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Autor(en): Kirtz, Marko
Titel: Biotechnologische Herstellung von Octan- und 8-Hydroxyoctansäure mit Escherichia coli
Sonstige Titel: Biotechnological production of octanoic and 8-hydroxyoctanoic acid with Escherichia coli
Erscheinungsdatum: 2016
Dokumentart: Dissertation
Seiten: 184
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-ds-89145
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/8914
http://dx.doi.org/10.18419/opus-8897
Zusammenfassung: In den letzten 20 Jahren rückt die Entwicklung biotechnologischer Prozesse zur Produktion von Diesel- und Benzinersatzstoffen immer mehr in den Fokus von Forschung und öffentlichem Interesse. Durch die Verknappung der Erdölressourcen[1], die negativen Auswirkungen der extensiven Nutzung dieser Ressourcen auf die Umwelt und nicht zuletzt das stetig wachsende Umweltbewusstsein der Bevölkerung in Industrieländern, wurden Prozesse gefordert, die auf regenerierbaren Ressourcen basieren, somit den permanent in Richtung Atmosphäre gerichteten CO2-Fluss eingrenzen und zudem die Kostenexplosion für Kraftstoffe eindämmen. Jedoch ist nicht nur der weltweite Transportsektor von Erdöl und seinen weiterverarbeiteten Produkten abhängig, auch die produzierende chemische Industrie bezieht einen Großteil ihrer Grundstoffe aus dem „schwarzen Gold“[2,3,4,5]. Hier gilt es, effektive alternative Prozesse zu entwickeln, die zum Großziel einer „grünen Chemie“ beitragen und von der Abhängigkeit von Erdöl losgelöst sind. Diese Arbeit hatte das Ziel durch die Realisierung eines mikrobiellen Produktionsprozesses von mittelkettigen Fett- und ω-Hydroxyfettsäuren einen Beitrag zum Ziel der sog. „grünen Chemie“ zu leisten. Die wirtschaftliche und damit einhergehend umweltschutztechnische Relevanz von Fettsäuren und ihren terminal hydroxylierten Derivaten spiegelt sich in der großen Vielfalt an Produkten, deren Grundbausteine sie bilden, wider. Zum Einsatz kam hier das Bakterium Escherichia coli, für welches bereits in vergangenen Studien Strategien entwickelt worden waren, um beispielsweise (Hemi-)Cellulosen für den Aufbau von eigener Biomasse verwerten zu können[6]. Daher ist es für einen Ansatz, der auf regenerierbaren Ressourcen beruhen soll, bestens geeignet. Um mit diesem Bakterium in einem Produktionsprozess Fettsäuren zu generieren, musste seine native Fettsäurebiosynthese zu einer Überproduktion der gewünschten Fettsäure angeregt werden. Dazu wurde die pflanzliche Thioesterase FatB2 aus Cuphea hookeriana[7] in einer β-oxidationsdefizienten Zelle überexprimiert, um sowohl die Fettsäuresynthese zu deregulieren als auch gleichzeitig die Länge des Produktes zu bestimmen. Nach einer N-terminalen Fusion des Enzyms mit dem Thioredoxin-1-Anhang trxA und einigen Optimierungen des Produktionsprozesses, konnten mit diesem System in 24 h etwa 330 mg/L der für die Zellen toxischen Fettsäure Octansäure in einem Bioreaktor-fed batch-Verfahren hergestellt werden. Um aus dieser Fettsäure ihr ω-hydroxyliertes Derivat zu formen, wurde in den Produktionsstamm zusätzlich ein Monooxygenase-Fusionsprotein eingebracht, das bereits aus früheren Arbeiten des ITBs hervorging[8,9]. Das Fusionsprotein von CYP153A aus Marinobacter aquaeolei mit der Reduktasedomäne CPR von CYP102A1 aus Bacillus megaterium ist in der Lage sich selbst mit Reduktionsäquivalenten zu versorgen ohne dabei auf die Hilfe einer zusätzlichen Reduktase angewiesen zu sein. Die in dieser Arbeit verwendete Mutante G307A ist zudem gegenüber Octansäure um das 20-fache aktiver als es die Wildtypform ist[9]. Diese Enzymmutante wurde in vier unterschiedlichen Ansätzen mit dem octansäureproduzierenden Bakterienstamm kombiniert. So konnte letztlich in einem Einzellsystem mit paralleler Expression der Thioesterase sowie der Monooxygenase in 20 h ein 8-Hydroxyoctansäure-Titer von etwa 230 µM erreicht werden, was umgerechnet 40 mg/L entspricht. Nachdem der erfolgreiche konzeptionelle Beweis für dieses Produktionssystem erbracht war, sollte ein ungerichtetes Mutageneseverfahren angewendet werden, um die Möglichkeit das Endprodukt nach Wunsch in seiner Länge variieren zu können, zu erhalten. Das Verfahren sollte gentechnisch veränderte Thioesterase-Varianten generieren, die verglichen zum eingesetzten Wildtypenzym eine erhöhte Aktivität gegen kürzere oder längere Fettsäuren als Octansäure aufwiesen. Für ein hierzu benötigtes high throughput screening-Verfahren sollten im Rahmen dieser Arbeit die Grundlagen erarbeitet werden. Getestet wurden dabei verschiedene Methoden des screenings sowohl auf Agarplatten und in Flüssigmedium, so beispielsweise die extrazelluläre Präsentation des Enzyms auf Hefezelloberflächen[10], als auch die Möglichkeit eines screenings mittels aufgereinigtem Enzym.
Enthalten in den Sammlungen:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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