Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-2019
Authors: Eisler, Stephan Alexander
Title: Entwicklung von molekularen Werkzeugen zur Untersuchung einer Funktion der Proteinkinase D in der Organisation des Golgi Komplexes
Other Titles: Development of molecular tools to explore a function of protein kinase D in Golgi complex organization
Issue Date: 2012
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-77893
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/2036
http://dx.doi.org/10.18419/opus-2019
metadata.ubs.bemerkung.extern: Enthält englischsprachige Publikationsmanuskripte.
Abstract: Die Proteinkinase D (PKD) Familie der Serin/Threonin Kinasen umfasst in Säugerzellen drei Mitglieder: PKD1, PKD2 und PKD3. PKDs werden downstream von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) als Effektoren von Diacylglycerol (DAG) aktiviert. Sie sind an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, wie z.B. Zellmotilität, Überleben der Zelle bei oxidativem Stress und Aktivität von Transkriptionsfaktoren beteiligt. Am besten beschrieben ist die Funktion am Golgi Komplex. Hier kontrolliert PKD am Trans-Golgi Netzwerk (TGN) die Abschnürung von Transportvesikeln. Der Aktivierungsstatus von PKD ist stets streng reguliert und die jeweilige Funktion eng mit der subzellulären Lokalisierung verknüpft. Genetisch codierte, Fluoreszenz-basierte Kinaseaktivitätsreporter sind wichtige molekulare Werkzeuge, um die räumliche und zeitliche Veränderung von Kinaseaktivität auf subzellulärer Ebene zu beobachten und somit die Antwort der Kinase auf Veränderungen der physiologischen Umgebung zu erfassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei dieser Reporter, die spezifisch für die Messung von PKD-Aktivität am Golgi Komplex eingesetzt werden können, entwickelt. Bei beiden Reportern wird die PKD-Aktivität über den Phosphorylierungsstatus der PKD-Substratsequenz von Phosphatidylinositol-4 Kinase IIIβ (PI4KIIIβ) visualisiert. Der erste Reporter, G-PKDrep wurde für Aktivitätsmessungen in fixierten Zellen entwickelt, wobei der Phosphorylierungsgrad der Substratsequenz mit einem phosphospezifischen Antikörper quantifiziert wird. Mit G-PKDrep-live wurde G-PKDrep zu einem FRET-basierten Reporter weiterentwickelt, mit dem PKD-Aktivität am Golgi Komplex in lebenden Zellen über die Zeit gemessen werden kann. Mit Hilfe von G-PKDrep konnte unter Verwendung der Mikrotubuli-zerstörenden Substanz Nocodazol eine Funktion von PKD in der Organisation des Golgi Komplex aufgezeigt werden. Hierbei wurde gezeigt, dass die durch Mikrotubuli-Verlust hervorgerufene Golgi-Fragmentierung abhängig von PKD-Aktivität ist. Zur Aufklärung der zugrunde liegenden Signalwege dieses Prozesses wurde eine globale SILAC-basierte Phosphoproteom-Studie durchgeführt. Durch Expression einer kinasetoten PKD wurden dabei 124 PKD-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert, die unter Nocodazolbedingungen signifikant herabreguliert waren. Dabei wurden viele PKD-Zielsequenzen in Golgi-residenten Proteinen, z.B. Mitglieder des IGF2-Rezeptor Netzwerks, identifiziert. Zudem zeigte sich, dass PKD nach Nocodazolstimulation den MAP-Kinase Signalweg aktiviert, dessen downstream Effektoren zu Beginn der Mitose die Golgi-Fragmentierung initiieren. Im Zellzyklus fragmentiert der Golgi Apparat beginnend in der G2-Phase in einem sequenziellen Prozess, wobei die anfängliche Spaltung des Golgi-Bandes in einzelne Golgi-Stapel essenziell für den Eintritt der Zelle in die Mitose ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Trennung der Golgi-Stapel PKD-abhängig ist und dass PKD somit eine Funktion beim Eintritt der Zelle in die Mitose hat. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass PKD bei diesem Prozess upstream vom MAP-Kinase Signalweg agiert. Zusammengefasst konnte mit Hilfe der in dieser Arbeit entwickelten und etablierten molekularen Werkzeuge eine bisher unbekannte Funktion von PKD in der Organisation des Golgi Komplex beschrieben werden.
The protein kinase D (PKD) family of serine/threonine kinases comprises three members in mammalian cells, PKD1, PKD2 and PKD3. PKDs get activated downstream of GPCR activation, dependent on PKCs and DAG. They are involved in various cellular functions such as cell motility, oxidative stress response or regulation of transcription factor activity. At the TGN, PKD controls the fission of transport carriers, which are destined for the plasma membrane. Importantly, the cellular function of PKD is strictly associated with its subcellular localization and PKD´s activation state is tightly regulated. Genetically encoded, fluorescent kinase activity reporters are important molecular tools to track spatiotemporal changes on kinase activity on a subcellular level. Within this work, two different PKD-specific kinase activity reporters targeted to Golgi complex were developed. Both constructs report changes in PKD activity via the phosphorylation state of the PKD-specific substrate sequence of PI4KIIIβ. The first reporter, G-PKDrep was designed to measure PKD activity in fixed cells. Here, reporter phosphorylation was visualized and quantified using a phosphospecific antibody. In contrast, the newly developed G-PKDrep-live is based on FRET and thus allows tracking PKD activity at the TGN in living cells over the time. Using G-PKDrep and the microtubule-disrupting agent nocodazole, a function of PKD in Golgi maintenance was discovered. Specifically, it was shown that nocodazole-induced Golgi fragmentation was dependent on PKD activity. To elucidate the underlying signaling pathways in this process a global quantitative SILAC-based phosphoproteomic analysis was performed. In this screen, 124 PKD-dependent phosphorylation sites, which were significantly downregulated in nocodazole-treated cells expressing a kinase-dead PKD mutant, were detected. Among these PKD-dependent phosphorylation sites predominantly Golgi-resident proteins such as members of the IGF2 receptor network were present. Furthermore, it could be shown that members of the MAP kinase pathway were activated upon nocodazole stimulation in a PKD-dependent manner. Of note, MAPK downstream effectors cause Golgi dispersal in G2 phase of the cell cycle. Golgi ribbon cleavage into isolated Golgi stacks is essential for mitotic entry. In this work it could be shown that cleavage of the non-compact zones of the Golgi ribbon is dependent on PKD activity, which implicates a function for PKD in mitotic entry. Furthermore, it could be shown that PKD acts in this process upstream of the MAP kinase pathway. Taken together, the molecular tools developed and established in this work contributed to identify a critical role of PKD in Golgi complex function and maintenance.
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