Combinations of costimulatory antibody-ligand fusion proteins for targeted cancer immunotherapy

Abstract

Combinatorial strategies are of emerging interest in cancer immunotherapy. Costimulation by individual members of the Ig- or TNF-superfamily have already revealed promising antitumor potential, thus prompting the exploration of their synergistic abilities in combinatorial approaches. Here, in order to avoid systemic side effects, costimulation was restricted to the tumor site by pursuing a targeted strategy with antibody-ligand fusion proteins composed of tumor antigen-directed antibodies and the extracellular domain of the costimulatory ligands B7 or 4-1BBL, respectively. Costimulatory activity was assessed in an experimental model system where tumor cells coexpressed the antigens fibroblast activation protein (FAP) and endoglin (EDG) and initial MHC-independent T cell activation and tumor-targeting was mediated by a bispecific antibody (scDbFAPxCD3). Combined costimulation with B7- and 4-1BBL-fusion proteins (B7-DbFAP, scFvEDG-4-1BBL) was shown to be superior to the individual effects in terms of cytokine release (IL-2/IFN-γ), proliferation and activation marker expression (CD25), leading to a T cell population with enhanced levels of an activation-experienced memory phenotype and with a higher capability for target cell killing. Furthermore, the model system was adapted for a time-shift costimulation setting. Here, enhanced T cell proliferation and granzyme B expression as well as reduced levels of PD-1 expression demonstrated the benefit of B7.1- and 4-1BBL-costimulation-assisted restimulation. Consequently, the antitumor activity of this combinatorial setting was confirmed in vivo in a lung metastasis mouse model. Finally, the combinatorial spectrum was expanded by the generation and subsequent incorporation of antibody-fusion proteins comprising the extracellular domains of the TNF-superfamily ligands Ox40L, LIGHT or GITRL. Here, advantages of combined costimulation with either B7.1- or 4-1BBL- fusion proteins were shown in terms of T cell proliferation and IFN-γ release. In summary, combinatorial approaches with tumor-directed costimulatory ligands in form of antibody-ligand fusion proteins were shown to be feasible, revealing a great potential for the modulation and enhancement of a T cell response. Thus, they appear to be a promising strategy in cancer immunotherapy that should be considered for further investigation.

Im Rahmen der Tumoimmuntherapie gewinnen kombinatorische Strategien zunehmend an Bedeutung. Da für Kostimulation durch einzelne Mitgliedern der Ig- oder TNF-Superfamilie bereits ein vielversprechendes antitumorales Potential nachgewiesen werden konnte, sollten in dieser Arbeit auch deren synergistische Fähigkeiten in kombinatorischen Ansätzen ausgetestet werden. Um hierbei systemische Nebenwirkungen zu vermeiden, wurde die Kostimulation mittels einer „Targeting-Strategie“ auf den Tumor begrenzt. Dafür wurden Antikörper-Ligand-Fusionsproteine eingesetzt, die aus einer Tumorantigen-spezifischen Antikörperkomponente und der extrazellulären Domäne kostimulatorischer Liganden (B7 oder 4-1BBL) bestanden. Für die Untersuchung der kostimulatorischen Aktivität der Fusionsproteine wurde ein experimentelles Setting etabliert, in dem Tumorzellen die Antigene Fibroblast Activation Protein (FAP) und Endoglin (EDG) koexprimierten und die initiale, MHC-unabhängige T-Zell-Aktivierung und das Tumor-Targeting über einen bispezifischen Antikörper (scDbFAPxCD3) erfolgte. Der kombinierte Einsatz von B7- und 4-1BBL-Fusionsproteinen war der Kostimulation mit nur einem Fusionsprotein deutlich überlegen, was für Zytokinausschüttung (IL-2, IFN-γ), Proliferation und Aktivitätsmarker-Expression (CD25) gezeigt werden konnte. Zudem führte die Kombination zu einer T-Zell-Population, die sowohl einen größeren Anteil eines aktivierungserfahrenen Gedächtnis-Phenotyps als auch ein höheres Potential für das Töten der Targetzellen aufwies. Das Modellsystem wurde auch hinsichtlich einer zeitversetzten Kostimulation analysiert. Hierbei erwies sich die gemeinsame Kostimulation mit B7.1- und 4-1BBL-Fusionsproteinen während der scDb-Restimulationsphase als das vorteilhafteste Setting, bei dem sowohl eine verstärkte T-Zell-Proliferation und Granzym B-Expression, als auch eine erniedrigte PD-1-Expression zu beobachten war. Die antitumorale Wirksamkeit dieses Settings wurde auch in vivo in einem Lungenmetastasen-Mausmodell bestätigt. Darüber hinaus wurde das kombinatorische Spektrum durch neue Fusionsproteine, bestehend aus der extrazellulären Domäne der TNF-Superfamilie-Liganden Ox40L, LIGHT und GITRL, erweitert. Dabei konnten die Vorteile einer kombinierten Kostimulation mit B7.1- als auch mit 4-BBL-Fusionsproteinen in Bezug auf T-Zell-Proliferation und IFN-γ-Ausschüttung nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde die Einsetzbarkeit und das Potential kombinatorischer Ansätze bestehend aus tumor-gerichteten kostimulatorischen Liganden in Form von Antikörper-Fusionsproteinen gezeigt. Für die Krebsimmuntherapie erscheinen sie als eine vielversprechende Strategie, die weiter verfolgt werden sollte.