Steigerung der Nitril-Hydratase-Aktivität der Nitrilase aus Pseudomonas fluorescens EBC191

Abstract

Chirale 2-Hydroxycarbonsäuren und 2-Hydroxycarboxamide sind wichtige Syntheseprodukte in der organischen Chemie. Die enzymatische Synthese von optisch aktiven 2-Hydroxycarboxamiden und 2-Hydroxycarbonsäuren kann prinzipiell aus optisch aktiven Cyanhydrinen (2-Hydroxynitrilen) unter Verwendung von Nitril-Hydratasen oder Nitrilasen erfolgen. Die praktische Anwendung von Nitril-Hydratasen in der Synthese der 2-Hydroxycarboxamide wird durch Probleme bei der rekombinanten Expression, der Substratspezifität und der Cyanid-Sensitivität vieler Nitril-Hydratasen limitiert. Die beschriebenen Probleme könnten möglicherweise durch den Einsatz von Nitrilasen umgangen werden, da viele Nitrilasen neben ihren Hauptprodukten (den korrespondierenden Carbonsäuren) auch die entsprechenden Amide als Nebenprodukte bilden. Die Nitrilase aus dem Bakterium Pseudomonas fluorescens EBC191 setzt eine Vielzahl an 2-substituierten Nitrilen zu Produktgemischen mit unterschiedlichen Säure/Amid-Verhältnissen um und weist in einigen Fällen eine signifikante Nitril-Hydratase-Aktivität auf. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit diese Nitrilase mit den Methoden des Protein Engineering dahingehend modifiziert, dass sie Nitrile primär zu Amiden umsetzte. Es wurden hierbei Strategien des rationalen Protein-Designs und der gerichteten Evolution eingesetzt. Aus vorangegangenen Arbeiten waren Nitrilasevarianten bekannt, die nach Deletionen des C-terminalen Bereichs oder durch unterschiedliche Aminosäure-Austausche in der Nähe des katalytischen Zentrums erhöhte Nitril-Hydratase-Aktivitäten aufwiesen. Hierbei waren Enzymvarianten gefunden worden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 50% Mandelamid bildeten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Enzymvarianten erzeugt, die diese Mutationen in verschiedenen Kombinationen enthielten. Hierbei konnte ein kumulativer Effekt beobachtet und Enzymvarianten generiert werden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 70% Mandelamid produzierten. Im Rahmen der gerichteten Evolution der Nitrilase aus P. fluorescens EBC191 wurde mit Hilfe einer fehlerbehafteten PCR eine Bibliothek des modifizierten Nitrilasegens erzeugt. Ein Screening-Verfahren wurde entwickelt und optimiert, dass es ermöglichte, gesteigerte Nitril-Hydratase-Aktivitäten der Enzymvarianten in Kolonien rekombinanter Zellen über die chromogene Bildung von Fe(III)-Hydroxamat-Komplexen zu identifizieren. Die Screening-Methode basierte auf der Acyltransferase-Aktivität einer Amidase, die daher gemeinsam mit einzelnen Nitrilasevarianten in E. coli-Zellen exprimiert werden musste. Es wurden ca. 4200 Klone mit Hilfe des Screening-Verfahrens untersucht. Bei 30 Klonen zeigte die Intensität des gebildeten Fe(III)-Hydroxamat-Komplexes an, dass diese Klone Enzymvarianten mit signifikant höheren Nitril-Hydratase-Aktivitäten als der Wildtyp enthielten. Anschließend wurde der Umsatz von (R,S)-Mandelonitril durch diese Klone mit Hilfe der HPLC analysiert. Hierbei wurden Enzymvarianten gefunden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 90% Mandelamid bildeten. Dies bedeutete im Vergleich zum Wildtyp eine annähernd 5-fache Steigerung der Nitril-Hydratase-Aktivität. Die Nitrilase-Gene der im Rahmen der Zufallsmutagenese erhaltenen positiven Mutanten wurden sequenziert und eine Reihe von Aminosäure-Austauschen identifiziert, die zu einer erhöhten Amidbildung führten und die noch nicht aus den früheren Arbeiten bekannt waren. Hierbei wurde gezeigt, dass insbesondere der Austausch eines Tryptophan-Rests in der Position 188 der Nitrilase zu Enzymvarianten mit sehr hohen Nitril-Hydratase-Aktivitäten führte. Nach einer Sättigungsmutagenese an dieser Position wurden Enzymvarianten erhalten, die ca. 94% Mandelamid im Produktgemisch aufwiesen. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit gelang es somit, eine beinahe vollständige funktionelle Umwandlung der Nitrilase aus P. fluorescens EBC191 in eine Nitril-Hydratase zu erreichen. Die so erhaltenen Nitrilasevarianten wurden in enzymatischen Kaskadenreaktionen zur Synthese von optisch aktiven 2-Hydroxycarboxamiden eingesetzt. Hierzu wurden rekombinante E. coli Ganzzell-Katalysatoren konstruiert, die eine Nitrilasevariante mit gesteigerter Nitril-Hydratase-Aktivität zusammen mit einer (S)-spezifischen Oxynitrilase aus der Cassava-Pflanze (Manihot esculenta) oder einer (R)-spezifischen Oxynitrilase aus der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) co-exprimierten. Die so erhaltenen Ganzzell-Katalysatoren setzten in wässrigen schwach sauren Puffer-Lösungen Benzaldehyd und Cyanid zu (S)- oder (R)-Mandelamid um. Hierbei wurden mit beiden "bienzymatischen" Ganzzell-Katalysatoren hohe Produktausbeuten und Enantiomerenüberschüsse > 90% erzielt. Die so erzeugten Ganzzell-Katalysatoren stellen eine synthetisch interessante Möglichkeit zur Herstellung verschiedenster optisch aktiver 2-Hydroxycarboxamide dar.

Chiral 2-hydroxycarboxylic acids and 2-hydroxycarboxylic amides are important building blocks in organic chemistry and serve as precursors for the synthesis of a wide range of chiral compounds. Optically active 2-hydroxycarboxylic acids and 2-hydroxycarboxylic amides can be synthesized enzymatically from optically active cyanhydrin (2-hydroxynitriles) using nitrile hydratases or nitrilases. The general applicability of nitrile hydratases for the synthesis of 2-hydroxycarboxylic amides is limited by substrate specificity, cyanide sensitivity and difficulties in the heterologous expression of these enzymes. These obstacles could be potentially avoided using nitrilases, because many nitrilases produce in addition to the carboxylic acids (as main product) the corresponding amides as by-products. The nitrilase from the bacterium Pseudomonas fluorescens EBC191 converts many 2-substituted nitriles to product mixtures with different acid/amide ratios and exhibits with certain substrates a significant nitrile hydratase activity. In the course of the present work the nitrilase from P. fluorescens EBC191 was modified by rational design and directed evolution in order to obtain enzyme variants which convert nitriles preferentially to amides. From previous work nitrilase variants were known which showed increased nitrile hydratase activities after the deletions of parts from C-terminal region or after amino acid exchanges close to the catalytic active residues. Some of these enzyme variants formed from (R,S)-mandelonitrile up to 50% mandeloamide. In the present work, new enzyme variants were generated by combining the previously obtained mutations. Thus, a cumulative effect was observed and enzyme variants were found, which formed up to 70% mandeloamide from (R,S)-mandelonitrile. In a directed evolution approach the nitrilase gene was modified by using error prone PCR and thus, a library of the nitrilase gene was generated which encoded for diverse nitrilase variants. A screening method was developed and optimized for identification of enzyme variants with increased nitrile hydratase activities in colonies of recombinant E. coli cells due to the formation of a chromogenic Fe(III)-hydroxamate complex. The screening method was based on the acyltransferase activity of an amidase. Therefore, a genetic system was established which allowed the simultaneous expression of an amidase with the acyltransferase activity together with each modified nitrilase variants in cells of E. coli. About 4200 clones were analysed by the established screening method. Thirty clones showed an increased intensity of the Fe(III)-hydroxamate complex formed, which indicated, that the clones contained enzyme variants with significant higher nitrile hydratase activities than the wild type. Subsequently, the conversion of (R,S)-mandelonitrile by the recombinant E. coli clones was analysed by HPLC. Thus, enzyme variants were found which formed up to 90% mandeloamide from (R,S)-mandelonitrile. This represented an almost 5-fold increase of the nitrile hydratase activity compared to the wild type. The genes coding for interesting enzyme variants were sequenced and the amino acid exchanges were identified, which were responsible for the observed increase of the nitrile hydratase activity. Thus, several amino acid exchanges were identified which were not known from earlier work. It was shown that the exchange of a tryptophan residue at the position 188 in the nitrilase created enzyme variants with high nitrile hydratase activities. Therefore, a saturation mutagenesis was performed at the position 188. Thus, enzyme variants were obtained, which formed up to 94% mandeloamide from mandelonitrile. These results demonstrated an almost complete transformation of the reaction specificity of the nitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191 from a nitrilase to a nitrile hydratase. The new enzyme variants with high nitrile hydratase activities were used in enzymatic cascade reactions for the synthesis of optically active 2-hydroxycarboxylic amides. Therefore, a nitrilase variant with an increased nitrile hydratase activity was expressed in E. coli together with the (S)-selective oxynitrilase (hydroxynitrile lyase) from Manihot esculenta or the (R)-selective oxynitrilase from Arabidopsis thaliana. The E. coli whole-cell catalysts constructed in this way catalysed the transformation of benzaldehyde and cyanide in moderate acidic aqueous media to (S)- or (R)-madeloamide with a good yield and enantiomeric excess > 90%. These "bienzymatic" E. coli whole-cell catalysts can be applied in principle for the synthesis of a wide range of optically active 2-hydroxycarboxylic amides.