Enzyme, Gene und Mechanismen des oberen Abbauweges von Pikrinsäure und 2,4-Dinitrophenol durch Nocardioides simplex FJ2-1A

Abstract

Der Bakterienstamm Nocardioides simplex FJ2-1A baut 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP) und Pikrinsäure unter aeroben Bedingungen vollständig ab. Hydrid wird auf den aromatischen Ring des Nitroaromaten übertragen. Dabei entsteht der jeweilige Hydrid-Meisenheimer-Komplex als Produkt. Diese initiale Reduktion wird von einem Enzymsystem katalysiert. Koenzym F420, welches als methanogener Kofaktor bekannt ist, wurde als Mediator der Hydridübertragung identifiziert. Von NADPH wird Hydrid mittels einer NADPH-abhängigen F420-Reduktase auf Koenzym F420 übertragen. Der sich anschließende Hydridtransfer auf das aromatische System des Nitroaromaten wird durch eine Hydridtransferase katalysiert. Die N-terminalen Sequenzen der Proteine dienten zur Ableitung von Oligonukleotiden für die Herstellung einer Sonde mittels PCR. Ein 7.2 kb großes DNA Fragment, das die Gene der beiden Enzyme beinhaltet, wurde isoliert und sequenziert. Bei Datenbankvergleichen zeigt die F420-Reduktase Ähnlichkeiten zu F420-abhängigen NADP+-Reduktasen aus Archaea und Streptomyceten. Die Hydridtransferase ist N5,N10-Methylen-tetrahydromethanopterin-Reduktasen ähnlich. Der Dihydrid-Komplex von Pikrat wurde als Produkt einer zweifachen Hydridübertragung auf das aromatische Ringsystem von Pikrat durch das Enzymsystem identifiziert. Der Dihydrid Komplex des Pikrats wurde 1H- und 13C-NMR spektroskopisch untersucht. Er wird enzymatisch unter Elimination von Nitrit und der Bildung des Hydrid-Meisenheimer-Komplexes von 2,4-DNP umgesetzt. Die nitriteliminierende Aktivität wurde mit FPLC angereichert. Als Produkt der Reduktion von 2,4-DNP durch das Hydrid übertragende Enzymsystem entsteht der korrespondierende Hydrid-Meisenheimer-Komplex. Als Folge dieser Untersuchungen ergibt sich für Nocardioides simplex FJ2-1A ein konvergenter Abbauweg von Pikrat und 2,4-DNP.

Nocardioides simplex FJ2-1A isolated from industrial waste water mineralizes picrate and 2,4-dinitrophenol aerobically. Hydride is transferred to the aromatic ring system of the nitroaromatic compounds by a two-component enzyme system. The reaction products are the corresponding hydride-Meisenheimer complexes. Cofactor F420 was identified as a mediator for the hydride transferring process. Hydride is funneled from NADPH as hydride donor by a NADPH-dependent F420-reductase to coenzyme F420 and transferred to the aromatic system of the nitro compound by a hydride transferase. N-terminal sequences of the enzymes were determined and oligonucleotides for synthesis of probes with PCR were deduced. A 7.2 kb DNA fragment containing the corresponding structural genes was detected and cloned. The F420-reductase is similar to F420-dependent NADP+-reductases of archaea and Streptomyces species when compared to databases. The hydride transferase shows homologies to N5,N10-methylene-tetrahydromethanopterin-reductases. A dihydride complex of picrate was identified as product of a twofold hydride transfer to the aromatic ring system catalysed by the enzyme system. The dihydride complex was investigated by 1H- and 13C-NMR. It is transformed enzymatically under nitrite elimination and formation of the hydride-Meisenheimer complex of 2,4-dinitrophenol. The nitrite eliminating activity was enriched by FPLC. The product of 2,4-dinitrophenol reduction by the enzyme system was identified as its hydride-Meisenheimer complex. Nitrite elimination occurs solely from the dihydride complex of picrate. In conclusion picrate and 2,4-dinitrophenol are degraded via convergent pathways.