Biochemical investigation of the substrate specificity of protein methyltransferases and the identification of novel substrates

Abstract

Posttranslationale Proteinmodifikationen (PTMs) sind wichtig, um verschiedene Proteinfunktionen, wie z. B. Lokalisation, Aktivität, Stabilität und Protein-Protein Interaktionen zu regulieren. In Proteinen können viele Aminosäuren methyliert werden, darunter auch Lysin, Arginin und Glutamin. Methylierungen sind auf vielen verschieden Protein zu finden, jedoch sind Histonproteine die bedeutendsten. Die Histonmethylierung beeinflusst die Chromatinstrukur und spielt eine große Rolle in der Regulation der Transkription. Die Enzyme, die für den Transfer von Methylgruppen auf die Proteine zuständig sind, werden Protein Methyltransferasen (PMTs) genannt. Sie sind sehr spezifisch und methylieren immer nur eine Art von Aminosäuren. Dabei zeigt die schnell steigende Anzahl an Berichten über die Methylierung von Proteinen, dass die Methylierung als posttranslationale Modifikation in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewinnt. In dieser Doktorarbeit wurde die Substratspezifität dreier unterschiedlicher Protein Methyltransferasen untersucht, und zwar von HEMK2, einer Glutamin Methyltransferase, sowie von NSD2 und Clr4, zwei Protein Lysin Methyltransferasen (PKMTs). Die Glutamin Methyltransferase HEMK2 methyliert Q185 des Terminationsfaktors eRF1 (eukaryotic translation release factor 1), der für die Termination der Peptidsynthese und für die Hydrolyse der Polypeptidkette von der tRNA am Ribosom verantwortlich ist. Zur Bestimmung der Substratspezifität von HEMK2 wurde die Aminosäuresequenz von eRF1 als Vorlage verwendet und die erhaltenen Daten zeigen, dass das Substrat für eine Methylierung ein G-Q-X3-K Sequenzmotiv besitzen muss. Eine Suche nach dieser Sequenz in einer Proteindatenbank ergab, dass mehrere humane Proteine dieses Sequenzmotiv besitzen. Von diesen identifizierten Substratkandidaten wurden 125 von HEMK2 auf Peptidebene methyliert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass von diesen 125 Kandidaten 16 auf Proteinebene methyliert werden. Zuletzt wurde eine Methylierung der „Chromodomain helicase DNA binding protein 5“ (CHD5) und „Nuclear protein in Testis“ (NUT) Proteine mit Hilfe eines glutaminspezifischen Antikörpers in menschlichen HEK293 Zellen nachgewiesen. NSD2 ist ein Mitglied der „nuclear receptor SET domain-containing“ Enzymfamilie und dimethyliert Lysin K36 von Histon H3 und Lysin K44 von Histon H4. Es wurde gezeigt, dass eine abnormale Expression von NSD2 zu verschiedenen Arten von Krebs und dem Wolf-Hirschhorn Syndrom führen kann. Die Analyse der Substratspezifität von NSD2 zeigte, dass dieses Enzym die Aminosäuren G33 bis P38 von H3 erkennt. Dabei werden hydrophobe Aminosäuren an den Positionen -1 und +2 (das Ziellysin wird hierbei als Position 0 definiert) bevorzugt. Mit Hilfe des Spezifitätsprofils von NSD2 wurden mehrere humane Proteine identifiziert, die dieses Sequenzmotiv enthalten. Von diesen identifizierten Substratkandidaten wurden 45 durch NSD2 auf Peptidebene methyliert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass 3 Kandidaten (ATRX, FANCM und SET8) auf Proteinebene methyliert wurden und zusätzlich konnte die Methylierung von ATRX und FANCM durch NSD2 in HEK293 Zellen nachgewiesen werden. Da die Methylierungen einen erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften und Funktionen von Proteinen besitzen, müssen weitere Experimente an den neuen Substraten von HEMK2 (CHD5 und NUT) und NSD2 (ATRX und FANCM) durchgeführt werden, um die Auswirkungen auf die biologischen Funktionen der Methylierung herauszufinden. Abgesehen von den menschlichen Enzymen, wurden ähnliche Untersuchungen auch an der Histon Lysin Methyltransferase Clr4, einem SUV39H1-Homolog aus S. pombe, durchgeführt. Clr4 trimethyliert Lysin K9 des Histonproteins H3. Zur Bestimmung des Spezifitätsprofils von Clr4 wurde die Aminosäuresequenz von H3 (1 - 18) verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass Clr4 spezifisch die Aminosäuren der Positionen -1 bis +3 der Zielsequenz erkennt. Zusätzlich wurden 6 neue Peptidsubstrate aus S. pombe identifizieren, die durch Clr4 methyliert wurden. Um die Detektion von Proteinmethylierungen weiter zu verbessern, wurde eine neue radioaktivitätsfreie, Mikrotiter-Untersuchungsmethode entwickelt, die natürlich vorkommende Lese-Domänen anstelle von methylspezifischen Antikörpern zur Erkennung von Methylierungen auf Histonpeptiden verwendet. Es wurde gezeigt, dass diese Methode erfolgreich die Methyltransferaseaktivität bestimmen und für die Suche nach PKMT Inhibitoren verwendet werden kann.