Entwicklung eines Verfahrens für die automatisierte Vereinzelung von Zellen

Abstract

Die Zellvereinzelung ist ein essenzieller Bestandteil der Einzelzellanalyse und der Entwicklung monoklonaler Zelllinien. Die Prozesse finden vielseitige Anwendung in der biologischen Grundlagenforschung, medizinischen Diagnostik, personalisierten Therapie und industriellen Produktion von Biowirkstoffen. Das zunehmende Interesse an Einzelzellen führte in den vergangenen Jahren zur Entwicklung neuer Technologien und Verfahren für ihre Vereinzelung. Jedoch besteht weiterhin Bedarf an innovativen Systemen für die Verbesserung der Effizienz und Automatisierbarkeit der Einzelzellgewinnung. Das Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung (IPA) hat mit dem OSCAR Single-Cell Dispenser eine neue Technologie für die automatisierte und effiziente Zellvereinzelung im Hochdurchsatz entwickelt. Das Verfahren beruht auf der hochfrequenten Isolation und Analyse fluoreszierender Suspensionszellen durch das kontaktlose Dispensieren in Mikrotiterplatten. In diesem Promotionsprojekt wurden zunächst die grundlegenden Prozessparameter des OSCAR Single-Cell Dispensers mit fluoreszierenden Beads optimiert. Die Fluoreszenzintensität der Beads war dabei homogen, photostabil und ausreichend hoch, sodass sie vom OSCAR Single-Cell Dispenser detektiert werden konnten. Die Dosierenergie wirkte sich auf die Geometrie und die Geschwindigkeit der dispensierten Tropfen aus und führte zu Unterschieden bei der Signalerkennung und der Vereinzelungseffizienz. Bei reduzierter Beadkonzentration war die Vereinzelungseffizienz verbessert, wobei die Prozesszeit für die Zellvereinzelung in Mikrotiterplatten anstieg. Mit 1 x 103 Beads/ml wurde eine maximale Vereinzelungseffizienz von 96.9 % bei einer Prozesszeit von 75.7 s für 96 Wells erzielt. Das verwendete Modellsystem war die am Fraunhofer IPA entwickelte CHO K1 0S-Suspensionszelllinie. Die Zelllinie stammt von Ovarzellen des chinesischen Hamsters ab, dem am häufigsten verwendeten Zellsystem für die industrielle Produktion von Biowirkstoffen. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Zellen einen für Suspensionskulturen charakteristischen Wachstumsverlauf aufweisen und ohne Subkultivierung bis zu sechs Tage mit einer Verdopplungszeit von 22 h kultiviert werden können. Das Proliferationsverhalten der Zellen, die Viabilität und der Metabolismus der untersuchten Substanzen Glukose, Laktat, Glutamin und Glutamat waren über einen Kultivierungszeitraum von zehn Wochen nach der Überführung aus der Kryokonservierung näherungsweise konstant, was auf ein robustes Kultursystem schließen ließ. Zusätzlich wurde das Wachstumsverhalten der Zellen in Mikrotiterplatten untersucht, die ein essenzielles Kultivierungsformat für die Zellvereinzelung darstellen. Anders als in Schüttelkolben wiesen Zellen in Mikrotiterplatten ein reduziertes Zellwachstum um bis zu 79.0 % auf. Dies konnte sowohl auf das Plattenformat als auch auf die Absenz von Schüttelprozessen zurückgeführt werden. Die Zellvereinzelung mit dem OSCAR Single-Cell Dispenser erforderte die vorherige Fluoreszenzmarkierung der Zellen. Von drei getesteten Lebendzellfarbstoffen erwies sich CellTracker-Green aufgrund der vergleichsweise hohen Fluoreszenzintensität und Proliferationsrate der Zellen als am geeignetsten. Die Fluoreszenzintensität der gefärbten Zellen blieb auch bei wiederholter Exposition über einen Zeitverlauf von 5 min konstant. Höhere Farbstoffkonzentrationen resultierten in stärker fluoreszierenden Zellen, einhergehend mit reduziertem Zellwachstum und erhöhter Apoptoseaktivität. In Kombination mit dem Dispensierprozess des OSCAR Single-Cell Dispensers wurde durch die Fluoreszenzfärbung mit einer Farbstoffonzentration von 2.5 µM ein reduziertes Zellwachstum von bis zu 57.6 % im Vergleich zu ungefärbten und pipettierten Zellen beobachtet. Nach den Untersuchungen zur Fluoreszenzmarkierung der Zellen wurde die Vereinzelungseffizienz des OSCAR Single-Cell Dispensers für das Zellmodell optimiert. Die Vereinzelungseffizienz war dabei von der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs und des Fluoreszenzschwellenwerts abhängig. Zusätzliche Waschschritte nach der Fluoreszenzfärbung der Zellen führten zu keiner verbesserten Vereinzelungseffizienz. Die Vereinzelungseffizienz des OSCAR Single-Cell Dispensers war in allen Abschnitten der Mikrotiterplatte konstant, was zeigt, dass die Zellen während des gesamten Vereinzelungsprozesses homogen verteilt waren. Nach der Zellvereinzelung mit dem OSCAR Single-Cell Dispenser konnte die klonale Expansion von Einzelzellen im Kulturverlauf von sieben Tagen beobachtet werden. Das in dieser Promotionsarbeit entwickelte Verfahren für die Berechnung der Anwachsrate mit Hilfe des mathematischen Modells der Triangle threshold-Methode ermöglichte eine präzisere Klassifizierung der expandierten Klone, zusätzlich zur Zellzahl pro Well. Der ermittelte Grenzwert für die Berechnung der Anwachsrate von CHO K1 0S-Zellen sieben Tage nach der Vereinzelung mit dem OSCAR Single-Cell Dispenser betrug 15 Zellen pro Well. Die Zugabe von BSA oder FBS zum Kulturmedium nach der Zellvereinzelung resultierte in ähnlichem oder reduziertem Zellwachstum im Vergleich zur Kontrolle. Lediglich bei Zugabe von konditioniertem Medium war die Anwachsrate von 17.8 % auf bis zu 65.2 % sowie die Zellzahl von 26 Zellen auf bis zu 53 Zellen pro Well angestiegen. Abschließend wurde die Prozesseffizienz des OSCAR Single-Cell Dispensers mit den Standardverfahren der Zellvereinzelung verglichen. Durch die Optimierung technischer und prozessrelevanter Parameter wurde mit dem OSCAR Single-Cell Dispenser eine Zellvereinzelungseffizienz von bis zu 89.9 % erreicht. Diese war signifikant höher als die der Durchflusszytometrie (62.9 %) und der Limiting Dilution (32.3 %). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Entwicklung monoklonaler Zelllinien aus vereinzelten Zellen möglich ist. Dabei resultierte die klonale Expansion der Einzelzellen unter Standardkultivierungsbedingungen nach der Zellvereinzelung mit dem OSCAR Single-Cell Dispenser in einer Anwachsrate von 12.4 % im Vergleich zu 17.1 % bei der Durchflusszytometrie und 10.1 % bei der Limiting Dilution. Die Ergebnisse dieser Promotionsarbeit haben gezeigt, dass mit dem OSCAR Single-Cell Dispenser eine effiziente Vereinzelung von CHO K1 0S-Zellen erreicht werden kann. Am Beispiel dieses Modellsystems können Einzelzellen im Hochdurchsatz für Einzelzellanalysen und für die effiziente Entwicklung monoklonaler Zelllinien gewonnen werden. Die maximal erreichte Vereinzelungseffizienz war dabei höher als bei der Durchflusszytometrie und der Limiting Dilution, den Standardverfahren der Zellvereinzelung. Der OSCAR Single-Cell Dispenser stellt somit eine ergänzende Zellvereinzelungstechnologie für die Grundlagenforschung, die Theranostik und für die industrielle Produktion von Biowirkstoffen dar. The isolation of single cells is an essential aspect for single cell analyses and for the development of monoclonal cell lines. These processes have a broad range of applications in fundamental biological research, medical diagnostics, personalized therapy and for the industrial production of biopharmaceuticals. The increasing demand for single cells has led to the development of new technologies and methods for their isolation in recent years. However, there is still a constant need for innovative systems to improve the efficiency and automation of single cell production. With the OSCAR Single-Cell Dispenser, the Fraunhofer-Institute for Manufacturing Engineering and Automation (IPA) has developed a new technology for automated and efficient high-throughput single cell isolation. The system is based on the rapid isolation and analysis of fluorescent suspension cells by non-contact dispensing into microtiter plates. In this doctoral thesis, the fundamental process parameters of the OSCAR Single-Cell Dispenser were optimized with fluorescent beads at first. The fluorescence intensity of the beads was homogeneous, photostable and sufficiently high to be detected by the OSCAR Single-Cell Dispenser. The dosing energy affected the geometry and speed of the dispensed droplets and led to differences in signal detection and isolation efficiency. With lower bead concentration, the isolation efficiency was improved but the process time increased. With 1 x 103 beads/ml, a maximum isolation efficiency of 96.9 % was achieved with a process time of 75.7 s for 96 wells. The applied model system was the CHO K1 0S suspension cell line, which had previously been developed at Fraunhofer IPA. The cell line is derived from Chinese hamster ovary cells, the most commonly used cell system for the industrial production of biopharmaceuticals. This project has shown that these cells exhibit a characteristic growth pattern for suspension cultures and can be cultivated for up to six days with a doubling time of 22 h without subcultivation. The proliferation behavior of the cells, the viability and the metabolism of the investigated substances glucose, lactate, glutamine and glutamate were constant over a cultivation period of ten weeks after transfer from cryopreservation. This indicated a robust culture system. In addition, the growth behavior of the cells was investigated in microtiter plates, an essential cultivation format for single cell isolation. In contrast to shake flasks, cells in microtiter plates showed reduced cell growth of up to 79.0 %. This was attributed to both the plate format and the absence of shaking processes. Single cell isolation with the OSCAR Single-Cell Dispenser required fluorescence labeling of the cells. Of the three live cell dyes tested, CellTracker-Green proved to be the most suitable due to the comparatively high fluorescence intensity and proliferation rate of the cells. The fluorescence intensity of the stained cells remained constant over a period of 5 min even after repeated exposure. Increased dye concentrations resulted in enhanced fluorescence signals but also in reduced cell growth and elevated apoptosis activity. In combination with the dispensing process of the OSCAR Single-Cell Dispenser, fluorescence staining with a dye concentration of 2.5 µM resulted in reduced cell growth of up to 57.6 % compared to unstained and pipetted cells. Subsequently, the single cell isolation efficiency of the OSCAR Single-Cell Dispenser was investigated and optimized for the cell model. The isolation efficiency was primarily dependent on the concentration of the fluorescent dye and the fluorescence threshold. Additional washing steps after fluorescence staining of the cells did not lead to an improved isolation efficiency. The isolation efficiency of the OSCAR Single-Cell Dispenser was constant in all sections of the microtiter plate, indicating that the cells were homogeneously distributed throughout the entire isolation process. After cell isolation with the OSCAR Single-Cell Dispenser, clonal expansion of single cells was observed over the course of seven days of culture. The applied method for calculating the growth rate using the mathematical model of the Triangle threshold was developed in this doctoral thesis and enabled a more precise classification of the expanded clones, in addition to the number of cells per well. The determined threshold for the growth rate calculation of CHO K1 0S cells seven days after isolation with the OSCAR Single-Cell Dispenser was 15 cells per well. The addition of BSA or FBS to the culture medium after cell isolation resulted in similar or reduced cell growth compared to the control. Only the addition of conditioned medium increased the growth rate from 17.8 % to 65.2 % and the cell count from 26 cells to 53 cells per well. Finally, the process efficiency of the OSCAR Single-Cell Dispenser was compared with standard methods for single cell isolation. By optimizing technical and process parameters, a single cell isolation efficiency of up to 89.9 % was achieved with the OSCAR Single-Cell Dispenser. The efficiency was significantly higher than that of flow cytometry (62.9 %) and limiting dilution (32.3 %). Furthermore, it was shown that the development of monoclonal cell lines from isolated cells is possible. Clonal expansion of single cells under standard cultivation conditions resulted in a growth rate of 12.4 % after cell isolation with the OSCAR Single-Cell Dispenser compared to 17.1 % with flow cytometry and 10.1 % with limiting dilution. The results of this doctoral thesis have shown that an efficient isolation of CHO K1 0S cells can be achieved with the OSCAR Single-Cell Dispenser. By using this model system as an example, single cells can be obtained in high-throughput for single cell analyses and for the efficient development of monoclonal cell lines. The maximum isolation efficiency achieved was higher than with flow cytometry and limiting dilution, the standard methods for single cell isolation. The OSCAR Single-Cell Dispenser thus represents a complementary single cell isolation technology for fundamental research, theranostics and for the industrial production of biopharmaceuticals.