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Authors: Peterburs, Philipp
Title: Duale Regulation von Cofilin durch Proteinkinase D (PKD) vermittelte Phosphorylierung der Phosphatase SSH1L und der LIM-Kinase 2
Other Titles: Dual regulation of cofilin by proteinkinase D dependent phosphorylation of the phosphatase SSH1L and LIM-kinase2
Issue Date: 2011
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-63095
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1921
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1904
Abstract: Das Verständnis von Metastasierung bei Krebserkrankungen ist eine der größten Herausforderungen für die Entwicklung neuer Medikamente. Dies erfordert die Erforschung der Signalwege, die die Organisation des Aktinzytoskeletts sowie Tumorzellmigration und -invasion steuern. In dieser Arbeit konnte die Rolle von Proteinkinase D (PKD) in der Reorganisation des Aktinzytoskeletts und der Zellmigration entschlüsselt werden. Aus vorangegangenen Studien war bekannt, dass PKD die Zellmigration negativ reguliert - höchstwahrscheinlich durch die Kontrolle der Aktinpolymerisations-Maschinerie. Die Substrate von PKD in diesem Prozess waren bisher jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte die Cofilinphosphatase Slingshot 1 Like (SSH1L) als Substrat von PKD identifiziert werden. Cofilin induziert die Aktinpolymerisation durch das Schneiden von F-Aktin Filamenten. Auf diesem Wege werden neue, freie sogenannte stumpfe Enden (“barbed ends”) generiert. Weiterhin steigert Cofilin die Aktindepolymerisation, wodurch der Pool an Aktin-Monomeren erhöht wird. Aus diesen Gründen kann Cofilin als Schlüssel-Regulator in der Zellmigration bezeichnet werden. Die Aktivität von Cofilin ist von seiner Phosphorylierung abhängig: Eine Phosphorylierung durch die LIM-Kinasen 1 und 2 hemmt die Fähigkeit von Cofilin an Aktin zu binden und führt damit zu dessen Inaktivierung. Entsprechend führt eine Dephosphorylierung des Proteins durch SSH- und Chronophinphosphatasen zur Aktivierung. PKD phosphoryliert die Serine 937 und 978 in SSH1L in vitro und in intakten Zellen und induziert dadurch die Bindung von 14-3-3 Proteinen, die die zelluläre Lokalisation von SSH1L regulieren. Auf diesem Weg wird die lokale Aktivität von Cofilin kontrolliert. Ein Verlust der PKD-Expression führt daher zu einer verringerten Phosphorylierung von Cofilin, einer ausgebreiteten Zellmorphologie und einer gesteigerten gerichteten Zellmigration in Abhängigkeit von SSH1L. Darüber hinaus konnte für PKD eine Funktion bei der Regulation von LIMK2 gezeigt werden. PKD phosphoryliert LIMK2 in vitro und in intakten Zellen an Serin 289, was ebenfalls eine Bindung an 14-3-3 Proteinen zur Folge hat. Die Überexpression einer phosphorylierungsdefizienten LIMK2 S289A Variante führt im Vergleich zum wildtypischen Protein zu einem schwächeren Anstieg von phosphoryliertem Cofilin. In Migrationsstudien führte eine Überexpression von LIMK2 zu einer reduzierten Zellmigration während die Überexpression von LIMK2 S289A zu einer gesteigerten Zellmigration im Vergleich zu den Kontrollzellen führte. Diese Ergebnisse lassen auf eine aktivierende Wirkung der Phosphorylierung von LIMK2 an Serin 289 schließen. In dieser Arbeit wurde damit eine duale Funktion von PKD in der Cofilin-abhängigen Zellmigration aufgedeckt: PKD kontrolliert Cofilin-Aktivität über eine negative beziehungsweise positive Regulation von SSH1L und LIMK2.
The understanding of metastasis is one of the main challenges in cancer therapy. Therefore the research on signal transduction pathways, which mediate remodelling of the actin cytoskeleton during cell migration and invasion, is needed. In this work it was possible to identify the role of protein kinase D (PKD) in actin remodelling and cell migration. It is evident from previous studies that PKD negatively regulates cell migration, most likely by regulation of the actin polymerization machinery. However, downstream targets still had to be discovered. During these studies, PKD could be identified as a direct upstream kinase of the cofilin phosphatase slingshot 1 like (SSH1L). Cofilin nucleates actin polymerization by severing actin filaments to generate free barbed ends and also increases the rate of actin depolymerization, thus maintaining a pool of actin monomers. It is therefore evident, that cofilin is a key regulator of actin dynamics. Cofilin activity depends on its phosphorylation state: phosphorylation by the LIM kinase (LIMK) family at serine 3 turns off the actin–binding activity of cofilin and thus leads to inactivation. Accordingly, dephosphorylation by the SSH as well as chronophin phosphatases results in reactivation of the actin binding activity of cofilin. PKD-mediated phosphorylation of serines 937 and 978 regulates SSH1L subcellular localization by binding of 14-3-3 proteins and thus impacts on the control of local cofilin activation and actin remodeling during cell migration. In line with this, the loss of PKD decreases cofilin phosphorylation, induces a more spread cell morphology and stimulates chemotactic migration of breast cancer cells in a SSHL1-dependent fashion. Furthermore, it could be demonstrated that the cofilin kinase LIMK2 is a novel PKD substrate in vitro and in vivo. PKD-mediated phosphorylation of serine 289 mediates binding of 14-3-3 proteins to LIMK2. Expression of a phosphorylation deficient LIMK2 S289A mutant increased cell migration and reduced the level of phosphorylated cofilin compared to the wild type LIMK2 protein. Thus, PKD-mediated phosphorylation of serine 289 most likely has a positive impact on LIMK2 activity. Finally, to further characterize the phosphorylation of serine 289 in LIMK2 a phospho-specific antibody was generated. Taken together, these results identify PKD as a central regulator of the cofilin signaling network and thus directed cell migration by negative and positive regulation of SSH1L and LIMK2, respectively.
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