Regulation of endocytic membrane trafficking by the GTPase-activating protein Deleted in Liver Cancer 3 (DLC3)

Abstract

Small GTPases of the Rho family are key regulators of the actin and microtubule cytoskeleton, whereby many cellular functions including cell migration, adhesion and polarity, as well as cell cycle progression are controlled. Increasing evidence suggests that Rho proteins are also critically involved in the regulation of membrane trafficking pathways within exocytosis and endocytosis. Although the molecular mechanisms are not well understood, Rho GTPases apparently have to govern and finely tune cytoskeletal remodeling, in order to support the formation, fusion and motility of transport carriers. However, the identity of their regulators, the guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs) that ensure the balanced GTPase activation in space and time is largely elusive. The ‘Deleted in Liver Cancer’ (DLC1/2/3) proteins are a structurally conserved subfamily of RhoGAP proteins that act as negative regulators of Rho GTPases. In addition to the catalytically active GAP domain, all DLC proteins contain a sterile alpha motif (SAM) and steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer (START) domain. Expression of the best studied member, DLC1, is frequently lost in various types of human cancers and a tumor suppressive function associated with its RhoGAP activity has been established in vivo. Although DLC3 was also observed to be downregulated in several cancer cell lines and primary tumors, the cellular functions of DLC3 are still poorly characterized. So far, GAP activity for RhoA has only been demonstrated in vitro and, associated with its localization at cell-cell contacts, a Rho-regulatory role in adherens junction stability was described. Thus, the aims of this thesis were to further investigate the subcellular localization of DLC3 and to shed light on the role of DLC3 in the regulation of Rho-mediated cellular processes, in particular endocytic membrane trafficking. This study provides convincing evidence that DLC3 is a functional, Rho-specific GAP protein in living cells and that its loss enhances perinuclear RhoA activity. DLC3 is recruited to Rab8-positive membrane tubules and required for the integrity of the Rab8 and Golgi compartments. Depletion of DLC3 impairs the transport of internalized transferrin to the endocytic recycling compartment, which is restored by the simultaneous downregulation of RhoA and RhoB. As a consequence, DLC3 loss interferes with epidermal growth factor receptor (EGFR) degradation and causes prolonged receptor signaling. Furthermore, it was found that DLC3-depleted cells show reduced surface N-cadherin levels, leading to decreased cell aggregation. Together, these findings identify DLC3 as a novel component of the endocytic trafficking machinery, wherein it maintains organelle integrity and regulates membrane transport via the control of local Rho activity.

Die kleinen GTPasen der Rho-Familie sind Schlüsselregulatoren des Aktin- und Mikrotubulizytoskeletts, wodurch sie viele zelluläre Funktionen, wie z.B. Zellmigration, Zelladhäsion und -polarität, sowie den Zell-Zyklus-Verlauf kontrollieren. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Rho-Proteine ebenso kritisch in die Regulation von Membrantransportwegen innerhalb der Exozytose und Endozytose eingreifen. Obwohl die molekularen Mechanismen nicht gut verstanden sind, ist offensichtlich, dass Rho-GTPasen zelluläre Remodellierungen des Zytoskeletts steuern und fein regulieren müssen, um die Bildung, Fusion und Motilität von Membrantransportern zu unterstützen. Die Identität der GDP/GTP-Austauschfaktoren (GEFs) und GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs), welche das Gleichgewicht von Rho-Aktivierung und -Inhibition in Raum und Zeit gewährleisten, ist weitgehend unbekannt. Die „Deleted in Liver Cancer“ (DLC1/2/3) Proteine bilden eine strukturell konservierte Unterfamilie der RhoGAP-Proteine, welche als negative Regulatoren der Rho-GTPasen wirken. Neben der katalytisch aktiven GAP-Domäne, besitzen alle DLC-Proteine eine SAM (sterile alpha motif)- und eine START (steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer)-Domäne. Der Expressionsverlust des am besten untersuchten Mitglieds, DLC1, wurde in einer Vielzahl humaner Krebsarten gefunden und die GAP-vermittelte Tumorsuppressorfunktion konnte durch in vivo Studien nachgewiesen werden. Obwohl auch DLC3 in mehreren Krebszelllinien und Primärtumoren herunterreguliert ist, sind dessen zelluläre Funktionen kaum beschrieben. So wurde die GAP-Aktivität für RhoA bisher nur in vitro gezeigt. Verbunden mit der Lokalisation an Zell-Zellkontakten, wurde für DLC3 eine Rho-regulatorische Rolle in der Stabilität von Zell-Zellkontakten beschrieben. Die Ziele dieser Arbeit waren daher die subzelluläre Lokalisation von DLC3 im Detail zu untersuchen und die Rolle von DLC3 in der Regulation von Rho-vermittelten, zellulären Prozessen, vor allem im Hinblick auf den endozytotischen Membrantransport, aufzuklären. Diese Arbeit liefert überzeugende Beweise dafür, dass DLC3 als funktionelles Rho-spezifisches, GAP-Protein in der Zelle agiert und dass dessen Verlust zu einer Erhöhung der perinuklären RhoA-Aktivität führt. DLC3 wird an Rab8-positive Membrantubuli rekrutiert und dafür benötigt, die Integrität des Rab8- und Golgi-Kompartiments aufrecht zu erhalten. Depletion von DLC3 stört den Transport von internalisiertem Transferrin hin zum endozytischen Recycling-Kompartiment, was durch die gleichzeitige Depletion von RhoA und RhoB wieder hergestellt werden kann. Als weitere Konsequenz des DLC3-Verlustes, wird der Abbau des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors verzögert und eine verlängerte Rezeptor-Signaltransduktion hervorgerufen. Außerdem wurde gefunden, dass DLC3-depletierte Zellen verringerte N-Cadherin-Mengen auf der Zelloberfläche zeigen, was wiederum zu einer geschwächten Zellaggregation führt. Zusammengenommen identifizieren diese Ergebnisse DLC3 als eine neue Komponente innerhalb der endozytotischen Transportmaschinerie, in welcher es die Integrität der Organellen aufrecht erhält und den Membrantransport über die lokale Regulation der Rho-Aktivität kontrolliert.