Änderung der Substratspezifität von Transaldolasen

Abstract

Transaldolasen (EC 2.2.1.2) gehören zur Enzymklasse der Transferasen und katalysieren den reversiblen Transfer einer Dihydroxyacetoneinheit von einem Donor auf einen Akzeptor. Dabei entsteht eine neue C-C-Bindung mit einer 3S, 4R-Konfiguration. Transaldolasen sind weit verbreitete Enzyme des Pentosephosphat-Weges und kommen in Bacteria, Eukarya und Archaea vor. Transaldolasen verwenden u.a. D-Sedoheptulose-7-Phosphat als Donor und übertragen eine Dihydroxyacetoneinheit auf D-Glycerinaldehyd-3-Phosphat, dabei entstehen zwei neue Produkte D-Fructose-6-Phosphat und D-Erythrose-4-Phosphat. In der Biokatalyse sind C-C-Bindungen knüpfende Enzyme wie z. B. die Aldolasen, die Produkte mit bis zu zwei neuen Stereozentren bilden, gegenüber chemischen Synthesewegen von Vorteil. Im Gegensatz zu chemischen Synthesewegen sind Enzyme meist hoch chemo-, stereo-, regioselektiv und arbeiten unter milden Reaktionsbedingungen. Aldolasen sind meist streng donorspezifisch. Aldolasen, die DHAP (Dihydroxyacetonphosphat) als Donor verwenden, werden zur Synthese von z. B. 13C-markierten Zuckern, Desoxyzuckern, Fluorozuckern, Antibiotika, Geruch-/Geschmacksstoffen, Azazuckern und Iminocyclitolen eingesetzt. DHAP ist von Nachteil, weil es instabil, schwierig zu synthetisieren und teuer ist. Ein Enzym, das DHA (Dihydroxyaceton) als Donor verwendet, wäre von Vorteil. Die Fructose-6-Phosphat Aldolase (FSA) von E. coli verwendet u.a. DHA als Donor. Vorteile von FSA sind, dass es ein breites Substratspektrum besitzt und schnell über Hitzefällung anzureichern ist. Nachteile von FSA sind, dass Muteine bei einer Hitzefällung häufig denaturieren und die Expressionshöhe je nach Stamm starken Schwankungen unterliegt. Ein weiteres Enzym von E. coli ist die Transaldolase B (TalB) TalB bildet neue C-C-Bindungen, besitzt ein relativ breites Substratspektrum und eine hohe Stereospezifität, wird aber bislang in der Biokatalyse nicht eingesetzt. Bei TalB ist von Nachteil, dass das Enzym aus zwei Substraten nicht ein Produkt im Überschuss liefert, sondern zwei Produkte äquimolar. In der vorliegenden Arbeit sollte die Transaldolase B (TalB) von E. coli durch Mutagenese, so verändert werden, dass Muteine mit veränderter Substratspezifität entstehen. Der erste Schritt war das rekombinante His6-TalB so zu verändern, dass eine neue Enzymvariante mit DHA als Donor und D-Glycerinaldehyd-3-Phosphat (D-GAP) als Akzeptor D-Fructose-6-Phosphat (D-F6P) mit einer höheren spezifischen Aktivität bildet als der Wildtyp. Damit würde die neue TalB-Variante DHA als Substrat verwenden und wäre damit als Ausgangspunkt für biokatalytische Synthesen von Interesse. TalB wurde der FSA in einem strukturbasierten Sequenzvergleich gegenübergestellt. An insgesamt elf Aminosäurepositionen des aktiven Zentrums von TalB, in denen sich die beiden Enzyme unterscheiden, wurden diese Aminosäurereste durch Sättigungsmutagenese in die 19 anderen Aminosäuren ausgetauscht. Für jede der elf Positionen wurde eine Bank mit bis zu 19 verschiedenen Proteinvarianten gebildet, die auf eine Synthese von D-F6P aus DHA und D-GAP (als D,L-GAP angeboten), mit einem neu entwickelten Farbnachweis im Mikrotitermaßstab, untersucht wurden. Nur der Aminosäureaustausch von Phe nach Tyr an der Position 178 (TalBF178Y) führte zur gewünschten verbesserten Aktivität [Schneider et al. 2008, JBC 283, S. 30064-30072]. His6-TalBF178Y wurde mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt (Reinheit: > 97%) und charakterisiert. Als Vergleich wurden die E. coli Enzyme His6-TalB und FSA verwendet. Für His6-TalBF178Y wurde eine verbleibende Transaldolaseaktivität mit einem Vmax-Wert für D-F6P von 14 ± 1 U/mg (~ 16% der TalB-Wildtypaktivität) in der Transferreaktion gemessen. Dagegen wurde eine 70fach verbesserte Aktivität in der D-F6P-Bildungsreaktion (7 ± 1 U/mg, gegenüber His6-TalB: &#8804; 0,1 U/mg), mit DHA als Donor und D-GAP als Akzeptor, bestimmt. Darüber hinaus besitzt His6-TalBF178Y eine ähnliche katalytische Effizienz wie FSA (kcat/Km von FSA: 130 M-1 s-1, His6-TalBY: 150 M-1 s-1). Die Affinität für DHA von His6-TalBF178Y ist doppelt so hoch wie die von FSA (Km-Wert für DHA von FSA: 62 ± 7 mM, His6-TalBF178Y: 30 ± 4 mM). In der strukturell sehr ähnlichen humanen Transaldolase (TALDO1, hTal) führte der Austausch der konservierten Aminosäure Phe189, von Phe nach Tyr (hTalF189Y), ebenfalls zum Erwerb einer FSA-Aktivität. Bei der Kondensationsreaktion von DHA und D-GAP zu D-F6P wurde ein Vmax-Wert für DHA von 14 U/mg (hTal: < 0,1 U/mg) bestimmt. Die hTal-Varianten, hTal und hTalF189Y, wurden als GST-Fusionsproteine gereinigt, die GST-Tags wurden mittels Tev-Proteaseverdau entfernt. Wie die bakterielle Transaldolase lag sowohl die wildtypische hTal (berechnete molekulare Größe von hTal: 37,5 kDa) wie auch hTalF189Y als Dimer (77 ± 10 kDa durch Größenausschlusschromatographie bestimmt) vor. hTalF189Y besitzt eine Transaldolase-Aktivität mit einem Vmax-Wert für D-F6P von 12 ± 2 U/mg (hTal: 29 U/mg). Sowohl His6-TalBF178Y als auch hTalF189Y katalysieren neben der Kondensation von DHA und D-GAP zu D-F6P auch die Spaltungsreaktion von D-F6P in DHA und D-GAP (Vmax-Wert für D-F6P: His6-TalBF178Y: 0,36 ± 0,05 U/mg; hTalBF189Y: 0,32 ± 0,04 U/mg). Polyklonale Antikörper gegen TalB erkennen auch TalBF178Y, GST-hTal und GST-hTalF189Y. Der zweite Schritt bestand darin His6-TalBF178Y so zu verändern, dass eine neue Enzymvariante den Akzeptor D-Glycerinaldehyd (D-GA, als D,L-GA angeboten) mit einer höheren Affinität verwendet als His6-TalBF178Y (Km-Wert: > 120 mM). Die Kristallstruktur von His6-TalBF178Y wurde in Kooperation mit T. Sandalova und Prof. Schneider (Stockholm, Schweden) gelöst [Schneider et al. 2008, JBC 283, S. 30064-30072]. Im Kristall von His6-TalBF178Y wird ein Sulfation des Puffers von den Aminosäuren Arg181, Ser226 und Arg228 gebunden. Das Sulfation ist ähnlich zu der Phosphatgruppe der Substrate, die wahrscheinlich von den drei Aminosäurereste (Arg181, Ser226, Arg228) gebunden wird. Durch Sättigungsmutagenese wurden drei verschiedene Sättigungsmutagenesebanken (TalBF178YR181X, TalBF178YS226X, TalBF178YR228X) gebildet. Diese Banken wurden mit DHA und D,L-GA als Substrate auf die Synthese von D-Fructose (D-Fru) in einem neu entwickelten Farbnachweis im Mikrotitermaßstab untersucht. In einer dieser Banken (TalBF178YR181X) wurden Enzymvarianten gefunden, die mit 10 mM D,L-GA und DHA eine höhere Aktivität zeigen als TalBF178Y. Die beste Variante, His6-TalBF178YR181E, besitzt für D,L-GA und D-GA eine deutlich höherer Affinität mit Km-Werten von 24 mM bzw. 25 mM als His6-TalBF178Y (D,L-GA: > 120 mM; D-GA; 73 mM). Mit D-GAP als Akzeptor und DHA als Donor besitzt His6-TalBF178YR181E keine messbare Aktivität. His6-TalBF178YR181E zeigt eine verbleibende Transaldolaseaktivität von 1 U/mg (~ 1% der TalB-Wildtypaktivität). Die Kristallstruktur von His6-TalBF178YR181E wurde aufgeklärt (T. Sandalova und Prof. Schneider, Stockholm, Schweden). In der Kristallstruktur von His6-TalBF178YR181E befindet sich im aktiven Zentrum ein Sulfation des Puffers und wird vermutlich von Glu181 und Arg288 mit schwächerer Bindung als in His6-TalBF178Y gebunden. Vermutliche ist Glu181 nicht geladen oder es bindet das Hydrogensulfation. Die Bindungseigenschaften eines Enzyms können durch Inhibitoren näher charakterisiert werden. Als Inhibitor für His6-TalBF178Y und His6-TalB wurde D-Tagatose-6-Phosphat (D-T6P) getestet. D-T6P ist ein Stereoisomer von D-F6P mit 3S, 4S-Konfiguration. Durch Inkubation von His6-TalBF178Y und His6-TalB mit verschiedenen Konzentrationen D-T6P, wurde His6-TalBF178Y, nicht aber His6-TalB, irreversibel inhibiert. Als Inhibitor für FSA wurde D-GA getestet. Es wurde gezeigt, dass FSA durch D-GA reversibel, nicht-kompetitiv inhibiert wird. Die Inhibitorkonstanten von FSA für D-GA wurden der Kic von 1,63 mM und der Kiu von 35 µM bestimmt. Ein weiterer Schritt sollte dazu führen, dass eine neue His6-TalB-Variante mit veränderter Stereospezifität entsteht, die aus DHA und D,L-GAP nicht D-F6P (3S, 4R) bildet, sondern dessen Stereoisomer D-Tagatose-6-Phosphat (3S, 4S; D-T6P). Aufgrund der Struktur von TalB und einem Modell mit D-F6P wurden zwei Aminosäurereste, Phe178 und Ser226, ausgewählt, die eventuell zu einer Änderung der Aktivität führen könnten. Drei verschiedene Sättigungsmutagenesebanken (TalBF178X, TalBS226X, TalBF178YS226X) wurden auf eine Synthese von D-T6P aus DHA und D-GAP (als D,L-GAP angeboten) mit einem neu entwickelt photometrischen Nachweis im Mikrotitermaßstab untersucht. In keiner der drei Banken wurde bislang eine positive Variante gefunden. Durch fehlerhafte Polymerasekettenreaktion wurden zwei Banken, epTalB und epTalBF178Y, mit niedriger Mutationsfrequenz (~2,3 Nukleotidaustausche/kb) gebildet. Die beiden epBanken könnten auf eine Synthese von D-T6P überprüft werden. Bei dem Screening auf eine Synthese von D-T6P der Sättigungsmutagenesebanken (TalBF178X, TalBS226X, TalBF178YS226X) wurde eine hohe Anzahl falsch-positiver Klone gefunden, deswegen wurde davon abgesehen epTalB und epTalBF178Y mit diesem Screening zu untersuchen. Die Banken stehen nun für neue bereits getestete Selektions- und Screeningmethoden zur Verfügung. In zwei Runden Sättigungsmutagenese konnte TalB so verändert werden, dass erstens D-F6P von TalBF178Y mit einer katalytischen Effizienz gebildet wird wie von FSA (TalBF178Y) und zweitens dass eine Doppelmutante, TalBF178YR181E einen dreimal niedrigeren Km-Wert für D-Glycerinaldehyd besitzt als TalBF178Y. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Aminosäurepositionen Phe178 und Ser226 nicht oder nicht allein an der Bildung von Produkten mit neuer Stereokonfiguration beteiligt sind.

Transaldolase (EC 2.2.1.2) belongs to the enzyme family of transferases and catalyses the formation of a new C-C bond by reversible transfer of a dihydroxyacetone moiety from a donor to an acceptor compound. Concomitantly, a new C-C bond is formed stereospecifically with 3S, 4R configuration. Transaldolases are wide spread and occur in Bacteria, Archaea and Eukarya. Transaldolases are enzymes of the pentose phosphate pathway which utilizes D-sedoheptulose 7-phosphate as donor and transfer a dihydroxyacetone moiety towards D-glyceraldehyde 3-phosphate and two novel products, D-fructose 6-phosphate and D-erythrose 4-phosphate are formed. In biocatalysis enzymes which form a novel C-C bond like for example the aldolases form up to two new stereo centres and are therefore preferable adverse to chemical synthesis. Usually aldolases are strictly donor specific. These enzymes are highly chemo-, stereo-, regio-selective and are active under mild reaction conditions. Aldolases which utilize dihydroxyacetonephosphate (DHAP) as donor compound are used for the synthesis of for example, 13C-labeled sugars, deoxysugars, fluoro sugars, antibiotics, flavour-compounds, azasugars and iminocyclitols. But DHAP possesses some disadvantages, it is unstable, difficult to synthesize and rather expensive. An enzyme which utilizes dihydroxyacetone (DHA) instead of DHAP would be of great interest. Fructose 6-phosphate aldolase (FSA) of E. coli is utilizing DHA amongst other donor compounds. Advantages of FSA are its broad substrate scope and its fast enrichment by heat treatment. Disadvantages of FSA are that some muteins are denatured by heat treatment and that the expression level varies depending on the host strain. Another enzyme of E. coli is Transaldolase B (TalB). TalB forms novel C-C bonds, possesses a rather broad product scope and a high stereo specificity, but is so far not used in biocatalysis. A disadvantage of TalB is the formation of two products (D-sedoheptulose 7-phosphate, D-erythrose 4-phosphate) with an equimolar yield. In the present work, the characterised TalB of E. coli should be changed by mutagenesis towards novel or improved substrate specificities. In a first step, a His6-TalB variant with an improved activity for the formation of D-fructose 6-phosphate (D-F6P) from dihydroxyacetone (DHA) as donor compound and D-glyceraldehyde 3-phosphate (D-GAP) as acceptor compound was engineered by saturation mutagenesis. Thereby the novel His6-TalB muteins would utilise DHA as a donor compound whereas TalB transfers a DHA moiety from a donor compound to an acceptor compound. These TalB muteins would be of interest as a starting point for biocatalysis. To this end, TalB was compared with Fructose 6-phosphate aldolase (FSA). Eleven amino acid positions were chosen for the generation of saturation mutagenesis libraries. These positions are localised in the active site of TalB and differ in both enzymes. Each library was screened for the formation of D-F6P from DHA and D-GAP (offered as D,L-GAP) with a novel colour assay in microtiter scale. In only one of these libraries (TalBF178X), the amino acid exchange from Phe to Tyr (TalBF178Y) led to the desired increase in activity for the formation of D-F6P from DHA and D-GAP [Schneider et al. 2008, JBC 283, p. 30064-30072]. His6-TalBF178Y was purified via Ni-NTA affinity chromatography (purity > 97%) and was characterized. As reference enzymes His6-TalB and FSA were purified. His6-TalBF178Y possesses a transaldolase activity with a Vmax value of 14 U/mg (~16% of the TalB wild type activity) in the transfer reaction. On the other hand His6-TalBF178Y exhibits a 70fold increase in activity for the formation of D-F6P form DHA and D-GAP, compared to the wild type (His6-TalBF178Y: 7 ± 1 U/mg, adverse to the specific activity of His6-TalB: &#8804; 0,1 U/mg) [Schneider et al. 2008, JBC 283, p. 30064-30072]. His6-TalBF178Y possesses a catalytic efficiency similar to FSA (kcat/Km of FSA: 130 M-1 s-1, His6-TalBY: 150 M-1 s-1). The affinity of His6-TalBF178Y for DHA is twice as high as the affinity of FSA (Km-value for DHA of FSA: 62 ± 7 mM, His6-TalBF178Y: 30 ± 4 mM). Furthermore, it was shown that the exchange of the conserved amino acid residue in the human transaldolase (TALDO1, hTal) led to the same change in activity (Vmax value for DHA of hTalF189Y: 14 U/mg; hTal: < 0,1 U/mg). The hTal variants, hTal and hTalF189Y were purified as GST-fusion proteins and the Tag was cleaved off by digestion using Tev-Protease. Like the bacterial transaldolase, hTal and hTalY showed a dimeric structure (77 ± 10 kDa determined via size exclusion chromatography). The hTalF189Y possesses a transaldolase activity with a Vmax for D-F6P of 12 ± 2 U/mg (hTal: 29 U/mg). His6-TalBF178Y and hTalF189Y catalyse also the cleavage of D-F6P into DHA and D-GAP (Vmax for D-F6P: His6-TalBF178Y: 0,36 ± 0,05 U/mg; hTalBF189Y: 0,32 ± 0,04 U/mg). The polyclonal antibody formed against TalB was able to detect the bacterial and the human variants. In a second step, the affinity of His6-TalBF178Y towards D-glyceraldehyde (D-GA) as acceptor was improved. Based on the solved X-ray structure of His6-TalBF178Y (T. Sandalova und Prof. Schneider, Stockholm, Schweden) , three amino acid residues (Arg181, Ser226, Arg228) in the putative phosphate binding site of His6-TalBF178Y were chosen for saturation mutagenesis. The obtained libraries were screened for the formation of D-fructose at low concentrations of the acceptor D-GA (offered as D,L-GA) using a modified colour assay in microtiter scale. The variant exhibiting an exchange from a positively charged amino acid to a negatively charged amino acid at position 181 (His6-TalBF178YR181E) displayed the highest affinity for D,L-GA with Km values of ~ 25 mM for D,L-GA and D-GA compared with His6-TalBF178Y (D,L-GA: > 120 mM; D-GA; 73 mM). His6-TalBF178YR181E has no measurable activity with D-GAP as acceptor and DHA as donor but a residual transaldolase activity of 1 U/mg (~ 1% of the wild type activity). In cooperation with T. Sandalova und Prof. Schneider (Stockholm, Schweden) the crystal structure of His6-TalBF178YR181E could be solved. In the crystal structure of His6-TalBF178YR181E a sulphate ion from the buffer is bound in the active site by Glu181 and Arg228 but at lower occupancy as in His6-TalBF178Y. Presumable the glutamate residue is uncharged or binds at the hydrogensulphate ion. Binding properties of an enzyme can be elucidated by its inhibitors. Therefore D-tagatose 6-phosphate (D-T6P) was tested as an inhibitor for His6-TalBF178Y and His6-TalB. D-T6P is a stereoisomer of D-F6P with a 3S, 4S-configuration. His6-TalBF178Y and His6-TalB was incubated with different concentrations of D-T6P. His6-TalBF178Y was inhibited by D-T6P whereas the activity of the wild type enzyme was not measurably affected. For FSA D-GA was tested as an inhibitor. It could be shown that FSA was reversibly inhibited in a non-competitive manner by D-GA. In another approach, we envisaged to create a novel variant of His6-TalB which is able to form a stereoisomer of D-fructose 6-phosphat (3R, 4S) with a 3S, 4S-configuration (D-tagatose 6-phosphate, D-T6P). Based upon the X-ray structure of TalB and a model of His6-TalB and D-F6P bound to the active site of two amino acid residues (Phe178, Ser226) in His6-TalB were chosen for saturation mutagenesis. Three libraries were generated: two saturation libraries at the positions Phe178 and Ser226 and one library for which the His6-TalBF178Y variant was used as template and position S226 was saturated. These three libraries were screened for the synthesis of D-T6P from DHA and D,L-GAP using a novel photometric assay in microtiter scale. Under the used screening conditions in none of the libraries an active clone was found. By error-prone polymerase chain reaction (epPCR) two libraries of the genes talB and talBF178Y were created with a low mutation rate. The epPCR libraries were generated to screen the encoded enzyme variants for the synthesis of D-T6P from DHA and D,L-GAP. As a consequence of the high number of false positive clones in the T6P screening using the saturation libraries the epPCR libraries were not screened with this screening system. They are available for screening with novel selection and screening methods. In two rounds of saturation mutagenesis talB was mutated firstly towards the formation of D-F6P, the gained mutein TalBF178Y exhibits a catalytic efficiency like FSA, and secondly towards a lower Km-value for D-GA than TalBF178Y. TaLBF178YR181E possess a threefold lower Km-value than TalBF178Y. Further it was shown that the amino acid positions Phe178 and Ser226 are not or not only responsible for the formation of products with novel stereo configurations.