Entwicklung einer automatisierten Herstellung einer DNA-Bibliothek für die Hochdurchsatzsequenzierung auf einer mikrofluidischen Plattform

Abstract

Next Generation Sequencings (NGS) ermöglicht immer kostengünstigere Sequenzanalysen von Nukleinsäuren, weshalb die Methode für die klinische Diagnostik und darüber hinaus sehr an Bedeutung gewonnen hat. Untersuchungen von Flüssigbiopsien, die meist nur gering konzentrierte Analyte, wie z.B. zellfreie DNA (cfDNA) beinhalten, können mittels NGS sensitiv analysiert werden. Eine regelmäßige Flüssigbiopsie Analyse könnte beispielsweise in der Therapiekontrolle von onkologischen Erkrankungen Anwendung finden. Da die Herstellung einer Sequenzierbibliothek aufgrund komplexer und vieler Arbeitsschritte sehr aufwendig ist, werden Automatisierungen angewendet. Diese Liquidhandler sind allerdings nur für große Probenumsätze ökonomisch sinnvoll. Für eine geringere Probenanzahl und zum örtlich-flexiblen Einsatz (Point-of-Care Tests) sind kleinere Automatisierungslösungen notwendig, wenn die Proben nicht manuell präpariert werden sollen. In dieser Arbeit wird ein bestehendes Lab-on-a-Chip (LoC) System (Vivalytic von Bosch Healthcare Solutions), das für molekularbiologische Untersuchungen eingesetzt wird, als Plattform für die Entwicklung einer automatisiert hergestellten Sequenzierbibliothek für die gegenwärtig am häufigsten genutzte und genauste NGS-Methode (Sequencing by Synthesis von Illumina) verwendet. Für das Proof-of-Concept wurde eine Multiplex-PCR entwickelt, welche krebstherapierelevante Mutationen einer cfDNA Referenzprobe anreichern kann. Dazu wurden sieben Mutationen betrachtet, welche mit der Wirksamkeit und Resistenzbildung von Therapeutika gegen nicht-kleinzelligen Lungenkrebs und kolorektalem Karzinom assoziiert sind. Zur Implementierung der Enzymschritte für die Herstellung der Sequenzierbibliothek wurden fluidische Abläufe für die LoC-Kartusche entwickelt und optimiert. Die Nukleinsäureaufreinigungen wurden mittels magnetischen Beads auf der bestehenden LoC-Kartusche integriert und erfolgreich getestet. Zudem wurde eine fluoreszenzbasierte Nukleinsäurequantifizierung auf der LoC-Kartusche etabliert. Zur Validierung der Qualität der hergestellten Sequenzierbibliothek wurden Referenz cfDNA-Proben mit unterschiedlichen Mutationsfrequenzen mit dem entwickelten LoC-Verfahren zur Sequenzierbibliotheksherstellung präpariert und nachfolgend sequenziert. Die Ergebnisse wurden mit manuell aufbereiteten Proben verglichen. Bis zu einer minimalen Probeneingangsmenge von 10 ng DNA konnte eine vergleichbare Detektionsrate der Mutationen zwischen manueller und automatisierter Probenvorbereitung festgestellt werden. Damit konnte erstmalig eine automatisierte Sequenzierbibliotheksherstellung mit gezielter Anreicherung, ligationsbasierter Adapteranbringung, magnetische Bead-Nukleinsäureaufreinigungen und Index-PCR auf der LoC-Kartusche erfolgreich umgesetzt werden. Next-generation sequencing (NGS) enables more cost-effective nucleic acid sequence analyses, which is why the method has become very important for clinical diagnostics and beyond. Analysis of liquid biopsies, which contain only low-concentration analytes, such as cell-free DNA (cfDNA), can be analyzed sensitively using NGS. Regular liquid biopsy analysis could monitor the treatment of tumor diseases. As library preparation is time-consuming due to complex and many process steps, automated processes are used. However, these liquid handlers are only economically viable for large sample amounts. For a smaller number of samples and more flexible use for point-of-care tests (POCT), smaller automated devices are necessary if the samples should not prepared manually. In this work, an existing lab-on-a-chip (LoC) system (Vivalytic of Bosch Healthcare Solutions), is used as a platform for the development of automated library preparation for the currently most frequently used and most accurate NGS method (sequencing by synthesis from Illumina). As a proof-of-concept, a multiplex PCR was developed that enables enrichment of cancer therapy-relevant mutations in a cfDNA reference sample. For this purpose, seven mutations associated with the efficacy and resistance of therapeutics against non-small cell lung cancer and colorectal cancer were considered. Fluidic processes for the LoC cartridge were evolved and optimized to implement the enzyme steps for the library preparation. Nucleic acid purification was implemented with magnetic beads on the existing LoC cartridge and successfully integrated into the microfluidic environment. In addition, fluorescence-based nucleic acid quantification was established on the LoC cartridge. To validate the quality of the sequencing library, reference cfDNA samples with different mutation frequencies were used, and subsequently sequenced using the developed LoC method for sequencing library preparation. The detection rate of mutations were compared with those of manually processed samples. Up to a minimum sample amount of 10 ng input DNA, no difference between manual and automated library preparation could be detected. Thus, an automated sequencing library preparation with targeted enrichment, ligationbased adapter attachment, nucleic acid purification using magnetic beads, and an index PCR on the LoC cartridge with only 10 ng input DNA was successfully implemented.