para-Position demethyliert oder hydroxyliert wurden. Bei den anderen P450s aus Arthrobacter sp. handelt es sich um Enzyme aus P450-Familien mit bislang noch unbekannter Funktion. Durch die Proteomanalyse sowie den postulierten Papaverinmetabolismus wurden Hinweise auf mögliche Phenylessigsäuren als Substrate erhalten, die experimentell bestätigt werden konnten. Die P450s CYP1232A24 sowie CYP1232F1 katalysieren im Papaverinmetabolismus die zweifache Demethylierung der 3,4-Dimethoxyphenylessigsäure zur 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure und weisen hierbei unterschiedliche Selektivitäten für die meta- und para-Position auf. Interessanterweise konnten Elektronen von den im Cluster befindlichen Redoxpartnern, eine Ferredoxin-Reduktase und ein Flavodoxin, effizient transferiert werden, was einem ersten funktionalen physiologischen P450-Klasse III System entspricht. Neben der detaillierten Charakterisierung der Substratspektren wurden Kopplungseffizienzen und kinetische Parameter der drei Enzyme untersucht sowie hoch aktive Ganzzellbiokatalysatoren entwickelt, die bis zu 1,77 g L-1 demethyliertes Produkt bildeten. Bis auf eine Aktivität von CYP1232A24 gegenüber β-Ionon in allylischer Position wurden alle getesteten Terpene jedoch nicht umgesetzt, weshalb ein bislang nicht charakterisiertes Panel aus natürlichen Fusionskonstrukten auf promiskuitive Aktivitäten hin getestet wurde. Das Substratspektrum eines Enzyms mit geringen initialen Aktivitäten gegenüber β-Ionon sowie Valencen wurde schließlich durch rationales Enzymdesign erweitert, was die Oxyfunktionalisierung einiger der ausgewählten Sesquiterpene ermöglichte. Eingesetzt in einen α-Humulen-produzierenden E. coli Stamm eines Kooperationspartners konnten durch die ITB1693 Variante F95A selektiv etwa 300 mg L-1 α-Humulen-6,7-epoxid in situ hergestellt werden. Darüber hinaus wurden auf Grundlage einer Homologiesuche zu Terpen-Hydroxylasen fünf P450s aus dem Myxobakterium Chondromyces apiculatus isoliert, wovon zwei näher charakterisiert werden konnten. Beide Enzyme sind in der Lage, eine große Bandbreite an Substraten zu akzeptieren, wobei im Iononring des β-Ionons auch nicht-allylische Positionen funktionalisiert wurden. Durch eine fokussierte Mutantenbibliothek von CYP109Q5 konnte die Selektivität weiter zu den nicht-allylischen Positionen hin verschoben und zum ersten Mal die für die Carotenoidsynthese bedeutenden und seltenen Produkte 2- und 3-Hydroxy-β-ionon simultan synthetisiert werden. Mit CYP109Q5 gelang es zudem, die komplexen Sesquiterpene umzusetzen, wobei einzelne Varianten eine zum Teil enorme Steigerung der Aktivität und Verschiebung der Selektivität aufwiesen. Ein effizientes Ganzzellsystem erlaubte schließlich die Identifizierung von Produkten ausgewählter Biotransformationen. Mit Hilfe der aktivsten Variante V80A/A280I und der Verwendung des Lösungsmittelvermittlers Cyclodextrin wurden die Hauptprodukte Longifolenaldehyd und Solavetivol synthetisiert. Letzteres dient unter anderem als Vorstufe des Solavetivons, einem wertvollen Phytoalexin. Insgesamt erwies sich CYP109Q5 als hoch evolvierbar und effizient. Die Studien dieser Arbeit zeigen, dass durch rationale Mutagenese aus dem hoch versatilen CYP109Q5-Generalisten mit einem enormen Substratspektrum (Terpene, Steroide und NSAIDs) schrittweise ein industriell wertvoller Spezialist zur Synthese spezifischer Produkte entwickelt werden kann.
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    Sequence specificity analysis of the SETD2 protein lysine methyltransferase and discovery of a SETD2 super-substrate
    (2020) Schuhmacher, Maren Kirstin; Beldar, Serap; Khella, Mina S.; Bröhm, Alexander; Ludwig, Jan; Tempel, Wolfram; Weirich, Sara; Min, Jinrong; Jeltsch, Albert
    SETD2 catalyzes methylation at lysine 36 of histone H3 and it has many disease connections. We investigated the substrate sequence specificity of SETD2 and identified nine additional peptide and one protein (FBN1) substrates. Our data showed that SETD2 strongly prefers amino acids different from those in the H3K36 sequence at several positions of its specificity profile. Based on this, we designed an optimized super-substrate containing four amino acid exchanges and show by quantitative methylation assays with SETD2 that the super-substrate peptide is methylated about 290-fold more efficiently than the H3K36 peptide. Protein methylation studies confirmed very strong SETD2 methylation of the super-substrate in vitro and in cells. We solved the structure of SETD2 with bound super-substrate peptide containing a target lysine to methionine mutation, which revealed better interactions involving three of the substituted residues. Our data illustrate that substrate sequence design can strongly increase the activity of protein lysine methyltransferases.
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    Low-level endothelial TRAIL-receptor expression obstructs the CNS-delivery of angiopep-2 functionalised TRAIL-receptor agonists for the treatment of glioblastoma
    (2021) Krishna Moorthy, Nivetha; Seifert, Oliver; Eisler, Stephan; Weirich, Sara; Kontermann, Roland; Rehm, Markus; Fullstone, Gavin
    Glioblastoma (GBM) is the most malignant and aggressive form of glioma and is associated with a poor survival rate. Latest generation Tumour Necrosis Factor Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL)-based therapeutics potently induce apoptosis in cancer cells, including GBM cells, by binding to death receptors. However, the blood–brain barrier (BBB) is a major obstacle for these biologics to enter the central nervous system (CNS). We therefore investigated if antibody-based fusion proteins that combine hexavalent TRAIL and angiopep-2 (ANG2) moieties can be developed, with ANG2 promoting receptor-mediated transcytosis (RMT) across the BBB. We demonstrate that these fusion proteins retain the potent apoptosis induction of hexavalent TRAIL-receptor agonists. Importantly, blood–brain barrier cells instead remained highly resistant to this fusion protein. Binding studies indicated that ANG2 is active in these constructs but that TRAIL-ANG2 fusion proteins bind preferentially to BBB endothelial cells via the TRAIL moiety. Consequently, transport studies indicated that TRAIL-ANG2 fusion proteins can, in principle, be shuttled across BBB endothelial cells, but that low TRAIL receptor expression on BBB endothelial cells interferes with efficient transport. Our work therefore demonstrates that TRAIL-ANG2 fusion proteins remain highly potent in inducing apoptosis, but that therapeutic avenues will require combinatorial strategies, such as TRAIL-R masking, to achieve effective CNS transport.
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    G protein-coupled estrogen receptor correlates with Dkk2 expression and has prognostic impact in ovarian cancer patients
    (2021) Fraungruber, Patricia; Kaltofen, Till; Heublein, Sabine; Kuhn, Christina; Mayr, Doris; Burges, Alexander; Mahner, Sven; Rathert, Philipp; Jeschke, Udo; Trillsch, Fabian
    Wnt pathway modulator Dickkopf 2 (Dkk2) and signaling of the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) seem to have essential functions in numerous cancer types. For epithelial ovarian cancer (EOC), it has not been proven if either Dkk2 or the GPER on its own have an independent impact on overall survival (OS). So far, the correlation of both factors and their clinical significance has not systematically been investigated before. Expression levels of Dkk2 were immunohistochemically analyzed in 156 patient samples from different histologic subtypes of EOC applying the immune-reactivity score (IRS). Expression analyses were correlated with clinical and pathological parameters to assess for prognostic relevance. Data analysis was performed using Spearman’s correlations, Kruskal-Wallis-test and Kaplan-Meier estimates. Highest Dkk2 expression of all subtypes was observed in clear cell carcinoma. In addition, Dkk2 expression differed significantly (p<0.001) between low and high grade serous ovarian cancer. A significant correlation of Dkk2 with the cytoplasmic GPER expression was noted (p=0.001) but not for the nuclear estrogen receptor alpha (ERα) or beta (ERβ). Patients exhibiting both, high expression Dkk2 (IRS>4) and GPER (IRS>8), had a significantly better overall survival compared to patients with low expression (61 months vs. 33 months; p=0.024). Dkk2 and GPER expression correlates in EOC and combined expression of both is associated with improved OS. These findings underline the clinical significance of both pathways and indicate a possible prognostic impact as well as a potential for treatment strategies addressing interactions between estrogen and Wnt signaling in ovarian cancer.