Molekularbiologische Untersuchungen des Abbauweges von 4-Sulfocatechol durch Hydrogenophaga intermedia S1 und Agrobacterium radiobacter S2

Abstract

Eine bakterielle Zweispezies-Kultur aus den Stämmen Hydrogenophaga intermedia S1 und Agrobacterium radiobacter S2 wurde untersucht. Diese Mischkultur war in der Lage, den naturfremden Stoff 4-Aminobenzolsulfonat (4ABS) als einzige Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Energiequelle zu nutzen. In der Mischkultur oxidiert der Stamm S1 das 4ABS zu 4-Sulfocatechol (4SC), welches als zentraler Metabolit im bakteriellen Abbau von anderen substituierten Benzolsulfonaten identifiziert wurde. 4SC wird zum Teil in das Medium ausgeschieden und von dem Stamm S2 aufgenommen. Das 4SC wird von den beiden Stämmen über einen dem Protocatechuat-Zweig des β-Ketoadipat-Weges analogen Stoffwechselweg abgebaut. Hierbei wird 4SC von den beiden Stämmen durch eine intradiole Ringspaltung zu 3-Sulfomuconat (3SM) umgesetzt. 3-Sulfomuconat wird anschließend zu 4-Carboxymethylen-4-sulfobut-2-en-olid (4-Sulfolacton, 4SL) durch 3-Carboxymuconat-Cycloisomerasen (CMLE) cycloisomerisiert. Die Desulfonierung des 4-Sulfolactons zu Maleylacetat (MA) erfolgt durch 4-Sulfolacton-Hydrolasen (SLH). Maleylacetat wird daraufhin von den Stämmen S1 und S2 mit Hilfe von Maleylacetat-Reduktasen zu β-Ketoadipat reduziert. Es wurde in früheren Untersuchungen gezeigt, dass die 4SC oxidierenden Enzyme aus den Stämmen S1 und S2 auch Protocatechuat und die 3SM umsetzenden Aktivitäten auch 3-Carboxy-cis,cis-muconat (3CM) als Substrate akzeptierten. Aus diesem Grund wurden die Enzyme, die nur Protocatechuat und dessen Folgeprodukte umsetzen, als Typ I Enzyme bezeichnet. Dagegen wurden die Enzyme, die auch die sulfonierten Struktur-Analoga umsetzen, als Typ II Enzyme angesprochen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die weiteren am 4-Sulfocatechol Abbauweg beteiligten Enzyme charakterisiert. Hierbei wurde zunächst der Umsatz von 3SM zu 4SL im Vergleich mit dem Umsatz von 3CM zu 4-Carboxymuconolacton (4CL) untersucht. Hierzu wurden die Gene pcaB1 und pcaB2 aus den Stämmen S1 und S2 in E. coli überexprimiert. Die kodierten CMLEs Typ I und Typ II wurden aufgereinigt und charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass sowohl die CMLEs vom Typ II aus H. intermedia und A. radiobacter (HiCMLE2 und ArCMLE2) als auch die CMLE von Typ I aus A. radiobacter (ArCMLE1) 3SM zu 4SL umsetzten. Die grundlegenden kinetischen Parameter der drei Enzyme wurden mit 3CM und 3SM als Substrate bestimmt. Obwohl die HiCMLE2 und ArCMLE2 eine gewisse Spezialisierung an den Umsatz von 3SM zeigten (Vmax = 53 bzw. 29,5 U/mg mit 3SM im Vergleich zu 1,5 bzw. 1,3 U/mg mit 3CM), besaß die ArCMLE1 eine höhere spezifische Aktivität mit 3SM als Substrat (Vmax = 130 U/mg mit 3SM im Vergleich zu 2270 U/mg mit 3CM). Die Gene, die für die 4-Sulfolacton-Hydrolasen kodierten, konnten „downstream“ der pcaB2-Gene in den beiden Stämmen identifiziert werden. Die Gene wurden in E. coli exprimiert und die 4-Sulfolacton-Hydrolasen aufgereinigt und charakterisiert. Die SLH aus H. intermedia (HiSLH) setzte 4SL mit höheren Vmax- und Km-Werten als das Enzym aus A. radiobacter (ArSLH) um, allerdings waren die katalytischen Konstanten der beiden Enzyme sehr ähnlich (kcat/Km = 1417 mM-1 min-1 für HiSLH im Vergleich zu 1233 mM-1 min-1 für ArSLH). Beim Umsatz von 4-Sulfolacton wurde die Freisetzung annähernd äquimolarer Mengen von Maleylacetat und Sulfit nachgewiesen. 4-Sulfolacton (4SL) zeigte eine Strukturähnlichkeit zu 2-Pyron-4,6-dicarboxylat (PDC), einem Intermediat in einem extradiolen Abbauweg von Protocatechuat über eine Protocatechuat-4,5-Dioxygenase Reaktion. Es wurden signifikante Sequenzähnlichkeiten zwischen den 4-Sulfolacton-Hydrolasen aus den Stämmen S1 und S2 und der 2-Pyron-4,6-dicarboxylat-Hydrolase (PDCH) aus dem Stamm S. paucimobilis nachgewiesen. Umsatzversuche mit 4SL und PDC zeigten, dass HiSLH und ArSLH eine eigenständige Gruppe von Enzymen darstellen, da die SLHs kein PDC und die PDHC kein 4SL umsetzten. Weiterführende Sequenzvergleiche zeigten Sequenzähnlichkeiten zwischen den carboxyterminalen Bereichen der 4-Sulfolacton-Hydrolasen und den zyklischen Amidasen, zu denen Enzyme wie z.B. D-Hydantoinasen und Dihydropyrimidasen gehören, die Mn2+-, Mg2+-, Zn2+-, Ni2+- oder Co2+- Ionen in ihren aktiven Zentren beinhalten. Deshalb wurde der Metallgehalt der HiSLH mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) bestimmt, wobei Zn2+-Ionen im aktiven Zentrum der HiSLH identifiziert wurden. Abschließend wurde der Abbauweg von 4SC durch die rekombinanten Enzyme mittels in-situ 1H-Kernresonanzspektroskopie bestätigt und die Entstehung jedes Reaktionsprodukts im Verlauf des Abbauweges nachgewiesen.

A bacterial two-species culture consisting of Hydrogenophaga intermedia S1 and Agrobacterium radiobacter S2 was studied. This mixed culture was able to use the xenobiotic compound 4-aminobenzenesulfonate (4ABS) as the sole source of carbon, nitrogen, sulfur and energy. In the mixed culture strain S1 oxidizes 4ABS to 4-sulfocatechol (4SC), which was identified as the central metabolite in the bacterial degradation of other substituted benzenesulfonates. 4SC is excreted by strain S1 into the medium and taken up by strain S2. Both strains degrade 4SC through a metabolic pathway which is analogous to the protocatechuate branch of the β-ketoadipate pathway. Initially, 4SC is oxidized by an ortho-cleavage mechanism to 3-sulfomuconate (3SM). Subsequently, the further metabolism of 3-sulfomuconate is catalysed by certain 3-carboxy-cis,cis-muconate lactonizing enzymes (CMLE) to 4-carboxymethylen-4-sulfobut-2-en-olid (4-sulfomuconolactone, 4SL). The desulfonation of 4SL to maleylacetate (MA) is catalyzed by 4-sulfomuconolactone hydrolases. The intermediately formed maleylacetate is reduced to β-ketoadipate by maleylacetate reductases. It was previously shown that the 4SC oxidizing enzymes from strains S1 and S2 also oxidized protocatechuate and that the 3SM lactonizing activities also converted 3-carboxy-cis,cis-muconate (3CM). Therefore, the enzymes converting only protocatechuate and its ensuing products were called type I enzymes. The enzymes which also converted the sulfonated structural analogues were described as type II enzymes. In the course of the present study, the other enzymes which are involved in the 4-sulfocatechol degradative pathway were characterized. Initially, the conversion of 3SM to 4SL was analyzed in comparison to the transformation of 3CM to 4-carboxymuconolactone (4CL).The genes pcaB1 and pcaB2 from the strains S1 and S2 were expressed in E. coli and the encoded CMLEs of type I and type II were purified and characterized. It was shown that the CMLEs of type II from H. intermedia and A. radiobacter (HiCMLE2 and ArCMLE2) and also the CMLE of type I from A. radiobacter (ArCMLE1) converted 3SM to 4SL. The kinetic parameters of the three enzymes were determined with 3CM and 3SM as substrates. The HiCMLE2 and ArCMLE2 converted 3SM with higher specific activities than 3CM (Vmax= 53 and 29.5 U/mg with 3SM compared to 1.5 and 1.3 U/mg with 3CM). Surprisingly, ArCMLE1 had a higher specific activity with 3SM as substrate than the other CMLEs of typ II (Vmax= 130 U/mg with 3SM compared to 2270 U/mg with 3CM). The genes that coded for the 4-sulfomuconolactone hydrolases (SLH) were identified in both strains downstream of the pcaB2 genes. The genes were expressed in E. coli and the 4-sulfomuconolactone hydrolases were purified and characterized. The SLH from H. intermedia (HiSLH) converted 4SL with higher Vmax- and Km-values than the enzyme from A. radiobacter (ArSLH). However, the catalytic constants of both enzymes were very similar (kcat/Km=1417 mM-1 min-1 for HiSLH compared to 1233 mM-1 min-1 for ArSLH). The enzymatic conversion of 4-sulfomuconolactone resulted in the release of approximately equimolar amounts of maleylacetate and sulfite. 4SL showed a structural resemblance to 2-pyrone-4,6-dicarboxylate (PDC), which was identified as an intermediate in an extradiol degradative pathway of protocatechuate via a protocatechuate 4,5-dioxygenase reaction. Significant sequence similarities between the SLHs from strains S1 and S2 and the 2-pyrone-4,6-dicarboxylate hydrolase (PDCH) from Sphingomonas paucimobilis SYK-6 were found. The incubation of HiSLH with PDC and the incubation of PDCH with 4SL demonstrated no cross-reactivities for both enzymes. Therefore, it was suggested that 4-sulfomuconolactone hydrolases form an independent group of enzymes. Further, sequence comparisons demonstrated some sequence similarities between the carboxyterminal parts of SLHs and the cyclic amidases to which enzymes such as D-hydantoinases and dihydropyrimidases belong which contain divalent cations in their active site (e.g. Mn2+, Mg2+, Zn2+, Ni2+ or Co2+). Therefore, the metal content of the HiSLH was determined using plasma mass spectrometry (ICP-MS). Thus, Zn2+-ions were identified in the active center of HiSLH. Finally, the proposed degradative pathway of 4SC was confirmed with the recombinant enzymes using in-situ 1H-NMR. Thus, the structure of each intermediate of the degradative pathway was proven.