Isotopisch-instationäre 13 C-Stoffflussanalyse in Escherichia coli

Abstract

Die 13C-Stoffflussanalyse ist ein wichtiges Werkzeug im Metabolic Engineering. Ausgangs-punkt dieser Arbeit war der Umstand, dass eine breitere Anwendung der 13C-Stofffluss-analyse, z. B. bei der Analyse der industriell relevanten Prozessführungen Batch und Fed Batch sowie bei tierischen Zellkulturen, bisher insbesondere wegen der eingesetzten GC-MS und NMR basierten Analyse proteinogener Aminosäuren beschränkt ist. Aufgrund der großen Zeitkonstanten infolge eines kleinen Protein-Turnover wird ein quasi-stationärer Zustand in einem für die Stoffflussanalyse interessanten Zeitbereich nicht erreicht. Daher wird diese Vorgehensweise vor allem bei der kontinuierlichen Prozessführung verwendet. Alternativ müssen aufwändige Reaktorkonzepte eingesetzt werden (Drysch et al., 2004). Außerdem bedeutet die erforderliche lange Markierungsdauer hohe experimentelle Kosten. Mittels LC-MS Analysemethoden ist es seit kurzem möglich, intrazelluläre Markierungs-informationen auch direkt auf der Ebene der Metabolite des zentralen Kohlenstoffwechsels zu erheben (van Winden et al., 2005). Wegen des großen Metabolit-Turnover kann auf diese Weise die Zeitdauer eines Markierungsexperimentes erheblich reduziert und damit das Anwendungsspektrum der 13C-Stoffflussanalyse erweitert werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten erstmals Messinformationen aus der isotopisch instatio-nären Markierungsdynamik zur Identifikation der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli genutzt werden. Dafür werden Messinformationen zu Absolutkonzentrationen und relativen Massenisotopomerenanteilen benötigt. Für diesen Ansatz der isotopisch instationären 13C-Stoffflussanalyse wurden experimentelle, analytische und rechnergestützte Verfahren entwickelt und eingesetzt. Die Durchführung von Kurzzeit-13C-Markierungsexperimenten erfordert schnelle Probe-nahmetechniken. Hierfür wurde ein neuartiges, auf die LC-MS Analytik abgestimmtes integriertes Probenahmeverfahren entwickelt. Da die Grundoperationen Probentransfer, Abstoppen des Metabolismus, Metabolitextraktion und Probenaufarbeitung indirekt in einem Kapillar-Rohrwendel-Wärmeübertrager ohne jeden Zusatz chemischer Reagenzien erfolgten, konnte die Anzahl der Grundoperationen verringert und durch Automatisierung die Repro-duzierbarkeit verbessert werden. Der Zeitbedarf zur Durchführung dieser Schritte wurde auf 30 s je Probe reduziert. Des Weiteren wurde eine LC-MS Analysemethode für die Quanti-fizierung von intrazellulären Absolutkonzentrationen und von Massenisotopomeren im iso-topisch stationären und isotopisch instationären Zustand entwickelt. Zur Validierung und Ergänzung der LC-MS basierten Bestimmung von Massenisotopomeren wurden GC-MS basierte Messungen freier und proteinogener Aminosäuren durchgeführt. Neben einer geeigneten schnellen Probenahmetechnik und einer LC-MS Analysemethode werden für die isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse auch neue Ansätze in der Simulation von 13C-Markierungsexperimenten und für die Flussschätzung benötigt. Hierfür wurden die Bilanz-gleichungen des Isotopomerenmodells des untersuchten Reaktionsnetzwerkes automatisiert generiert und das resultierende nichtlineare, gekoppelte und steife Isotopomeren-Differentialgleichungssystem numerisch integriert. Als besonders geeignet für eine numerisch stabile Integration erwies sich der Extrapolationsintegrator LIMEX. Dieser kann außerdem isotopisch instationäre Messdatensätze für die nachfolgende Flussschätzung berücksichtigen. Für die Optimierung wurde der Evolutionsalgorithmus JavaEvA verwendet. Die entwickelten experimentellen, analytischen und rechnergestützten Verfahren wurden für die Ermittlung der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli W3110 bei D = 0.1 h-1 ange-wendet. Zunächst wurde dieser Stamm physiologisch charakterisiert. In einem nächsten Schritt wurden intrazelluläre Metabolitkonzentrationen im steady state und nach einem stimulus-response Experiment mittels LC-MS quantitativ bestimmt. Ebenfalls mit LC-MS wurden isotopisch stationäre und isotopisch instationäre Massenisotopomerenverteilungen von Metaboliten des zentralen Kohlenstoffwechsels quantifiziert. Die Bestimmung der Markierungsmuster freier und proteinogener Aminosäuren erfolgte mit GC-MS. Die LC-MS und GC-MS Datensätze wurden im Folgenden zur Durchführung von isotopisch instationären und isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen in E. coli verwendet. Die LC-MS basierte isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse wurde erfolgreich zur Ermittlung der intra-zellulären Stoffflussverteilung in den zentralen Kohlenstoffwechselwegen Glykolyse, Pentosephosphat-Weg und Tricarbonsäure-Zyklus eingesetzt. Als wesentliche Ergebnisse wurden eine Flussverteilung (bezogen auf die Glucoseaufnahmerate) am G6P-Knoten zwischen Glykolyse und Pentosephosphat-Weg von 55% : 44% sowie mit 4% nur eine geringe Aktivität des Malatenzyms bestimmt. Diese Resultate waren in guter Überein-stimmung mit den gleichfalls durchgeführten LC-MS und GC-MS basierten isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen sowie Literaturwerten. Insgesamt ist die Anwendung der entwickelten Methodik bestehend aus integriertem Probe-nahmesystem, LC-MS Analysemethode und isotopisch instationärer 13C-Stoffflussanalyse aussichtsreich für die Bearbeitung von Fragestellungen im Metabolic Engineering, in der Bio-prozessanalyse und -entwicklung, im Hochdurchsatzscreening und für systembiologische Untersuchungen. Dieses erweiterte Spektrum potentieller Anwendungen wird maßgeblich durch die Nutzung der kleinen Zeitkonstanten beim Metabolit-Turnover ermöglicht. 13C metabolic flux analysis is an important tool in metabolic engineering. Starting point of this study was the fact that broad application of 13C metabolic flux analysis, e. g. in analysis of industrial relevant batch and fed batch processes as well as in studies with mammalian cell cultures, as yet is limited by the fact that predominantly GC-MS and NMR analytical methods are applied for quantification of proteinogenic amino acids. Because of large time constants due to small protein turnover rates quasi steady state conditions are not achieved within a sufficiently short time period as is required for metabolic flux analysis. Hence, this approach is mainly applied to chemostat cultivations. Alternatively, an elaborate bioreactor design becomes necessary (Drysch et al., 2004). Aside from long labeling times, high total costs are involved. Only recently, LC-MS analytical methods enable direct assessment of labeling patterns of intracellular metabolites from central carbon metabolism (van Winden et al., 2005). By reason of high metabolite turnover rates time required to perform 13C labeling experiments can be substantially reduced. Also, range of possible applications of 13C metabolic flux analysis can be extended by this means. In the context of this thesis isotopic instationary labeling data from isotopic transient phase were used for identification of intracellular metabolic flux distribution in E. coli for the first time. For this purpose data on intracellular metabolite concentrations and relative mass isotopomer distributions are required. Within the scope of this work experimental, analytical and computational tools for isotopic instationary 13C metabolic flux analysis were developed and applied. For short-time 13C labeling experiments rapid sampling techniques are needed. Therefor, a novel integrated sampling procedure was designed and adjusted to requirements of LC-MS analytical method. Unit operations sample transfer, quenching, metabolite extraction, and sample conditioning were achieved by indirect short-time heat treatment using a coiled single tube heat exchanger without any addition of chemical reagents. Thus, total number of unit operations was reduced. Reproducibility was enhanced by automation. Time needed to perform all necessary unit operations was shortened to 30 s per sample. Moreover, a LC-MS analytical method for quantification of intracellular metabolite concentrations and mass isotopomer distributions under isotopic stationary and isotopic instationary conditions was developed. GC-MS based quantification of free and proteinogenic amino acids was carried out for validation purposes and for acquisition of supplementary measurement data. In addition to a suitable rapid sampling procedure and a LC-MS analytical method, novel approaches are also required for simulation of 13C labeling experiments and flux estimation. At this, the system of isotopomer balance equations was automatically generated, and the resulting nonlinear, stiff, and coupled differential equation system was solved by numerical integration. The extrapolation integrator LIMEX proved to be suitable for numerically stable integration. Furthermore, data from isotopic transient phase can be considered for subsequent flux estimation. For optimization the evolutionary algorithm JavaEvA was used. Developed experimental, analytical, and computational methods were applied to isotopic instationary 13C metabolic flux analysis in E. coli W3110 at D = 0.1 h-1. At first, investigated E. coli strain was physiologically characterized. In a next step, intracellular metabolite con-centrations at steady state and after a stimulus-response experiment were quantitatively determined by LC-MS. Likewise, isotopic stationary and isotopic instationary mass isotopomer distributions of metabolites from central carbon metabolism were quantified by LC-MS. Determination of labeling patterns of free and proteinogenic amino acids was performed by GC-MS. In the following LC-MS and GC-MS data sets were used in isotopic instationary and isotopic stationary 13C metabolic flux analysis in E. coli. LC-MS based isotopic instationary 13C metabolic flux analysis was successfully applied in determination of intracellular flux distribution in glycolysis, pentose phosphate pathway, and citric acid cycle. As important results, flux distribution at G6P node (normalized to glucose influx) was determined to 55% : 44%, and only minor activity of 4% was detected for malic enzyme. These results were in good agreement with conducted LC-MS and GC-MS based isotopic stationary 13C metabolic flux analysis, as well as with literature data. Altogether, application of the developed approach - comprising a novel integrated sampling procedure, a LC-MS analytical method, and isotopic instationary 13C metabolic flux analysis - appears promising for issues concerning metabolic engineering, bioprocess analysis and development, high throughput screening, and systems biology research. The extended range of potential applications can be attributed to the fact that the introduced approach makes use of existing small time constants in metabolite turnover.