Biochemical characterisation of tRNA-Asp methyltransferase Dnmt2 and its physiological significance

Abstract

Methylation of tRNA plays important roles in the stabilisation of tRNAs and accurate protein synthesis in cells. In eukaryotes various tRNA methyltransferases exist, among them DNMT2 which methylates tRNAAsp at position C38 in the anticodon loop. It is also called tRNA-aspartate methyltransferase 1 (Trdmt1) and the enzyme is highly conserved among eukaryotes. In this work, I investigated the mechanism of DNMT2 interaction with tRNAAsp, characterised the function of the only prokaryotic Dnmt2 homolog found in G. sulfurreducens and studied the physiological importance of the C38 methylation of tRNAAsp in mammalian cells. The molecular details of the interaction of DNMT2 and tRNAAsp are unknown due to lack of the co-crystal structure. Here, I characterised the important residues in DNMT2 required for the tRNA binding and catalysis. By site-directed mutagenesis of 20 conserved lysine and arginine residues in DNMT2, I show that 8 of them have a strong effect on the catalytic activity of the enzyme. They map to one side of the enzyme where the catalytic pocket of DNMT2 is located. The binding of most of the mutant enzymes to tRNA was unaffected suggesting a role of these residues in transition state stabilisation. Manual docking of tRNAAsp into the surface cleft decorated by the 8 residues suggested that DNMT2 interacts mainly with the anticodon stem/loop of tRNAAsp. In my second project, I characterised the function of Dnmt2 homolog found in G. sulfurreducens (GsDnmt2). Here, I show that GsDnmt2 methylates tRNAGlu more efficiently than tRNAAsp. I also report the molecular basis for the swapped substrate specificity of GsDnmt2 and show that the variable loops of G.sulfurreducens tRNAAsp and tRNAGlu of eukaryotes contain a -GG- dinucleotide which is not preferred by Dnmt2. Exchange of the variable loop of mouse tRNAAsp to that tRNAGlu led to dramatic decrease in the activity of human DNMT2. This identifies the variable loop of tRNA as a specificity determinant in the recognition by Dnmt2.

In my final project, I investigated the physiological importance of the tRNAAsp C38 methylation in aminoacylation and cellular protein synthesis. Here, I report that C38 methylation enhances the rate of aspartylation on tRNAAsp by 4-5 folds. Concomitant with this, a decrease in the charging levels of tRNAAsp was observed in Dnmt2 knockout MEF cells, which also showed a reduced efficiency in the synthesis of proteins containing poly-Asp sequences. A gene ontology searches for proteins with poly-Asp sequences showed that a significant number of these proteins are associated with transcriptional regulation and gene expression functions. With this I propose that the mild phenotype observed with the Dnmt2 KO cells under stress condition could be correlated to a disregulation of protein synthesis.

Die Methylierung von tRNA spielt eine wichtige Rolle in deren Stabilisierung und ist ebenfalls bedeutend für die fehlerfreie Proteinbiosynthese in den Zellen. In Eukaryoten existieren diverse tRNA Methyltransferasen, darunter auch die tRNA Methyltransferase DNMT2. DNMT2 methyliert tRNAAsp an der Stelle C38 in der Anticodonschleife. Diese Methyltransferase wird auch als „tRNA-Aspartat Methyltransferase 1“ (Trdm1) bezeichnet und ist in Eukaryoten hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit wurde der Mechanismus der Interaktion von DNMT2 mit tRNAAsp erforscht. Weiterhin wurde die Funktion des einzigen prokaryotischen Dnmt2 Homologs, welches in G. sulfurreducens gefunden wurde, charakterisiert. Außerdem wurde die physiologische Funktion der C38 Methylierung von tRNAAsp in humanen Zellen untersucht. Aufgrund fehlender Struktur der Dnmt2 im Komplex mit tRNAAsp sind die molekularen Details der Interaktion zwischen DNMT2 und ihrem Substrat bisher unbekannt. Hierfür sollten in der vorliegenden Arbeit die wichtigen Reste von DNMT2 charakterisiert werden, welche für die tRNA Bindung und Katalyse benötigt werden. Durch gerichtete Mutagenese von 20 konservierten Lysin- und Argininresten von DNMT2, konnte gezeigt werden, dass acht von ihnen die katalytische Aktivität des Enzyms stark beeinflussen. Diese Reste befinden sich auf einer Seite der katalytischen Tasche des Enzyms. Die Bindung der meisten mutierten Enzyme an die tRNA wurde nicht beeinflusst. Daraus lässt sich schließen, dass diese Reste eine wichtige Rolle in der Stabilisierung des Übergangszustands haben. Ein simuliertes Binden, der tRNAAsp an die Tasche des Enzyms, deutet darauf hin, dass DNMT2 hauptsächlich mit dem Anticodon Stamm der tRNA-Asp interagiert. Das zweite Projekt sollte die Funktion des Dnmt2 Homologs untersuchen. Das Dnmt2 Homolog stammt aus G. sulfurreducens (GsDnmt2). Es konnte gezeigt werden, dass GsDnmt2 tRNAGlu mit höherer Effizienz methyliert wurde als tRNAAsp. Die molekularen Grundlagen für diese Änderung der Substratspezifität von GsDnmt2 wurde untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass die variable Schleife von G. sulfurreducens tRNAAsp und tRNAGlu der Eukaryoten eine GG Dinukleotidsequenz enthalten. Das Vorhandensein dieser GG Dinukleotide hat einen negativen Einfluss auf die Dnmt2 Aktivität. Der Austausch dieser variablen Schleife in Maus tRNAAsp führte zu einer dramatischen Abnahme der Aktivität von humanem DNMT2. Dies zeigt, dass die variable Schleife der tRNA als eine Spezifitätsdeterminante für die Erkennung durch Dnmt2 dient. Das letzte Projekt befasst sich mit der physiologischen Bedeutung der tRNAAsp C38 Methylierung im Bezug auf die Aminoacylierung und zelluläre Proteinsynthese. Es konnte gezeigt werden, dass die C38 Methylierung die Acylierungsrate von tRNAAsp um das 4-5 fache verstärkt. Gleichzeitig konnte in Dnmt2 knockout MEF Zellen eine Abnahme der Aminoacylierung der tRNAAsp beobachtet werden, was zu einer reduzierten Effizienz in der Proteinbiosynthese von Proteinen mit einer Poly-Asp Sequenz führt. Eine Gen-Ontologie Analyse von Proteinen mit poly-Asp Sequenzen, zeigte, dass eine signifikante Anzahl dieser Proteine mit transkriptionaler Regulation und Genexpressionfunktionen assoziiert sind. Daraus lässt sich schließen, dass der schwache Phänotyp, der unter Stressbedingungen in Dnmt2 KO Zellen beobachtet wurde, mit einer Fehlregulation der Proteinsynthese korreliert sein könnte.