Identification and characterization of Dop1p as an essential component of the Neo1p-Ysl2p-Arl1p membrane remodeling complex

Abstract

Vesicular trafficking requires molecular mechanisms that drive membrane-enclosed organelles to bud vesicles and fuse with incoming ones. Understanding how these highly-curved transport structures are generated has been challenging. The best understood mechanisms for the generation of vesicles in the secretory and endocytic pathways involve the assembly of cytosolic coat proteins. However some other proteins have been implicated in the generation of the high curvature needed to form a vesicle. Prime candidates are the phospholipid translocases from the P4-ATPase subfamily, which are thought to pump phospholipids from the exocytosolic leaflet of a membrane to its cytosolic leaflet thereby deforming membranes. In the group of B. Singer-Krüger, the yeast P4-ATPase Neo1p was identified as being an interaction partner of Ysl2p, a protein that has sequence similarity to large Arf GEFs from the BIG and GBF family, and to be genetically linked to the small Arf-like GTPase Arl1p. A recent study demonstrated that a network formed by these proteins (the Neo1p-Ysl2p-Arl1p network), helps recruiting the GGAs clathrin adaptors to the TGN/endosomal system. Recently, members of the conserved Cdc50 family were identified as being transport chaperones for some of the P4-ATPases. Therefore, initially in this PhD thesis I studied the putative connection of Neo1p with this protein family. However, while all the other yeast P4-ATPases seem to require a specific member of the Cdc50 family for their export from the ER, this does not seem to be the case for Neo1p. This result led to the search for a novel protein required for Neo1p function. Herein, Dop1p, an essential yeast protein of about 195 kDa and highly conserved among eukaryotes, was identified as being a binding partner of Neo1p and Ysl2p. Studies using neo1, dop1, Δysl2 mutants, revealed that the respective proteins, Neo1p, Dop1p and Ysl2p, are interdependent thereby suggesting that they might exist in a complex. Significantly, in a temperature-sensitive dop1-3 mutant both Neo1p and Ysl2p were found to be specifically destabilised. Similarly, a comparable loss of Ysl2p and Dop1p was also found in neo1-69 cells while in Δysl2 cells a remarkable reduction of both Neo1p and Dop1p was observed. Consistent with this reciprocal dependency effect, NEO1 is a suppressor of dop1-3 and Δysl2 mutants and DOP1 a suppressor of neo1-69 and Δysl2 mutants. The relationship between Dop1p and Neo1p is further strengthened by the observation that the neo1-69 and dop1-3 mutants display several similar phenotypic defects and that similarly to Neo1p, Dop1p also localises to the endosomes. Interestingly, although Ysl2p interacts with Dop1p, the Neo1p-Dop1p interaction is independent of Ysl2p and Dop1p is still localised to the TGN/endosomes in the absence of Ysl2p. In order to get some insights in the features of the large protein Dop1, the conserved N-terminal region, the C-terminal region containing leucine zipper-like repeats, and the less conserved internal segment were separately expressed as GFP-fusions and their subcellular localisations and molecular interactions were analysed. These analyses revealed that the different regions of Dop1p had distinct localisation patterns and binding affinities to Neo1p and Ysl2p. The internal region of Dop1p seems to be particularly important for the endosomal membrane association of the protein. Additionally, the presence of leucine zipper-like repeats at the C-terminus of Dop1p suggested that this protein could form dimers or oligomers and indeed Dop1p is able to self-interact. In addition, a conserved PPSY motif in the C-terminus of Neo1p was identified. This led to the examination of Neo1p ubiquitination. The introduction of point mutations in this motif resulted in an improved cell growth at high temperatures. However, whether this motif is related to Neo1p ubiquitination awaits further investigations. In summary, this work identified Dop1p as a novel component of the Neo1p-Ysl2p-Arl1p complex. Moreover, the analysis of the distinct regions of Dop1p shed some light in their putative role within this protein.

Der vesikuläre Transport bedarf molekularer Mechanismen, durch welche membranumschlossene Organellen Vesikel abknospen sowie mit hinzukommenden Vesikeln fusionieren. Eine große Herausforderung besteht darin zu erkennen wie diese stark gekrümmten Transportstrukturen erzeugt werden. Der am besten verstandene Mechanismus zur Erzeugung von Vesikeln im sekretorischen und endocytischen Vesikelweg umfasst die Assemblierung von zytosolischen Hüllenproteinen. Es wurden jedoch auch andere, für die Erzeugung der starken Krümmung verantwortlichen, Proteine identifiziert. Erste Kandidaten sind Phospholipid-Translokasen aus der Subfamilie der P4-ATPasen, welche Phospholipide aus der exozytosolischen in die zytosolische Schicht der Membran überführen sollen, um dadurch zu einer Deformation der Membran zu führen. In der Gruppe von PD Dr. B. Singer-Krüger wurde Neo1p, eine P4-ATPase aus der Hefe, identifiziert als Interaktionspartner von Ysl2p, einem Protein mit Sequenzänlichkeit mit großen Arf GEFs der BIG und GBF Familie sowie genetischer Interaktion mit der kleinen Arf-ähnlichen GTPase Arl1p. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass ein Netzwerk dieser Proteine (das Neo1p-Ysl2p-Arl1p-Netzwerk) bei der Rekrutierung der GGA Clathrin-Adaptoren zum TGN/endosomalen System mitwirkt. Mitglieder der konservierten Cdc50 Familie wurden kürzlich als Transport-Chaperone für manche P4-ATPasen identifiziert. Aufgrund dessen habe ich in dieser Doktorarbeit zunächst die mögliche Verknüpfung von Neo1p mit dieser Proteinfamilie untersucht. Während, alle anderen vier P4-ATPasen der Hefe ein spezifisches Mitglied der Cdc50 Familie benötigen um aus dem ER transportiert zu werden, scheint diese Bedingung nicht auf Neo1p zuzutreffen. Dieses Ergebnis führte zu der Suche nach neuen Proteinen, die für die Neo1p-Funktion benötigt werden. Daraufhin wurde Dop1p, ein essentielles Hefeprotein von ca. 195 kDa, das stark konserviert ist unter Eukaryoten, als Bindungspartner von Neo1p und Ysl2p identifiziert. Untersuchungen der neo1, dop1, Δysl2 Mutanten zeigt en, dass die betreffenden Proteine Neo1p, Dop1p and Ysl2p gegenseitig abhängig sind, wodurch sich die Möglichkeit ergibt, dass diese Proteine in einem Komplex vorliegen. Bezeichnenderweise, in der temperatur-sensitiven dop1-3 Mutante wurden sowohl Neo1p als auch Ysl2p gezielt destabilisiert. Ein vergleichbarer Verlust von Ysl2p und Dop1p wurde auch in neo1-69 Zellen verzeichnet, während in Δysl2 Zellen eine beträchtliche Reduktion sowohl von Neo1p als auch von Dop1p beobachtet werden konnte. Im Einklang mit dieser reziproken Abhängigkeit ist NEO1 ein Supressor der dop1-3 und Δysl2 Mutanten sowie DOP1 ein Supressor der neo1-69 und Δysl2 Mutanten. Die Wechselwirkung zwischen Dop1p und Neo1p ist ausserdem verstärkt durch die Beobachtung, dass die neo1-69 und dop1-3 Mutanten einige ähnliche phänotypische Defekte aufweisen und ausserdem Dop1p, ähnlich wie Neo1p, an Endosomen lokalisiert. Interessanterweise, obwohl Ysl2p mit Dop1p interagiert, ist die Neo1p-Dop1p-Interaktion unabhängig von Ysl2p und ausserdem lokalisiert Dop1p am TGN/Endosomen auch in der Abwesenheit von Ysl2p. Um einige Einblicke in die Besonderheiten des großen Proteins Dop1p zu bekommen, wurde die C-terminale Region mit den konservierten Leucin-Zippern-Motiv sowie das weniger konservierte interne Segment separat als GFP-Fusionen exprimiert und daraufhin deren subzelluläre Lokalisierung und die molekularen Interaktionen untersucht. Diese Analysen zeigten, dass die verschiedenen Regionen von Dop1p unterschiedliche Lokalisierungsmuster aufweisen und verschiedene Affinitäten für Neo1p und Ysl2p aufweisen. Die interne Region von Dop1p scheint insbesondere für die endosomale Lokalisierung des Proteins von Bedetung zu sein. Zusätzlich könnte die Anwesenheit der Leucin-Zipper am C-Terminus ein Indiz dafür sein, dass das Protein Dimere oder Oligomere bildet. Und in der Tat, Dop1p ist in der Lage mit sich selbst zu interagieren. Des Weiteren wurde ein konserviertes PPSY-Motiv am C-Terminus von Neo1p identifiziert. Dies führte zu der Untersuchung der Ubiquitinierung von Neo1p. Punktmutationen in dieser Region führten zu einem verbesserten Wachstum bei höheren Temperaturen. Ob dieses Motiv mit einer Ubiquitinierung von Neo1p zusammenhängt muss noch weiter untersucht werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit Dop1p al seine neue Komponente des Neo1p-Ysl2p-Arl1p-Komplexes identifiziert. Des Weiteren hat die Analyse der unterschiedlichen Regionen von Dop1p etwas Licht gebracht in deren mögliche Rollen innerhalb dieses Proteins.