Synthese von Tosyl-Samroiyotmycin und Samroiyotmycin-Derivaten: Biologische Eigenschaften und neue Wege zum Aufbau der (2E,4E)-Dienon-Einheit Von der Fakultät Chemie der Universität Stuttgart zur Erlangung der Würde eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung vorgelegt von Benedikt Josef Kolb aus Oberstdorf Hauptberichter: Prof. Dr. Sabine Laschat Mitberichter: Prof. Dr. René Peters Prüfungsvorsitz: Prof. Dr. Elias Klemm Tag der mündlichen Prüfung: 06.12.2024 Institut für Organische Chemie Universität Stuttgart 2024 Für meine Familie I Erklärung über die Eigenständigkeit der Dissertation Ich versichere, dass ich die vorliegende Arbeit mit dem Titel „Synthese von Tosyl- Samroiyotmycin und Samroiyotmycin-Derivaten: Biologische Eigenschaften und neue Wege zum Aufbau der (2E,4E)-Dienon-Einheit“ selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Aus fremdem Quellen entnommene Passagen und Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Declaration of Authorship I hereby certify that the dissertation entitled “Synthese von Tosyl-Samroiyotmycin und Samroiyotmycin-Derivaten: Biologische Eigenschaften und neue Wege zum Aufbau der (2E,4E)-Dienon-Einheit” is entirely my own work except where otherwise indicated. Passages and ideas from other sources have been clearly indicated. Stuttgart, den 11.10.2024 ______________________________ Benedikt Kolb II Anfertigen der Dissertation Die experimentellen Arbeiten wurden unter Anleitung von Prof. Dr. Sabine Laschat im Zeitraum von November 2019 bis Februar 2023 am Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart durchgeführt. Teile dieser Dissertation wurden in folgenden Publikationen bzw. Tagungsbeiträgen bereits veröffentlicht. B. Kolb, D. Silva dos Santos, S. Krause, A. Zens, S. Laschat, Beilstein J. Org. Chem. 2023, 19, 176–185. B. Kolb, F. Schmid, J. Weng, L. Altevogt, R. Pereira Rebelo, B. Wank, A. Baro, A. Zens, A. Shekhar, U. Bilitewski, S. Sax, S. Wittlin, D. Taylor, R. Müller, S. Laschat, Chem. Eur. J. 2024, accepted article, e202403408. 26. Tag der Organischen Chemie (TOCUS), 2023 in Stuttgart: „Challenges in Natural Product Synthesis: Sequential Hydrozirconation / Acylation towards Samroiyotmycin A”. B. Kolb, D. Silva dos Santos, S. Krause, A. Zens, S. Laschat, “Sequential Hydrozirconation / Pd-Catalyzed Cross Coupling of Acyl Chlorides Towards Conjugated (2E,4E)-Dienones”, 22nd European Symposium on Organic Chemistry (ESOC), 2023, Gent, Poster. III Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ....................................................................................................................... 1 1.1 Malaria – Ein Stich, der tödlich enden kann ................................................................ 1 1.2 Samroiyotmycin A und B syn,syn-7a,b - Macrodiolide gegen resistente Malaria- Erreger .......................................................................................................................... 6 1.3 Das (2E,4E)-Dienon als Strukturmotiv in Naturstoffen ............................................. 11 1.4 Hydrozirkonierungen .................................................................................................. 12 2 Aufgabenstellung ......................................................................................................... 17 3 Synthese von Samroiyotmycin A syn,syn-(7a) und Samroiyotmycin-Derivaten.... 19 3.1 Syntheseplanung zu Samroiyotmycin A syn,syn-7a in Anlehnung an Vorarbeiten ... 19 3.2 Synthese von (R)-2-Methylhex-5-enal 27 .................................................................. 20 3.3 Synthese von Tosyl-Oxazol 61 ................................................................................... 23 3.4 Untersuchung der Trennung der Diastereomere syn-61 und anti-61 durch kinetische Racematspaltung ........................................................................................................ 30 3.5 Synthese der seco-Säuren syn-62 und anti-62 durch Grubbs-Metathese ................... 34 3.6 Untersuchungen zur Detosylierung von syn-62 und anti-62 ...................................... 39 3.7 Makrolaktonisierung zu Tosyl-Samroiyotmycin syn,syn-63 ...................................... 49 3.8 Synthese der Naphthyl-, Thiophenyl- und Pyridyl-Derivate ...................................... 57 4 Biologische Untersuchungen ....................................................................................... 67 4.1 Erste Einblicke in Struktur-Aktivitäts-Beziehungen .................................................. 67 4.2 Docking Studien mit Hämozoin (β-Hämatin) ............................................................ 73 4.3 Zusammenfassung der biologischen Untersuchungen ............................................... 76 5 Sequentielle Hydrozirkonierung / Kreuzkupplung zu konjugierten (2E,4E)-Dienonen ......................................................................................................... 77 5.1 Vorarbeiten zur Reaktionssequenz ............................................................................. 77 5.2 Synthese unterschiedlich substituierter (E)-En-ine 156 ............................................. 78 5.3 Optimieriung der Hydrozirkonierungs-/ Kreuzkupplungssequenz ............................ 79 IV 5.3.1 Untersuchung des Einflusses von Lösungsmittel, Temperatur und Reaktionszeit ................................................................................................ 79 5.3.2 Verwendung von Zinkchlorid als Additiv .................................................... 81 5.3.3 In situ Darstellung des Schwarz-Reagenzes 42 ........................................... 82 5.3.4 Untersuchung der Hydrozirkonierungs-Reaktion auf Ausbeutenverluste ... 85 5.3.5 Einfluss unterschiedlicher Pd-Katalysatoren ............................................... 86 5.3.6 Studie zur Reproduzierbarkeit ..................................................................... 89 5.4 Synthese unterschiedlich substituierter (2E,4E)-Dienone 158 .................................. 90 5.4.1 Variation der Acylchloride 157 .................................................................... 90 5.4.2 Variation der En-ine 156 .............................................................................. 93 5.4.3 Beispielhafte Bestimmung der (E/Z)-Selektivität ........................................ 97 5.5 Synthese von (2E,4E)-Dienonen mit komplexen Kohlenstoff-Gerüsten: Synthese von β-Ionon 158qq ................................................................................... 100 6 Zusammenfassung ..................................................................................................... 103 6.1 Synthese von Samroiyotmycin-Derviaten und biologische Untersuchungen .......... 103 6.2 Hydrozirkonierung und Kreuzkupplung zu (2E,4E)-Dienonen ............................... 108 7 Summary .................................................................................................................... 111 7.1 Synthesis of samroiyotmycin derivatives and biological tests ................................ 111 7.2 Hydrozirconation and cross-coupling towards (2E,4E)-dienones ........................... 115 8 Experimenteller Teil ................................................................................................. 119 8.1 Lösungsmittel und Arbeitsmethoden ....................................................................... 119 8.2 Geräte und Analytik ................................................................................................. 119 8.3 Synthese der Samroiyotmycin A-Derivate .............................................................. 122 8.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften ................................................................. 122 8.3.2 Synthese des Superquat-Auxiliars 64 ........................................................ 124 8.3.3 Synthese der Sorbinsäure 25 ...................................................................... 127 8.3.4 Synthese der tosylierten Samroiyotmycin A-Derivate............................... 129 V 8.3.5 Synthese der Naphthyl-, Thiophenyl und Pyridyl-Derivate ....................... 144 8.4 Hydrozirkonierung/Pd-Katalysierte Kreuzkupplung zu Dienonen .......................... 157 8.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften ................................................................. 157 8.4.2 Synthese von 160a ...................................................................................... 158 8.4.3 Synthese der En-ine 156 ............................................................................. 159 8.4.4 Synthese der Dienone 158 .......................................................................... 163 8.4.5 Synthese von (2E,4E)-Dienonen mit komplexen Kohlenstoff-Gerüsten ... 175 8.4.6 Synthese von Dien 171 und Enon 172 ....................................................... 180 8.5 Durchführung der biologischen Aktivitätstests ........................................................ 182 8.5.1 Antibakterielle und zytotoxische Aktivitätstests am HZI........................... 182 8.5.2 In vitro anti-Malaria-Aktivität gegen P. falciparum NF54 bei H3D .......... 183 8.5.3 In vitro anti-Malaria Aktivität gegen P. falciparum NF54 und K1 am Swiss TPH .................................................................................................. 184 8.5.4 Übersicht der Ergebnisse aus den biologischen Aktivitätstests.................. 186 9 Literaturverzeichnis .................................................................................................. 197 10 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. 209 11 Danksagung ................................................................................................................ 213 12 Lebenslauf .................................................................................................................. 215 1 1 Einleitung 1.1 Malaria – Ein Stich, der tödlich enden kann „Wir sollten entschlossen handeln und unser gemeinsames Ziel nicht aus den Augen verlieren: eine Welt zu schaffen, in der niemand an Malaria stirbt“[1] Dr T. A. Ghebreyesus, Generaldirektor der WHO Immer noch ist Malaria eine der verheerendsten Infektionskrankheiten der Welt.[2,3] Im Jahr 2022 wurde die Zahl der Malaria-Infektionen auf 249 Millionen geschätzt, wobei die Krankheit in 608 000 Fällen zum Tode führte.[4] Vor allem Kinder und Jugendliche in Afrika waren davon betroffen.[1,4] In den letzten Jahren konzentrierte sich die Malaria-Bekämpfung auf die Verwendung von vorbehandelten Moskitonetzen und das Besprühen von Innenräumen mit Insektiziden, um die Zahl der Moskito-Vektoren zu begrenzen. Zudem wurde der Fokus auf den Einsatz wirksamer Medikamente zur Behandlung und Vorbeugung von Malaria gelegt.[5,6] Jedoch sind die weltweiten Erfolge bei der Malaria-Bekämpfung zurückgegangen und auf einem Plateau angelangt. Auch die Unterbrechungen aufgrund der COVID-19- Pandemie haben die Bemühungen der Länder um die Festlegung und die Durchführung von Maßnahmen behindert.[4,6,7] Im Rahmen der Malaria-Bekämpfung entwickelte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) eine Strategie, welche Prioritäten in der Malaria- Bekämpfung setzt und zentrale Schritte definiert.[1] Nach Dr. T. A. Ghebreyesus, dem Generaldirektor der WHO, soll so die Malaria-Übertragung durch gezielte Investitionen und Maßnahmen kontrolliert und vorgebeugt werden. Beispielsweise soll in Zukunft die Unterstützung bei der Malaria-Bekämpfung auf den spezifischen Kontext des jeweiligen Landes zugeschnitten werden.[1] Malaria ist eine von Mücken übertragene Krankheit, die beim Menschen durch fünf Spezies eines einzelligen Parasiten der Gattung Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi) verursacht wird. Vor allem P. falciparum, welches die Malaria tropica auslöst, kann zum Tod eines befallenen Menschen führen. Nach 9 – 14 Tagen zeigen sich erste Symptome wie Fieber, Schüttelfrost, Kopfschmerzen und Schwitzen.[8–10] Die Inkubationszeit lässt sich durch den äußerst komplexen Entwicklungszyklus des Malaria-Parasiten erklären, der in zwei verschiedenen Wirten stattfindet (Abbildung 1). Während der ungeschlechtliche Teil des Lebenszyklus in Säugern erfolgt, vollzieht sich der geschlechtliche Teil in der weiblichen Mücke der Gattung Anopheles. Wird ein Mensch von einer infizierten Mücke gestochen, 2 gelangen die Plasmodien-Zellen, die sogenannten Sporozoiten, in die Blutbahn und werden zur Leber transportiert. In den Leberzellen reifen sie zu Leberschizonten, die sich durch Teilung weiter vermehren. Die entstehenden Merozoiten brechen die Leberzellen auf und gelangen in die Blutbahn. Mit dem massiven Befall der roten Blutkörperchen können die ersten Krankheitssymptome auftreten.[8–10] Abbildung 1: Lebenszyklus des Malaria-Parasiten in Mensch und Mücke. Die Abbildung wurde modifiziert nach Literatur[10]. Innerhalb dieses Prozesses, der unbehandelt Monate dauern kann, reifen die Merozoiten zu Trophozoiten heran, dem sogenannten Ring-Stadium. In diesem Stadium kann mikroskopisch die Bildung eines Hämozoin-Pigments nachgewiesen werden (Abbildung 2a). Durch Metabolisierung des Hämoglobins entsteht das toxische Häm, welches zu Hämatin umgewandelt wird und als unlösliches Hämozoin auskristallisiert (Abbildung 2b). Der Trophozoit entwickelt sich weiter zu Schizonten, welche erneut Merozoiten produzieren und an die Blutbahn abgeben können. Dieser Zyklus ist verantwortlich für die für Malaria charakteristischen Fieberschübe.[8–10] Einige Merozoiten entwickeln sich zu geschlechtlichen Gametozyten, die nach einem erneuten Stich von der Mücke aufgenommen werden. Im Darm 3 der Mücke entwickeln sich diese zu weiblichen und männlichen Gameten, die sich zu Zygoten paaren. Über die Entwicklungsstufe des beweglichen Ookinet entsteht die Oozyste. Durch Wachstum und Teilung der Oozyste entstehen tausende aktive Sporozoiten, die einen weiteren menschlichen Wirt befallen können.[8–10] Abbildung 2: a) Infiziertes, rotes Blutkörperchen mit braunem Hämozoin. Die Abbildung wurde modifiziert nach Literatur[11]. b) schematische Darstellung von kristallinem Hämozoin. Die Abbildung wurde modifiziert nach Literatur[11]. Noch vor 50 Jahren waren führende Wissenschaftler und die WHO optimistisch, dass Malaria vollständig ausgerottet werden könnte. Allerdings verschwand der Optimismus zunehmend durch eine Vielzahl von Faktoren, beispielsweise durch den Zusammenbruch des öffentlichen Gesundheitswesens in vielen Entwicklungsländern oder fehlende finanzielle Anreize für Pharmaunternehmen zur Entwicklung von anti-Malaria-aktiven Wirkstoffen.[12] 4 Auch zunehmende Resistenzen gegen herkömmliche Malaria-Medikamente stellen ein großes Problem dar. Einer der ältesten Wirkstoffe gegen Malaria ist Chinin 1, das aus der Rinde des Chinarindenbaums extrahiert wurde (Schema 1).[13] Als Mittel der Wahl wurde es 1940 von Chloroquin 2 abgelöst, welches als Alternative durch eine hohe antiplasmodiale Aktivität bei gleichzeitig geringer Toxizität und durch eine kostengünstige Synthese überzeugte.[13] Schema 1 Chloroquin 2 kann als Base in neutraler Form durch Membranen diffundieren und anschließend im sauren Milieu als protonierte Form akkumulieren. Durch Ausbildung eines Komplexes mit den Hämatin-Einheiten wird die weitere Kristallisation zu Hämozoin verhindert.[14] Experimentell wurde das Chloroquin-Hämatin-Modell durch eine Kristallstruktur unterstützt, in der das Eisen(III)-Zentrum durch Gallium(III) ersetzt wurde (Abbildung 3).[15] Abbildung 3: Kristallstruktur des Komplexes zwischen Chloroquine 2 und Porphyrin 3 (Hämatin). Die Abbildung wurde aus der Literatur[13,15] entnommen und modifiziert. 5 Der Komplex zeigte π-π-Wechselwirkungen zwischen dem Porphyrin 3 (Hämatin) und der Chinolin-Einheit von 2, sowie elektrostatische Wechselwirkungen.[13] Allerdings traten bereits 1980 erste Resistenzen des Parasiten gegenüber Chloroquin 2 auf, die sich schnell ausbreiteten und zu mehreren Millionen zusätzlichen Todesfällen führten.[13,16] Die Resistenz beruht auf einer Mutation eines Gens (PfCRT) in P. falciparum, welche den Transport und die Anreicherung des Wirkstoffs in der Verdauungsvakuole des Parasiten verhindert.[17] Schema 2 Nach intensiver Forschung an Wirkstoffen gegen Malaria, wurde 1972 Artemisinin 4 entdeckt, das aus den Blättern und Blüten des Einjährigen Beifußes (Artemisia annua) extrahiert werden konnte.[18] Aufgrund der geringen Bioverfügbarkeit von 4 wurden daraufhin schnell Modifikationen der Struktur 4 entwickelt, wie beispielsweise Artesunat 5, welche zudem vorteilhafte pharmakokinetische Eigenschaften besaßen.[19] Der Wirkmechanismus von Artemisinin 4 und Artemisinin-Derviaten ist bis heute nicht vollständig geklärt, obwohl davon ausgegangen wird, dass dem Endoperoxid-Rest eine zentrale Rolle zukommt.[13] Allerdings wurden die Wirkstoffe im menschlichen Körper schnell abgebaut, was lange und teure Therapien zur Folge hatte. Auf Grund dessen wurden die Wirkstoffe in Kombination mit länger wirksamen Partnern eingesetzt, wie zum Beispiel Mefloquin 6. In der heutigen Zeit ist die Kombinationstherapie auf Artemisinin-Basis (ACT) die empfohlene Erstbehandlung für P. falciparum-Malaria in fast allen endemischen Ländern der Welt.[5,19,20] Das Auftreten von Resistenzen gegenüber der ACTs ist deswegen umso fataler, da bis dato keine gute Alternative entwickelt werden konnte, die sich für eine groß angelegte Umsetzung eignet.[19] Aufgrund dessen ist die Entwicklung neuer Wirkstoffe unabdingbar, um den resistenten Erregern entgegenwirken zu können. 6 1.2 Samroiyotmycin A und B syn,syn-(7a,b) - Macrodiolide gegen resistente Malaria-Erreger In 2013 untersuchten Pittayakhajonwut[21] und seine Mitarbeiter eine Bodenprobe des Sam Roi Yot-Nationalparks in Thailand. Der Rohextrakt der dort enthaltenen Streptomyces-Spezies BCC33756 zeigte in ersten biologischen Tests schwache zytotoxische und antifungale Eigenschaften, jedoch vielversprechende Aktivität gegen den multiresistenten Malaria-Stamm Plasmodium falciparum K1. Bei genauerer Untersuchung konnten die Makrodiolide Samroiyotmycin A syn,syn-7a und B syn,syn-7b isoliert werden, wobei die chemische Struktur durch NMR-Spektroskopie und Röntgenstrukturanalyse ermittelt werden konnte (Schema 3).[21] Die Laktone syn,syn-7a,b zeichnen sich durch ihre C2-Symmetrie aus, wobei die Oxazol- Gruppen (Schema 3, rot markiert) und Dienon-Einheiten (blau markiert) als Hauptmerkmale der Strukturen auftreten. Schema 3 Makrozyklische Laktone sind bereits seit 1950 aus der Arzneimittel-Forschung nicht mehr wegzudenken.[22] Ein wichtiger Vertreter ist das Makrodiolid (–)-Conglobatin (–)-8, welches 1979 aus Streptomyces conglobatus ATCC 31005 isoliert wurde und Antitumor-Aktivität gegen menschliche Brustkrebszellen zeigt.[23,24] Im Jahr 1984 wurde von Schregenberger und Seebach[25,26] die Totalsynthese von (+)-Conglobatin (+)-8 publiziert. Ursprünglich strebten die Autoren[25,26] die Synthese von (–)-8 an. Allerdings wurde durch den Vergleich des Drehwerts vom synthetisierten (+)-8 mit dem des natürlichen (–)-Conglobatins (–)-8 festgestellt, dass 7 beim synthetisierten Produkt (+)-8 die Stereozentren invertiert sind. Die zunächst angenommene absolute Konfiguration musste somit nachträglich angepasst werden.[25,26] Mit seiner C2-Symmetrie und den terminalen Oxazol-Gruppen zeigt das α,β-ungesättigte Lakton (+)-8 große strukturelle Ähnlickeit zu syn,syn-7a,b. Die Darstellung des Oxazol- Substituenten gelang Schregenberger und Seebach[25] nach einer Vorschrift von Schöllkopf[27] (Schema 4). Ausgehend vom β-Hydroxyamid 9 konnte mit einem Überschuss an lithiiertem Methylisonitril das Oxazol 10 in 76 % Aubeute (dr = 50 : 50) dargestellt werden. Die Trennung der Diastereomere 10 gelang mit chromatographischen Methoden nicht. Deshalb wurde 10 in den folgenden Reaktionsschritten als Gemisch weiter umgesetzt. Schema 4 Die direkte Makrolaktonisierung zum Produkt (+)-8 ausgehend von der seco-Säure 10 gelang nicht.[25] Aufgrund dessen wurde die Zyklisierung in zwei Schritten durchgeführt. Dazu wurde die Carboxyl-Gruppe in 10 mit 2,2,2-Trichlorethanol (TrcOH) geschützt und in einer 8 Yamaguchi-Veresterung mit dem Acetat 11 zum Dimer 12 in 48 % Ausbeute umgesetzt. Durch Entschützung der funktionellen Gruppen und erneute Yamaguchi-Veresterung konnte das Dimer 12 zyklisiert werden. Das Makrodiolid (+)-Conglobatin (+)-8 konnte anschließend nach Trennung der Diastereomere mittels HPLC in 10 % Ausbeute isoliert werden. Leadley[24] und seine Mitarbeiter untersuchten die Biosynthese von (–)-Conglobatin (–)-8 und konnten durch in vitro-Klonen den verantwortlichen Gen-Cluster decodieren. Von den Autoren[24] wurde zudem angenommen, dass durch Anpassung der entsprechenden Polyketid-Synthasen weitere Conglobatin-Analoga zugänglich gemacht werden könnten. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu (–)-8 könnte so zudem die Biosynthese zu Samroiyotmycin A und B syn,syn-7a,b erfolgen.[28,29] Die erste Totalsynthese von Samroiyotmycin A syn,syn-7a wurde 2021 von Hulme[30] veröffentlicht (Schema 5 und 6). Hierbei waren eine an Schöllkopf[27] angelehnte Kondensationsreaktion und eine one-pot Alkin-Kreuzmetathese / Ringschluss-Alkin- Metathese (ACM–RCAM) die Schlüsselschritte. Schema 5 9 Ausgehend vom Auxiliar 13 wurde durch diastereoselektive Alkylierung mit 5-Iodpent-2- in das Amid 14 in 79 % Ausbeute (dr = 75 : 1) erhalten (Schema 5). Durch reduktive Abspaltung des Auxiliars mit Lithiumaluminiumhydrid wurde der Aldehyd 15 gebildet, welcher in situ zum β-Lakton 17 weiter umgesetzt wurde. Die anschließende Kondensationsreaktion mit Tosylmethylisocyanid 18 (TosMIC) ergab das Tosyloxazol syn-19 in 52 % Ausbeute (dr > 97 : 3). Durch die Mosher-Ester-Methode konnte die syn-Konfiguration von syn-19 bestätigt werden.[30] Schema 6 Mittels Detosylierung mit Natriumamalgam und Veresterung mit der Säure 20 wurde das Bis(alkin) syn-21 in 70 % Ausbeute über 2 Stufen dargestellt (Schema 6). Anschließend erfolgte mittels ACM / RCAM der Aufbau des 20-gliedrigen Naturstoff-Gerüstes. Dazu wurde 10 syn-21 in Toluol mit dem Molybdän-Alkyliden-Komplex 22 umgesetzt. Das gewünschte syn,syn-23 konnte so in 74 % isoliert werden. Die Darstellung von Samroiyotmycin A syn,syn-7a gelang mittels Ruthenium-katalysierter Hydrostannylierung und Kupfer- katalysierter Protodestannylierung in 30 % (über 2 Stufen) und einem Diastereomerenverhältnis von dr = 78 : 22.[30,31] Im Rahmen seiner Doktorarbeit entwickelte Schmid[32] eine alternative Synthesestrategie. Darin sollte der Naturstoff syn,syn-7a durch Yamaguchi-Makrolaktonisierung aus der seco-Säure syn-24 dargestellt werden. Durch Grubbs II-katalysierte Kreuzmetathese mit der Sorbinsäure 25 sollte syn-24 ausgehend vom Alkohol syn-26 zugänglich gemacht werden. Die Einführung der Oxazol-Gruppe sollte durch Reaktion von Aldehyd 27 mit Oxazol 28 erfolgen. Schema 7 Die Details zu den von Schmid[32] untersuchten Synthesen sind im Diskussionsteil dieser Arbeit im Rahmen der Reproduzierbarkeits- und Optimierungs-Studien beschrieben (Kapitel 3). 11 1.3 Das (2E,4E)-Dienon als Strukturmotiv in Naturstoffen In vielen Naturstoffen, wie beispielsweise in Samroiyotmycin A syn,syn-4a, sind (2E,4E)- Dienone ein wiederkehrender Strukturbaustein. Ein Beispiel hierfür ist Epicocconon 29 (Schema 8). Der Naturstoff 29 wurde aus dem Pilz Epicoccum nigrum isoliert und kann in der Biotechnologie als Fluoreszenzmarker angewendet werden.[33] Die Dienon-Einheit zeigt auch Clifednamid H 30, welches ausgeprägte Zytotoxizität gegen zwei menschliche Krebszelllinien aufweist.[34] Das Strukturmotiv prägt auch marine Naturstoffe, wie Epoxysorbicillinol 31.[35] Die Isolierung von 31 gelang aus der Salzwasserkultur des Pilzes Trichoderma longibrachiatum, welcher zuvor aus einem Haliclona-Meeresschwamm extrahiert werden konnte. Ein weiteres Beispiel ist Vertinolid 32, welches aus dem Pilz Verticillium intertextum isoliert wurde. Schema 8 Aufgrund ihrer Instabilität und hoher Reaktivität ist die Synthese der Dienon-Einheiten herausfordernd. In Schema 9 sind Beispiele für Synthesemethoden von (2E,4E)-Dienonen gezeigt. Eine gängige Methode sind Additions-Eliminierungs-Reaktionen wie die Knoevenagel-Kondensation oder die Claisen-Schmidt-Kondensation.[36–41] Dabei werden Enale 33 mit Aldehyden 34a oder Ketonen 34b zu Dienonen umgesetzt. Außerdem können elektronenarme Alkine zu dem Strukturmotiv durch Phosphin-Katalyse isomerisiert werden. Weitere Methoden sind die Horner-Wadsworth-Emmons-Reaktion,[42,43] die Dehydrogenierung von Enonen 38,[44] die Claisen-Umlagerung,[45] oder die Metall-katalysierte Kreuzkupplung 12 von Alkenen 40 mit Enonen 41.[46] Allerdings benötigen die vorgestellten Reaktionen oft hohe Temperaturen und zeigen geringe Toleranz gegenüber funktioneller Gruppen.[44,47] Gerade in der Naturstoffsynthese sind harsche Reaktionsbedingungen von Nachteil. Schema 9: Das Schema wurde aus der Literatur[48] entnommen und modifiziert. Eine Alternative dazu ist die Hydrozirkonierung von Alkinen mit anschließender Metall- katalysierter Kreuzkupplung. 1.4 Hydrozirkonierungen Die Hydrozirkonierung ist eine der meist genutzten und vielseitigsten Synthesemethoden der Organometallchemie.[49,50] Die Darstellung von Zirkoniumorganylen erfolgt meist mit Hilfe des Schwartz-Reagenzes Cp2Zr(H)Cl 42. Die geringe Nukleophilie von 42 ist eine Folge der Abschirmung der Cyclopentadienyl-Liganden und ermöglicht eine hohe Toleranz gegenüber funktioneller Gruppen.[49,50] Wailes und Waigold[51] beschrieben erstmals 1970 die Isolierung des Schwartz-Reagenzes 42 durch Reduktion von Cp2ZrCl2 43 mit LiAlH(OtBu) als Hydridquelle. Kurze Zeit später veröffentlichte Schwartz[52] die Darstellung von 42 mittels Natrium-bis(2-methoxyethoxy)-aluminiumhydrid (Red-Al) und zeigte vielfältigen Anwendungsbereiche, was zur Namensgebung des Metallorganyls 42 führte. Heutzutage wird allerdings meist die Synthesemethode nach Buchwald[53] zu Darstellung von 42 verwendet, bei 13 der Cp2ZrCl2 43 mit LiAlH4 reduziert wird (Schema 10). Als Reinsubstanz liegt das Schwartz- Reagenz 42 als Dimer vor, während in Lösung die monomere Form vorherrscht. Aufgrund seiner hohen Reaktivität ist das Monomer 42 feuchtigkeits- und luftempfindlich.[50] Schema 10 Mittels des 16-Elektronen-Komplexes 42 reagieren Alkene und Alkine zu stabilen Alkyl- und Alkenyl-Zwischenstufen. Dabei erfolgt die Additionsreaktion stets syn-selektiv und aufgrund der großen Cyclopentadienyl-Liganden an der terminalen Position.[50] Beispielsweise setzte Negishi[54,55] das Alkin 44 zur Alkenylzirkonocen-Zwischenstufe 45 um (Schema 11). Durch Reaktion mit 46 konnte der Ester 47 in 90 % Ausbeute isoliert werden. Schema 11 Die aus der Hydrozirkonierung resultierenden Alkenylzirkonocene können in einer Vielzahl an Folgereaktionen weiter umgesetzt werden. So hydrozirkonierte Wipf[56] das Alkin 48 im Rahmen der Naturstoffsynthese von Nisamycin 51. Durch anschließende Zn- 14 vermittelte Transmetallierung und Kupplung mit dem Aldehyd 49 konnte der Alkohhol 50 in 44 % Ausbeute erhalten werden (Schema 12). Schema 12 Neben der Transmetallierung gehören Ni- oder Pd-katalysierte Kreuzkupplungen zu den relevantesten Folgereaktionen der Alkenyl-Zwischenstufen.[49,50] Beispielsweise untersuchte Cox[57] die Darstellung von Enon 55 durch Hydrozirkonierung und anschließender Pd- katalysierter Kreuzkupplung mit dem Säurechlorid 54 (Schema 13). Schema 13 15 Dazu wurde das terminale Alkin 52 mit dem Schwartz-Reagenz 42 hydrozirkoniert und durch Kreuzkupplung mit Pd(PPh3)Cl2 als Katalysator zum gewünschten Produkt 55 umgesetzt. Die Produktbildung von 55, als auch die Bildung der Nebenprodukte 56,57, begründete Cox[57] durch folgende mechanistische Hypothese (Schema 14). Schema 14 Durch Transmetallierung von 2 Äquiv. des Alkenylzirkonocens 53 erfolgt vermutlich die Aktivierung des Pd-Katalysators Pd(PPh3)2Cl2. Die anschließende reduktive Eliminierung führt zum aktiven Pd(0)-Katalysator, wobei als Nebenprodukt das Dien 57 gebildet wird. Die oxidative Addition von Pd0(PPh3)2L2 (L = Ligand) mit dem Säurechlorid 54 bildet das Acyl- Palladium 59, welches durch erneute Transmetallierung mit 53 zum Intermediat 60 führt. Die Bildung des gewünschten Produkts 55 erfolgt durch Transmetallierung, wodurch der aktive Pd(0)-Komplex regeneriert wird. Das zweite Nebenprodukt 56 ist das Ergebnis der Reaktion von Vinylzirkonocen 53 mit dem Enon 55. Die Reaktionssequenz aus Hydrozirkonierung mittels Schwartz-Reagenz 42 und anschließender Kreuzkupplung zeichnet sich durch milde Reaktionsbedingungen und Toleranz gegenüber funktioneller Gruppen aus.[49,50,54,57] Somit könnte diese Methode ein vielversprechender Ansatz zur Darstellung von (2E,4E)-Dienonen sein. 17 2 Aufgabenstellung Weltweit ist Malaria eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten.[58] Vor allem in Afrika, Asien und Südamerika tritt die von Plasmodien ausgelöste Krankheit auf, wobei in etwa 40 % der Weltbevölkerung in Malaria-Endemiegebieten lebt. Auch in Südeuropa bricht die Krankheit wieder vermehrt aus. Die größte Gefahr liegt heutzutage in der zunehmenden Resistenz des Malaria-Parasiten gegenüber herkömmlichen Wirkstoffen wie Artemisinin 4 oder Chloroquin 2, wodurch die Entwicklung neuer Wirkstoffe unerlässlich ist.[2,19] Eine geeignete Leitstruktur könnte Samroiyotmycin A syn,syn-7a sein, das in ersten Tests antiplasmodiale Aktivität gegen den multi-resistenten Stamm Plasmodium falciparum K1 zeigte (Schema 15).[59] Der Naturstoff syn,syn-7a weist Oxazol-Gruppen (rot markiert), Dienon-Einheiten (blau markiert) und eine C2-Symmetrie auf. Die erste Totalsynthese stellte Hulme[30] 2021 vor, jedoch wurden bisher keine tiefergehenden biologischen Untersuchungen durchgeführt. Eine alternative Synthesestrategie wurde von Schmid[32] etabliert. Schema 15 In dieser Arbeit sollte die Syntheseroute von Schmid[32] hinsichtlich der diastereomerenreinen Darstellung von Samroiyotmycin A syn,syn-7a, sowie der Optimierbarkeit und der Reproduzierbarkeit der Syntheseroute untersucht werden. Zudem sollte der Zugang zu Derivaten und Analoga von syn,syn-7a, wie beispielsweise durch Variation der Oxazol-Gruppe, etabliert werden. Biologische Tests sollten erste Einblicke in die Struktur- Aktivitäts-Beziehungen ermöglichen. Darüber hinaus ist die Dienon-Einheit (wie in syn,syn-7a blau markiert) ein häufiges Strukturmotiv in Naturstoffen. Eine Reaktionssequenz bestehend aus Hydrozirkonierung mittels Schwartz-Reagenz 42 und Pd-katalysierter Kreuzkupplung könnte einen neuen Ansatz 18 zur Synthese von (2E,4E)-Dienonen liefern (Schema 16). Ausgehend von substituierten (E)-Enonen und Acylchloriden, sollte diese Synthesemethode untersucht werden. Schema 16 19 3 Synthese von Samroiyotmycin A syn,syn-(7a) und Samroiyotmycin-Derivaten 3.1 Syntheseplanung zu Samroiyotmycin A syn,syn-(7a) in Anlehnung an Vorarbeiten Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem synthetischen Ansatz von Schmid[32] zur Darstellung von Samroiyotmycin A syn,syn-7a (Schema 17, vgl. Kapitel 1.2). Schema 17 20 Durch Optimierung der Syntheseroute sollte der Naturstoff syn,syn-7a isomerenrein isoliert werden, um nachfolgend biologische Untersuchungen an multi-resistenten Malaria- Parasiten zu ermöglichen. Das unnatürliche anti,anti-7a sollte dabei durch die gleiche Syntheseroute hergestellt und biologisch untersucht werden. Wie die Literatur[60] zeigt, ist gerade bei invertierten Stereozentren der Vergleich der biologischen Aktivität von natürlichen und unnatürlichen Naturstoffen besonders interessant, um Hinweise auf den Wirkmechanismus zu geben.[60] Im 1. Schritt sollte der Oxazol-Substituent (rot markiert) durch Reaktion von 5-Methyl-tosyl-oxazol 28 mit (R)-2-Methylhex-5-enal 27 eingeführt und das entstehende Diastereomerengemisch syn-61 und anti-61 getrennt werden. In Anlehnung an Schmid[32] sollte zuvor die Methylgruppe an Position 2 in 27 stereoselektiv synthetisiert werden. Die Dienon- Funktionalität (blau markiert) sollte anschließend durch Grubbs II-katalysierte Kreuzmetathese mit Sorbinsäure 25 eingeführt und die entstehenden Tosyl-geschützten seco-Säuren syn-62 und anti-62 durch Detosylierung entschützt werden. Da die Synthese des Naturstoffs syn,syn-7a bisher nicht gelang,[32] sollten in einem letzten Schritt durch Yamaguchi-Makrolaktonisierung das gewünschte Samroiyotmycin A syn,syn-7a und das Derivat anti,anti-7a dargestellt werden. Weitere Derivate wie zum Beispiel die Tosyl-geschützten syn,syn-63 und anti,anti-63 sollten darüber hinaus zugänglich gemacht werden. 3.2 Synthese von (R)-2-Methylhex-5-enal (27) Der Aldehyd (R)-2-Methylhex-5-enal 27 stellte die erste Zielstruktur der Syntheseroute zu Samroiyotmycin A syn,syn-7a dar. Durch vorherige α-Alkylierung sollte die Methylgruppe in 27 zuvor stereoselektiv eingeführt werden. In Vorarbeiten[32,61] wurde deshalb das SuperQuat- Auxiliar 64 ausgewählt, welches die stereoselektive Methylierung ermöglicht und bereits in vielen Naturstoffsynthesen Anwendung fand.[62–64] Da Evans-Auxiliare durch einfache Synthese ausgehend von Aminosäuren zugänglich sind, wurde in Anlehnung an Davies[65,66] D-Valin 65 in 4 Stufen zu 64 umgesetzt (Schema 18). Dazu wurde 65 in Methanol gelöst und mit Thionylchlorid zum entsprechenden Aminhydrochlorid 66 in einer Ausbeute von 99 % umgesetzt. Anschließend wurde der Ester 66 in Ethanol gelöst und bei 0 °C langsam mit Natriumhydrogencarbonat und Di-tert- butyldicarbonat versetzt. Nach 48-stündiger Reaktion bei Raumtemperatur konnte durch Aufarbeitung das N-Boc-geschützte Produkt 67 in 71 % Ausbeute erhalten werden. Die Verluste in der Ausbeute traten während der Aufarbeitung, aufgrund der schwierigen Auftrennung der gel-artigen Mischung aus Produkt 67 und den ausgefallenen Salzen, auf. Das 21 Amin 67 wurde weiter in einer doppelten Grignard-Reaktion zum sekundären Alkohol 68 umgesetzt. Zuvor wurde das Grignard-Reagenz Methylmagnesiumiodid durch langsames Zutropfen von Methyliodid zu Mg-Spänen in Diethylether dargestellt. Durch anschließende Reaktion mit 67 konnte das gewünschte Produkt 68 in einer Ausbeute von 90 % erhalten werden. Der abschließende Ringschluss zum Auxiliar 64 erfolgte durch Deprotonierung mit der sterisch anspruchsvollen Base Kalium-tert-butanolat in THF bei 0 °C und dem Angriff des entstehenden Alkoholats unter Abspaltung der Schutzgruppe. Umkristallisation mit Petrolether ergab das Oxazolidin 64 in einer Ausbeute von 93 %. Das SuperQuat-Auxiliar 64 konnte somit über 4 Stufen in einer Gesamtausbeute von 60 % dargestellt werden. Schema 18 In einem nächsten Schritt sollte 64 mit der Hexensäure 70 gekoppelt werden. Zwar ist 70 auch kommerziell erhältlich, wurde aber aufgrund des hohen Preises nach einer Vorschrift von Wicha,[67] ausgehend von Cyclohexanon 69 dargestellt (Schema 19). Dazu wurde 69 in Methanol gelöst und bei 0 °C langsam mit 30 %iger Wasserstoffperoxid-Lösung versetzt. Das in situ entstehenden Hydroperoxycyclohexanol wurde durch sehr langsames Zutropfen in eine wässrige Lösung aus FeSO4 und CuSO4 bei 0 °C radikalisch zur Hexensäure 70 gespalten. Dabei spielten die Zutropfgeschwindigkeit und die niedrige Temperatur eine entscheidende Rolle, um Verluste in der Ausbeute zu vermeiden. Nach alkalischer und anschließend saurer Aufarbeitung und nachfolgender Destillation konnte 70 als farbloses Öl in 16 % Ausbeute erhalten werden. 22 Um die Hexensäure 70 und das SuperQuat-Auxiliar 64 zu koppeln, wurden in Anlehnung an O’Hagan[68] die Edukte 70 und 64 getrennt voneinander aktiviert. Zunächst wurde 70 in THF gelöst und bei 0 °C mit Pivaloylchlorid versetzt. Durch Deprotonierung mit Triethylamin wurde 70 in ein gemischtes Anhydrid überführt. In einem separaten Kolben wurde 64 bei -78 °C mit n-BuLi langsam versetzt. Nach 30 min wurde das deprotonierte Oxazolidinon 64 zur Anhydrid- Reaktionslösung gegeben und für weitere 90 min gerührt. Durch säulenchromatographische Aufarbeitung konnte das gewünschte Kopplungsprodukt 71 mit einer Ausbeute von 93 % erhalten werden. Schema 19 Aufgrund des sterischen Anspruchs des gekoppelten Auxiliars konnte anschließend stereoselektiv alkyliert werden. Dazu wurde Oxazolidinon 71 in THF gelöst und bei -78 °C mit Natrium-bis(trimethylsilyl)amid in α-Position deprotoniert und Methyliodid zugegeben. Nach 3 h Reaktionszeit konnte das methylierte 72 in einer Ausbeute von 53 % und einer (R)-Diastereoselektivität von 100 : 0 (1H-NMR) isoliert werden. Im nächsten Schritt wurde N-Acetyl-Oxazolidinon 72 mittels Lithiumaluminiumhydrid bei 0 °C reduziert. Der primäre Alkohol 73 konnte dabei nach säulenchromatographischer Aufreinigung in einer Ausbeute von 69 % isoliert werden. 23 Abschließend wurde durch eine Ley-Griffith-Oxidation der gewünschte (R)-Aldehyd 27 synthetisiert. Dabei diente Tetrapropylammoniumperruthenat (TPAP) als Katalysator und eine stöchiometrische Menge an N-Methylmorpholin-N-oxid (NMO) als Oxidans. Mittels Molsieb (3 Å) wurde das freiwerdende Wasser abgefangen. Nach einer Vorschrift von Omura[69] wurde in einem gut ausgeheizten Schlenkkolben NMO in Dichlormethan gelöst, der primäre Alkohol 73 zugegeben und nach kurzer Reaktionszeit mit TPAP versetzt. Nach 24 h konnte das gewünschte (R)-2-Methylhex-5-enal 27 in einer Ausbeute von 99 % erhalten werden. Allerdings gestaltete sich die Isolierung des Aldehyds 27 aufgrund der ausgeprägten Flüchtigkeit als schwierig. Letzte Lösungsmittelreste konnten ohne größere Verluste in der Ausbeute schlecht vom Produkt 27 abgetrennt werden. Zudem zersetzte sich 27 nach wenigen Stunden, wodurch eine schnelle Umsetzung zu Tosyl-Oxazol 61 erfolgen musste. 3.3 Synthese von Tosyl-Oxazol (61) Nachdem der Aldehyd (R)-2-Methylhex-5-enal 27 erfolgreich dargestellt werden konnte, sollte nun die Oxazol-Funktionalität in den Naturstoff-Baustein eingeführt werden. Schmid[32] gelang die Synthese von Tosyl-Oxazolylalkohol 61 durch zwei unterschiedliche Herangehensweisen (Schema 20). Schema 20 24 Zum einen wurde Aldehyd 27 mit 5-Methyl-4-tosyl-oxazol 28 zum gewünschten Oxazolylalkohol 61 in 62 % Ausbeute (über 3 Stufen) gekoppelt (Schema 20, Methode A). Zum anderen wurde durch eine Substitutionsreaktion Oxazol 28 direkt mit 72 zu Keton 74 umgesetzt. Durch Reduktion mit Natriumborhydrid wurde der Alkohol 61 in einer Ausbeute von 54 % (über 2 Stufen) dargestellt (Methode B). In Anlehnung an Schmid[32] erfolgte die Darstellung des Oxazolylalkohols 61 zunächst nach Methode A. Dazu wurde für die Kopplung mit Aldehyd 27 als erstes analog zu Addie und Taylor[70] die Eduktsynthese von 5-Metyhl-4-tosyl-oxazol 28 durchgeführt (Schema 21). Im Gegensatz zu anderen Oxazol-Einheiten, trägt in 28 die Tosyl-Schützung zur Stabilität der Oxazol-Gruppe bei. In der Reaktion zu 28 wurde zunächst Tosyl-Methylisocyanid TosMIC 76 in abs. THF gelöst und bei -78 °C mit n-BuLi versetzt. Nach 15 min wurde Essigsäureanhydrid 75 zugegeben und auf Raumtemperatur erwärmt. Das gewünschte Produkt 28 konnte nach der Aufarbeitung in einer Ausbeute von 96 % isoliert werden. Schema 21 In einem nächsten Schritt wurde in Anlehnung an Schmid[32] die Kopplung des synthetisierten 28 mit dem Aldehyd 27 untersucht. Dazu wurde das Oxazol 28 in abs. THF gelöst und bei -78 °C mit n-BuLi (2 Äquiv.) versetzt (Schema 22). Schema 22 Nach 30 min wurde 27 zugegeben und 1 h bei gleichbleibender Temperatur gerührt. Anschließend wurde das Kältebad entfernt und nach 1 h Reaktionszeit bei Raumtemperatur aufgearbeitet. Jedoch konnte im Gegensatz zu Schmid[32] (70 %) nur eine Ausbeute von 27 % erhalten werden. Auch in weiteren Versuchen mit gleicher Durchführung konnten nur 25 26 – 30 % des Produkts 61 isoliert werden. Die Diastereomere 61 wurden dabei in einem Diastereomerenverhältnis von dr (syn-61 / anti-61) = 59 : 41 (1H-NMR) erhalten. Vor der säulenchromatographischen Aufreinigung lag das Rohprodukt 61 als schwarzer, zäher Sumpf vor, der auf die Bildung von Nebenprodukten, wie beispielsweise durch Ringöffnung oder Dimerisierung, hindeutete.[71,72] Addie und Taylor[70] zeigten in Deuterierungsexperimenten, dass in 5-Metyhl-4-tosyl-oxazol 28 die azideste Stelle die Position 2 ist (Schema 23). Erst durch Deprotonierung mit einem weiteren Äquivalent an Base wird 28 an der Position 6 deprotoniert. Das Zwischenprodukt 77 kann im weiteren Verlauf der Reaktion mit einem Elektrophil (E+) wie Benzaldehyd oder Allyliodid reagieren. In entsprechenden Experimenten wurde außerdem festgestellt, dass an der Position 2 keine Reaktion erfolgte.[70] Nichtsdestotrotz reagierte das Dianion 77 mit beispielsweise Chlorameisensäuremethylester oder Benzoylchlorid zu untrennbaren Mulitkomponenten- Mischungen. Die Ergebnisse zeigen, dass je nach Substrat sowohl Position 6 als auch Position 2 in 28 reaktiv sind und so zu Nebenprodukten führen können. Schema 23 Um die Bildung der Nebenprodukte zu unterdrücken, wurde die Reaktion in weiteren Experimenten hinsichtlich Reaktionszeit der Deprotonierung, der Kopplung, sowie der Reaktionstemperatur untersucht (Tabelle 1). Beispielsweise wurde in einem ersten Experiment die Reaktionszeit der Deprotonierung auf nur 5 min reduziert. Durch direktes Abfangen der dilithiierten Spezies 77 sollte so die Dimerisierung verhindert werden (Tabelle 1, Eintrag 1). Allerdings reduzierte sich damit die Ausbeute auf 12 %. Deswegen wurde als nächstes versucht, durch eine längere Reaktionszeit die vollständige zweifache Lithiierung zu gewährleisten (Eintrag 2). Die Deprotonierung von 28 in 60 min und anschließende Kopplung mit dem Aldehyd 27 lieferte 61 zwar in 36 %, jedoch steigerte sich die Ausbeute im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen (Schema 22, 26 – 30 %) nur geringfügig. Eine weitere Erklärung für die geringen Ausbeuten könnte sein, dass aufgrund der hohen Reaktivität eine zu schnelle Zugabe des Aldehyds 27 zu Nebenprodukten führte. Um das zu 26 umgehen, wurde in einem nächsten Experiment 28 deprotoniert und anschließend 27 sehr langsam innerhalb von 3 h zugetropft (Eintrag 3). Auch hier konnten nur 37 % des gewünschten Produktes 61 isoliert werden. Tabelle 1: Untersuchung der Kopplungsreaktion von Aldehyd 27 mit Oxazol 28 durch Variation der Reaktionsbedingungen. Eintrag n-BuLi (Äquiv.) Zeit Deprotonierung [min] Zeit Kopplung [h] Ausbeute [%] 1 2 5 2 12 2 2 60 2 36 3 2 30 2 [b] 37 4 2 30 2 [c] 15 5 2 30 2 [d] 34 6 2 30 4 24 7 2.2 30 2 14 [a] dr bestimmt mittels 1H-NMR. [b] Zugabe Aldehyd über 3 h. [c] Aldehyd gelöst in 5 mL [a] abs. THF.[d] Aufwärmen von -78 °C → RT innerhalb von 4 h. Damit die Reaktivität von 28 noch weiter gesenkt werden konnte, wurde der Aldehyd 27 vor der Zugabe zu 28 in 5 mL abs. THF gelöst (Eintrag 4). Allerdings sank die Ausbeute in diesem Versuch auf nur 15 %. Um daher eine möglichst selektive Reaktion mit 28 zu ermöglichen, wurde als nächstes nach der Zugabe von 27 sehr langsam erwärmt (Eintrag 5). Dafür wurde das Kältebad mit Aluminiumfolie bedeckt, welches zusammen mit dem Reaktionskolben innerhalb von 4 h von -78 °C auf Raumtemperatur aufgetaut wurde. Allerdings konnte die Ausbeute von 61 mit 34 % nicht gesteigert werden. Auch eine Verlängerung der Reaktionszeit der Kopplungsreaktion war nicht erfolgreich (Eintrag 6, 61 24 %). In einem letzten Optimierungsversuch wurde ein Überschuss an n-BuLi eingesetzt, um eine zweifache Deprotonierung von 28 sicher zu gewährleisten, allerdings war dieser Versuch ebenfalls nicht erfolgreich (Eintrag 7, 61 14 %). 27 In der Synthese von Oxazolylalohol 61 konnten nach der in Schema 20 gezeigten Methode A keine zufriedenstellenden Ausbeuten erhalten werden. Deshalb wurde in den weiteren Experimenten die Synthese von 61 nach Methode B untersucht (Tabelle 2). Ein Vorteil dieser Methode B ist die Verkürzung der Syntheseroute zum Naturstoff syn,syn-7a durch direkte Kopplung von N-Acetyl-Oxazolidinon 72 mit dem Oxazol 28. Außerdem kann so die Synthese des Aldehyds 27 vermieden werden, der durch seine hohe Flüchtigkeit und Instabilität die weitere Umsetzung erschwerte. Nach Methode B (Schema 20) wurde in Anlehnung an Schmid[32] Tosyl-Oxazol 28 (4 Äquiv.) in abs. THF gelöst, auf -78 °C gekühlt und tropfenweise mit n-BuLi versetzt (Tabelle 2, Eintrag 1). Die Reaktionsmischung wurde für 1 h bei gleicher Temperatur gerührt und anschließend N-Acetyl-Oxazolidinon 72 (1 Äquiv.), gelöst in abs. THF, langsam zugegeben. Die Reaktion wurde eine weitere Stunde bei -78 °C gerührt und das Kältebad anschließend entfernt. Als nach 1 h Reaktion bei Raumtemperatur aufgearbeitet wurde, deutete jedoch auch hier das schwarze und zähflüssige Rohprodukt 74 auf die Bildung von Nebenprodukten, z. B. durch Ringöffnung des Oxazol-Substituenten, hin. Durch die säulenchromatographische Aufreinigung konnten nur Spuren von Oxazol 74 im 1H-NMR-Spektrum detektiert werden. Das Edukt 72 wurde in 54 % Ausbeute reisoliert. Tabelle 2: Untersuchung der Kopplungsreaktion von N-Acetyl-Oxazolidinon 72 mit Oxazol 28. Eintrag Additiv Zeit [h] Erwärmung Kopplung (-78 °C → RT) Ausbeute 74 [%] 1 - - 0 % (Spuren) 2 TMEDA - 0 % (Spuren) 3 LiCl - 0 % (Spuren) 4 - 4 0 % (Spuren) 5 - 18 21 – 56 % Um die Bildung der Nebenprodukte zu unterdrücken, wurde in einem nächsten Experiment versucht, durch Tetramethylethylendiamin (TMEDA) die Reaktivität von n-BuLi zu erhöhen. 28 Shafer[72] untersuchte die Synthese von 5-substituierten Oxazolen 82 durch gezielte Alkylierung (Schema 24). Dabei wurde festgestellt, dass die optimalen Reaktionsbedingung TMEDA zur Aktivierung von n-BuLi benötigten. So konnte die Ausbeute der Reaktion von Oxazol 79 mit Benzaldehyd 81 von 50 % auf 84 % gesteigert werden.[72] Schema 24 In Anlehnung an die Vorschrift von Shafer[72] wurde Oxazol 28 und TMEDA (10 Äquiv.) in abs. THF gelöst, n-BuLi langsam zugetropft und die Reaktionsmischung für 1 h gerührt (Eintrag 2). Anschließend wurde 72, gelöst in abs. THF, zugegeben und die Reaktion analog zum vorherigen Versuch fortgeführt. Allerdings konnten auch hier nur Spuren des Produktes 74 im 1H-NMR-Spektrum erhalten werden. Da die Aktivierung der Base durch TMEDA nicht erfolgreich war, wurde in einem nächsten Experiment die Aktivierung des Substrats 72 durch die Verwendung von wasserfreiem Lithiumchlorid als Additiv untersucht (Eintrag 3). Jedoch konnte auch hier kein Produkt 74 isoliert werden. In den vorhergehenden Kopplungs-Versuchen von Aldehyd 27 mit 28 konnte durch längere Reaktionszeit bei tiefen Temperaturen, als auch bei Raumtemperatur keine Steigerung der Ausbeute erzielt werden. Jedoch gelang es, die Ausbeute durch das langsame Auftauen der Reaktion von -78 °C auf Raumtemperatur und die langsame Zugabe des Aldehyds 27 zu optimieren. Diese Strategie wurde in den nächsten Versuchen auf die direkte Kopplung von 72 mit 28 angewendet (Eintrag 4 und 5). Dafür wurde das Kältebad nach Zugabe von 72 mit Aluminiumfolie bedeckt und zusammen mit dem Reaktionskolben innerhalb von 4 h aufgetaut, allerdings konnten auch hier nur Spuren des Produkts 74 erhalten werden (Eintrag 4). Wurde die Zeitspanne, in der die Reaktion auftaute, von 4 h auf 18 h erhöht, gelang es, die Ausbeute auf bis zu 56 % zu steigern (Eintrag 5). So zeigte sich, dass ein zu schnelles Auftauen der Reaktionslösung zur Zersetzung der Edukte 72 und 28 führte. Ein Grund hierfür war möglicherweise die hohe Reaktivität der Substrate. 29 Nach erfolgreicher Darstellung des Oxazols 74 wurde die Reduktion mit Natriumborhydrid zum gewünschten Oxazolylalkohol 61 untersucht (Schema 25). Dazu wurde das Keton 74 in abs. THF gelöst und bei 0 °C mit Natriumborhydrid versetzt. Nach der säulenchromatograpischen Aufreinigung konnten 77 % des Produktes 61 in einem Diastereomerenverhätnis von dr (syn-61 / anti-61) = 54 : 46 (1H-NMR) erhalten werden. Die Trennung der Diastereomere syn-61 und anti-61 erfolgte durch präparative HPLC mittels einer Refill-Säule Orbit 100 Sil 5 µm (250 x 20 mm). Da die stationäre Phase der Säule frisch erneuert wurde, konnten die Bedingungen von Schmid[32] nicht direkt übernommen werden. Beispielsweise wurde die Flussrate auf 12 mLmin-1 erhöht. Außerdem wurde ein Laufmittel-Gradient von Petrolether / EtOAc 75 : 25 auf 60 : 40 verwendet, um die Überlagerung der Peaks zu vermeiden. So konnte nach Rt = 39.5 min syn-61 in 42 % und nach Rt = 45.0 min anti-61 in 35 % Ausbeute erhalten werden. Schema 25 Vor allem die unsubstituierte C-2-Position der Oxazol-Einheit zeigte sich verantwortlich für die einzigartige Reaktivität des Substituenten und damit für die herausfordernde Darstellung der sekundären Alkohole syn-61 und anti-61. 30 3.4 Untersuchung der Trennung der Diastereomere syn-(61) und anti-(61) durch kinetische Racematspaltung In einer Reihe von Experimenten untersuchte Schmid[32] die stereoselektive Reduktion des Ketons 74 zu syn-61 (Schema 26). Allerdings konnte bisher das stereogene Zentrum an C-2 des Oxazolylalohols 61 durch synthetische Methoden wie asymmetrische Reduktionen mit L-Selectrid[73] (Schema 26, Methode A), Corey-Bakshi-Shibata-Reduktion (CBS- Reduktion)[74] (Methode B) oder asymmetrische Hydrierung nach Noyori[75] (Methode C) nicht festgelegt werden. Schema 26 Ein enzymatischer Ansatz wurde bisher nicht verfolgt. Deshalb wurde in Zusammenarbeit mit Sandy Eutionnat[76] im Rahmen dieser Arbeit die kinetische Racematspaltung von 61 untersucht. Vor allem in der Naturstoffsynthese ist die Darstellung von isomerenreinen chiralen Vorstufen von größter Bedeutung.[60] Dabei erfreut sich die Biokatalyse als alternativer Ansatz zu konventionellen chemischen Prozessen zunehmender Beliebtheit.[77–79] Hierbei sind Lipasen eine der am meisten verwendeten Enzyme zur Synthese von sekundären Alkoholen oder Aminen durch kinetische Racematspaltung.[77,80,81] Eine hohe Regio-, Chemo- und Enantioselektivität wird in Wasser, organischen Lösungsmitteln oder Ionischen Flüssigkeiten erzielt, ohne dass dabei Co-Faktoren benötigt werden. So können chirale Alkohole durch Lipase-katalysierte Racematspaltung mittels Veresterung oder Umesterung mit Acyl-Donoren und anschließender Hydrolyse dargestellt werden.[82,83] Beispielsweise untersuchte Kamal[84] die kinetische Racematspaltung mittels Umesterung von Vinylacetat 84 mit 3-Hydroxy-3-(2-thienyl)propannitril 83 (Schema 27). Dabei wurden unterschiedliche Lipasen in freier und immobilisierter Form verwendet, wie Pseudomonas cepacia 31 (PS-D) oder Candida rugosa (CRL). Als Vorstufe des Antidepressivums Duloxetin 87 wurde das Enantiomer (S)-85 in 4 Stufen zum Wirkstoff 87 weiter umgesetzt. Schema 27 Kucher[85] untersuchte die kinetische Racematspaltung von Heteroarylethanolen und setzte erfolgreich Substrat 87 mit Vinylacetat 84 unter Verwendung der Lipase Pseudomonas cepacia und Methyl-tert-butylether (MTBE) als Lösungsmittel um (Schema 28). Bei einem Umsatz von 52 % konnte er (S)-89 in 42 % Ausbeute und einem 98 %ee erhalten. Schema 28 Dieser biokatalytische Ansatz sollte mit einer Vorgehensweise aus der Literatur[81,85–87] auf das Diastereomerengemisch 61 übertragen werden (Tabelle 3). Das anti-Diastereomer anti-61 sollte dabei mit Vinylacetat 84 acyliert werden, während das syn-Diastereomer syn-61 nicht reagieren sollte. Durch Hydrolyse sollte anti-61 regeneriert werden. Für das Screening unterschiedlicher Lipasen wurde 61 in Toluol gelöst und mit Vinylacetat 84 und der entsprechenden Lipase versetzt. In Anlehnung an die Literatur wurden 32 Burkholderia cepacia (Lipase PS Amano),[81,84,85] Candida rugosa (Lipase AY Amano)[82–84] und Aspergillus Niger (Lipase AP6 Amano)[83] als geeignete Lipasen ausgewählt. Die Reaktionsmischung wurde für 20 h intensiv gerührt und anschließend aufgearbeitet. Allerdings konnte in keinem Experiment die gewünschten Produkte syn-61 und anti-91 erhalten werden (Tabelle 3, Eintrag 1 – 3). Tabelle 3: Untersuchung der kinetischen Racematspaltung von 61 durch verschiedene Lipasen: Burkholderia cepacia (PS), Candida rugosa (AY) und Aspergillus Niger (AP6). Eintrag Lipase Lösungsmittel Zeit [h] Ausbeute syn-61 [%] Ausbeute anti-91 [%] 1 PS Toluol 20 0 [a] 0 [a] 2 AY Toluol 20 0 [a] 0 [a] 3 AP6 Toluol 20 0 [a] 0 [a] 4 PS MTBE 20 0 [a] 0 [a] 5 AY MTBE 20 0 [a] 0 [a] 6 AP6 MTBE 20 0 [a] 0 [a] 7 PS Toluol 48 0 [a] 0 [a] 8 PS MTBE 48 0 [a] 0 [a] [a] Edukt vollständig reisoliert Auch die Verwendung von MTBE als Lösungsmittel war nicht erfolgreich, da nach der Aufreinigung mittels HPLC nur das Edukt 61 vollständig reisoliert werden konnte (Eintrag 4 - 6). Im Falle von Burkholderia cepacia (PS) wurde zudem eine längere Reaktionszeit von 48 h sowohl in Toluol als auch in MTBE getestet, allerdings konnte auch hier kein Umsatz beobachtet werden (Eintrag 7 und 8). Da die bisherigen Versuche mit Vinylacetat 84 nicht zufriedenstellend waren, wurde in einem nächsten Experiment eine Alternative zum Acyl-Donor untersucht. Beispielsweise zyklische Anhydride wie Bernsteinsäureanhydrid 93 haben den Vorteil, dass durch einfache 33 flüssig-flüssig Extraktion die gebildete Carbonsäure vom Substrat abgetrennt werden können.[87,88] Stürmer[87] entwickelte so eine Methode, in der 3-Chlor-1-(2-thienyl)propan-1- ol 92 mit 93 in MTBE und der Lipase Burkholderia plantarii umgesetzt wurde (Schema 29). Schema 29 In Anlehnung dazu[87] wurde 61 in MTBE gelöst und bei Raumtemperatur für 20 h intensiv gerührt (Schema 30). Anschließend wurde wässrig aufgearbeitet, allerdings wurde auch hier das Edukt 61 vollständig reisoliert. Im 1H-NMR-Spektrum konnten keine Signale von anti-96 detektiert werden. Schema 30 Möglicherweise könnte durch den großen räumlichen Anspruch der Tosyl-Schutzgruppe in 61 eine Reaktion mit einer Lipase sterisch gehindert sein. Da die bisherigen Ergebnisse keinen Erfolg zeigten, wurde der Ansatz der kinetischen Racematspaltung verworfen. 34 3.5 Synthese der seco-Säuren syn-(62) und anti-(62) durch Grubbs- Metathese Nachdem der Tosyl-Oxazolylalkohol 61 erfolgreich dargestellt wurde und die Diastereomere syn-61 und anti-61 durch Trennung mittels präparativer HPLC isomerenrein erhalten werden konnten, wurde als nächstes die Synthese zu den entsprechenden seco-Säuren syn-62 und anti-62 untersucht. Schmid[32] setzte dazu syn-61 und anti-61 mit Sorbinsäure 25 durch Grubbs-II-katalysierte Kreuzmetathese um (Schema 31). Schema 31 Dabei stellte er fest, dass die Reaktion ohne die Tosyl-Schützung des Oxazols nicht erfolgreich war.[32] Zwar wurden Kreuzmetathesen mit Oxazol-Funktionalitäten in der Literatur[89,90] eingehend untersucht, allerdings war eine geschützte 2-Position obligatorisch für das Gelingen der Reaktion. Es wurde angenommen, dass die strukturelle Ähnlichkeit des ungeschützten Oxazols zu NHC-Liganden zu einer Beeinflussung der Metathese durch Interaktion mit dem Katalysator führte.[91] Außerdem setzte Schmid[32] 2 Äquiv. der Sorbinsäure 25 ein, um etwaige Homokopplungsprodukte des Alkohols 61 zu vermeiden. In Anlehnung dazu[32] sollte syn-61 und anti-61 jeweils separat in einer Grubbs-II- katalysierte Kreuzmetathese untersucht werden. Deshalb wurde zunächst nach einer Vorschrift von Ceroni[92] die Sorbinsäure 25 in 3 Stufen dargestellt (Schema 32). In einer Reformatzky- Reaktion wurde Crotonaldeyd 97 und 2-Brompropansäuremethylester 98 mit aktiviertem Zink in Benzol umgesetzt. Nach der wässrigen Aufarbeitung konnte der 3-Hydroxymethylester 99 in 58 % Ausbeute erhalten werden. Mittels Phosphorpentoxid-Trocknungsmittel auf inertem Trägermaterial wurde der Alkohol 99 innerhalb von 4 h in Chloroform unter Rückfluss 35 dehydratisiert. Das Eliminierungsprodukt 100 konnte dabei nach der Aufarbeitung in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden. Um die Sorbinsäure 25 zu erhalten, wurde Ester 100 nach einer Vorschrift von Liu[93] weiter umgesetzt. Dazu wurde 100 in einer Mischung aus demin. Wasser und THF (1 : 1) gelöst und unter starkem Rühren langsam mit gemörsertem KOH versetzt. Die Diensäure 25 konnte nach der wässrigen Aufarbeitung in einer Ausbeute von 97 % erhalten werden. Das Zielmolekül 25 konnte somit über 3 Stufen und einer Gesamtausbeute von 56 % dargestellt werden. Schema 32 Anschließend wurde die dargestellte Sorbinsäure 25 in Anlehnung an Madduri[32,94] in der Grubbs-II-katalysierten Kreuzmetathese zu Tosyl-Oxazolylalkohol syn-62 und anti-62 weiter umgesetzt (Tabelle 4). Die Diastereomere syn-61 und anti-61 wurden dabei separat untersucht. Dazu wurde syn-61 (Tabelle 4, Eintrag 1) oder anti-61 (Eintrag 2) in Dichlormethan gelöst und mit Diensäure 25 (2 Äquiv.) versetzt. Nach der Zugabe des Grubbs II-Katalysators (2.5 mol%), wurde die Reaktion für 18 h unter Rückfluss erhitzt. Durch Filtration über Kieselgel wurde die Reaktion beendet, allerdings konnten im 1H-NMR-Spektrum des Rohprodukts 62 keine Signale des gewünschten Produkts 62 zugeordnet werden. Auch durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit dem Laufmittelgemisch Petrolether / EtOAc und in einem weiteren Versuch mit MeOH / H2O konnten nur Spuren der seco-Säuren syn-62 und anti-62 erhalten werden. Im Gegensatz dazu konnten in beiden Fällen die Bildung des Homokopplungsprodukt syn,syn-101 und anti,anti-101 der Oxazolylalkohole syn-61 und anti-61 festgestellt werden (Eintrag 1). Schmid[32] konnte die Bildung der Nebenprodukte syn,syn-101 und anti,anti-101 durch die Verwendung von 2 Äquiv. Sorbinsäure 25 unterdrücken. Allerdings war diese Anpassung der Reaktionsbedingungen in diesem Fall nicht erfolgreich, weshalb angenommen wurde, dass Säure 25 aufgrund von Unreinheiten nicht mit syn-61 bzw. anti-61 reagierte. Jedoch auch nach 36 mehreren Schritten zur Aufreinigung der Sorbinsäure 25, beispielsweise durch Säulenchromatographie, war die Kreuzmetathese zu syn-62 und anti-62 nicht erfolgreich. Tabelle 4: Grubbs-II-katalysierte Kreuzmetathese von syn-61 und anti-61 mit Sorbinsäure 25. Eintrag Edukt Grubbs II (mol%) 25 (Äquiv.) Zeit [h] 61 [%] 101 [%] 1 syn-61 2.5 2 18 0 (Spuren) 55 [a] 2 anti-61 2.5 2 18 0 (Spuren) - [b] 3 syn-61 2.5 1 18 0 (Spuren) - [b] 4 anti-61 2.5 1 18 0 (Spuren) - [b] 5 syn-61 2.5 2 40 0 (Spuren) 64 [a] 6 anti-61 2.5 2 40 0 (Spuren) - [b] 7 syn-61 15 2 18 0 (Spuren) 37 [a] 8 anti-61 15 2 18 0 (Spuren) 31 [a] [a] Rohprodukt, nach Abgleich mit Schmid[32] nicht isoliert [b] nicht bestimmt Zudem wurde beobachtet, dass in der Reaktion nach Zugabe des Katalysators und bereits vor dem Erwärmen ein weißer Feststoff ausfiel. Es wurde angenommen, dass durch eine Homokupplung der Säure 25 das Dimer 102 gebildet wurde und 25 somit dem 37 Reaktionsgleichgewicht entzogen wurde (vgl. Schema in Tabelle 4). Dadurch könnte auch die selektive Bildung des Alkohol-Dimers 101 erklärt werden. Deshalb wurden in den nächsten Metathesen die Äquivalente der Diensäure 25 auf 1 Äquiv. reduziert, allerdings auch hier ohne Erfolg (Eintrag 3 und 4). In den nächsten Experimenten wurde der Einfluss der Reaktionszeit auf die Metathese untersucht (Eintrag 5 und 6). Der Umsatz des Edukts syn-61 wurde dabei durch Reaktionskontrolle mittels DC überprüft. Nach 40 h wurde die Reaktion aufgearbeitet, allerdings konnte auch hier nach der säulenchromatographischen Aufarbeitung nur das Oxazolyl-Alkohol-Dimer syn,syn-101 mit einer Ausbeute von 64 % detektiert werden. Es wurde daher angenommen, dass eine längere Reaktionszeit die Dimerisierungs-Reaktion begünstigte. Zuletzt wurde die Reaktion hinsichtlich der Katalysatorladung untersucht. Während Schmid[32] 2.5 mol% des GrubbsII-Katalysators in der Reaktion verwendete, werden in der Literatur[89,94] oft höhere Katalysator-Ladungen von 10 mol% bis nahezu einer stöchiometrische Menge verwendet. Auf Grund dessen wurde in den nächsten Experimenten syn-61 und anti-61 mit der Säure 25 und 15 mol% des Grubbs-II-Katalysators umgesetzt (Eintrag 7 und 8). Jedoch konnten auch in diesen Reaktionen die gewünschten Produkte syn-62 und anti-62 nur in Spuren (1H-NMR) erhalten werden, während die Dimere syn,syn-101 und anti,anti-101 in 37 % und 31 % gebildet wurden. Die Ergebnisse zeigten klar, dass die freie Diensäure 25 in der Reaktion mit syn-61 und anti-61 und dem verwendeten Grubbs-II-Katalysator nicht zu den gewünschten Produkten syn-62 und anti-62 führte. Aus diesem Grund wurde in den weiteren Versuchen der Einfluss der funktionellen Gruppen auf die Kreuzmetathese untersucht. Um mögliche Nebenreaktionen der Säure-Funktionalität in 25 zu vermeiden, wurde zunächst die Methyl-geschütze Vorstufe 100 in der Reaktion eingesetzt (Schema 33). Dazu wurde der Alkohol syn-61 in Dichlormethan gelöst, mit Methylester 100 (2 Äquiv.) und Grubbs-II-Katalysator (15 mol%) versetzt und für 18 h bei 40 °C refluxiert. Nach der säulenchromatographischen Aufarbeitung konnte seco-Säuremethylester syn-103 in 73 % Ausbeute und einem Diastereomerenverhältnis von dr (syn-103 / anti-103) = 100 : 0 (1H-NMR) erfolgreich isoliert werden. In der gleichen Weise konnte anti-61 zu dem gewünschten Produkt anti-103 in 62 % Ausbeute (dr (syn-103 / anti-103) = 0 : 100 (1H-NMR)) umgesetzt werden. Demnach zeigte sich die Methyl-geschützte Carbonsäure 100 38 verantwortlich für den Erfolg der Kreuzmetathese. Neben der Dimerisierung zu 102 ist möglicherweise eine Deaktivierung des Grubbs-II-Katalysators durch die Säure-Gruppe denkbar. Schema 33 Im Hinblick auf die Yamaguchi-Makrolactonisierung zu Samroiyotmycin A syn,syn-7a wurden im Anschluss die tosylierten seco-Säuren syn-62 und anti-62 durch Entschützung der Ester syn-103 und anti-103 dargestellt (Schema 34). Schema 34 Die Verseifungs-Reaktion wurde erneut in Anlehnung an die Vorschrift von Liu[93] durchgeführt. Dazu wurden syn-103 und anti-103 jeweils in einer Mischung aus demin. Wasser und THF (1 : 1) gelöst und unter starkem Rühren langsam mit gemörsertem KOH versetzt. Nach 4 Tagen Reaktionszeit wurde wässrig aufgearbeitet. Die seco-Säuren syn-62 und anti-62 39 konnten durch Aufreinigung mittels HPLC an einer C-18 Reversed-Phase Säule in Ausbeuten von 99 % und 97 % erhalten werden. Die Reaktion mit Sorbinsäuremethylester 100 und dem zusätzlichen Schritt der Entschützung des Methylesters 103 ermöglichten so die Darstellung der seco-Säuren syn-62 und anti-62 in Ausbeuten von 73 % (syn-62, über 2 Stufen, dr (syn-62 / anti-62) = 100 : 0 (1H-NMR)) und 60 % (anti-62, über 2 Stufen, dr (syn-62 / anti-62) = 0 : 100 (1H-NMR)). 3.6 Untersuchungen zur Detosylierung von syn-(62) und anti-(62) Nachdem die Tosyl-geschützten seco-Säuren syn-62 und anti-62 erfolgreich dargestellt werden konnten, sollte nun die Entschützung des Oxazol-Rings erfolgen. Schmid[32] untersuchte die Destosylierung erfolgreich an der Vorstufe 61, musste jedoch feststellen, dass in der folgenden Grubbs-Metathese das entschützte 26 nicht weiter umgesetzt werden konnte. Im Falle der seco-Säuren syn-62 und anti-62 gelang ihm die Detosylierung ohne vorherige Optimierung nach einer Methode in Anlehnung an Addie und Taylor[70] (Schema 35). Schema 35 Hierbei wurde syn-62 und Dinatriumhydrogenphosphat in einer Mischung aus abs. THF und abs. Ethanol (1 : 1) gelöst. Frisch hergestelltes Natriumamalgam (10 % Natrium) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung für 2 h im Ultraschallbad beschallt. Nach erneuter Zugabe von Natriumamalgam (10 % Natrium) und weiterer Beschallung für 2 h wurde wässrig aufgearbeitet. Die entschütze seco-Säure syn-24 wurde in 28 % Ausbeute erhalten. Im Falle von anti-24 wurde nach gleicher Vorgehensweise 68 % Ausbeute erhalten. Natriumamalgam und Dinatriumhydrogenphosphat in Methanol ist eine der beliebtesten Methoden zur reduktiven Desulfonierung.[95] Zwar gelang Schmid[32] die Darstellung der detosylierten seco-Säuren syn-24 und anti-24 in moderaten bis guten Ausbeuten, jedoch war 40 die Verwendung von giftigem Quecksilber in der Durchführung nicht optimal.[96] Deshalb wurden Alternativen zur Tosyl-Entschützung mittels Natriumamalgam gesucht. Allerdings zeigte sich, dass wenige Methoden zur Entschützung von Kohlenstoff-gebundenen Tosyl- Gruppen literaturbekannt waren.[97] Ein Beispiel aus der Literatur für die reduktive Detosylierung ist die Verwendung von Magnesium in abs. Methanol oder abs. Ethanol als Lösungsmittel.[97,98] Diese kostengünstige und umweltfreundliche Variante der Detosylierung zeichnet sich durch ihre milden Reaktionsbedingungen aus und weist eine hohe Toleranz gegenüber funktioneller Gruppen auf. Beispielseise verwendete Enjo[99] diese Methode in der Synthese des Wirkstoffs 107, ein Derivat des Antitumor-Wirkstoffs CC-1065 (Schema 36). Dabei wurde Furoindol 104 in Methanol gelöst und mit Magnesium-Stücken versetzt. Nach 1 h Reaktionszeit bei Raumtemperatur und säulenchromatographischer Aufreinigung, konnte das detosylierte 105 in 70 % Ausbeute erhalten werden. Zudem wurde Tosyl-Phenol 106 in 22 % Ausbeute erhalten. Schema 36 Die von Enjo[99] erfolgreich eingesetzte Detosylierungsmethode sollte nun auf seco-Säure syn-62 übertragen werden (Tabelle 5, Eintrag 1). Dazu wurde syn-62 in Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit frisch gemörsertem Magnesium-Granulat versetzt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels DC-Analyse kontrolliert, allerdings konnte nach 4 h kein Umsatz des Edukts syn-62 festgestellt werden. Nach der Aufarbeitung wurde syn-62 vollständig reisoliert. Zwar kann zur Aktivierung des Magnesiums laut Literatur[97] Quecksilberchlorid eingesetzt werden, jedoch wurde diese Methode aufgrund ihrer Toxizität nicht in Betracht gezogen. Eine alternative Möglichkeit zur Aktivitätssteigerung sind hohe 41 Temperaturen.[96,97,100] Daher wurde die Reaktionstemperatur erhöht, als in einem nächsten Experiment nach 4 h Reaktionszeit erneut kein Umsatz mittels DC-Kontrolle erkennbar war (Eintrag 2). Allerdings konnte nach 24 h nur die Zersetzung des Edukts syn-62 festgestellt werden. Neben der Zersetzung des Edukts syn-62 bzw. des Produkts syn-24, sind eine Reihe von weiteren Nebenreaktionen denkbar, wie beispielsweise die Reduktion von konjugierten Doppelbindungen oder funktionellen Gruppen.[100] Um die Reaktion von Magnesium mit der freien Carbonsäure zu vermeiden, wurde als nächstes die Methylester-Vorstufe syn-103 eingesetzt (Eintrag 3). Zwar konnte ein Umsatz des Edukts syn-103 zu 36 % festgestellt werden, allerdings nicht zum gewünschten Produkt syn-108. Da außerdem angenommen wurde, dass sich das freie Oxazol in der folgenden Verseifung zur seco-Säure syn-24 aufgrund der zuvor festgestellten Instabilität zersetzen würde, wurde dieser Ansatz nicht weiterverfolgt. Tabelle 5: Untersuchung der Detoslyierung von syn-62 und syn-103 mittels Magnesium in Methanol. Eintrag Edukt R Temperatur [°C] Zeit [t] Umsatz [%] Ausbeute [%] 1 [a] syn-62 H RT 4 0 0 2 [b] syn-62 H RT → Reflux 24 0 0 3 syn-103 Me RT 4 36 0 [a] Edukt syn-62 reisoliert [b] Zersetzung des Edukts syn-62 [c] bestimmt mittels 1H-NMR. Eine weitere Möglichkeit zur reduktiven Desulfonierung ist die Verwendung von Natriumnaphthalid.[95,97,101] Diese Methode zeichnet sich durch sehr kurze Reaktionszeiten, Überschuss am Radikalanion und niedrige Temperaturen aus und wird meist in THF bei -78 °C durchgeführt.[97] Die erfolgreiche Darstellung des Natriumnaphthalids zeigt sich dabei durch eine leuchtend grüne Farbe in der Reaktionsmischung. Berry[102] detosylierte β-Aminosulfon 109 als finalen Schritt der Synthese des Pheromons (+)-Monomorin 110 (Schema 37). Dazu wurde 109 in abs. THF gelöst und eine Lösung von 42 Natriumnaphthalid in abs. THF zugetropft. Nach einer Reaktionszeit von 5 min wurde aufgearbeitet und der Naturstoff 110 in 55 % Ausbeute erhalten. Schema 37 Nach einer Vorschrift von Castedo[101] wurde Naphthalin in abs. THF gelöst und Natrium- Dispersion bei -78 C zugetropft (Schema 38). Die Reaktionslösung färbte sich sofort grün. Die Mischung wurde für 2 h gerührt und anschließend Tosyl-Oxazol syn-62 tropfenweise zugefügt. Nach 5 min Reaktionszeit wurde auf Raumtemperatur erwärmt. Die Lösung entfärbte sich dabei schnell. Allerdings konnten nach der Aufarbeitung keine Signale der entschützten seco-Säure syn-24 im 1H-NMR-Spektrum des Rohprodukts detektiert werden. Dagegen wurde Edukt syn-62 vollständig reisoliert. Schema 38 Berry[102] synthetisierte das Natriumnaphthalid wie zuvor beschrieben und tropfte dieses zu einer Lösung des tosylierten Substrats 109 in abs. THF. Doch als diese Variante der Durchführung auf die Detosylierung von syn-62 übertragen wurde, konnte kein Produkt syn-24 erhalten werden. Auch hier wurde Edukt syn-62 vollständig reisoliert. Um Nebenreaktionen mit der freien Carbonsäure zu vermeiden, wurde diese Methode zudem in der Desulfonierung des Esters syn-103 getestet, allerdings auch hier ohne Erfolg. Nachdem die bisherigen Versuche zur Detosylierung von syn-62 und syn-103 nicht erfolgreich waren, wurde als nächstes die Reduktion der Tosyl-Gruppe mittels Samariumdiiodid untersucht. Samariumdiiodid ist eines der wichtigsten Ein-Elektron- 43 Reduktionsmittel und findet vielfältige Anwendung in der organischen Synthese.[103–105] Auch Desulfonierungs-Reaktionen mit Samariumdiiodid sind aufgrund ihrer milden Reaktionsbedingungen und hoher Selektivität beliebt.[97] Beispielsweise reduzierte Eckelbarger[106] Pyrrolidin 111 mittels Samariumdiiodid unter Anwesenheit von Hexamethylphosphorsäuretriamid (HMPA) (Schema 39). Schema 39 Mit tert-Butanol als Protonenquelle konnte 112 in einer Ausbeute von 74 % erhalten werden. In weiteren 8 Stufen gelang Eckelbarger[106] die Synthese von (-)-Cephalotaxin 113, eines der vielversprechendsten Alkaloid-Wirkstoffe gegen Leukämie. Dabei haben Additive wie HMPA und Dimethylpropylenharnstoff (DMPU) großen Einfluss auf die Reaktion, da die Reduktionsfähigkeit von Samariumdiiodid erhöht wird. Zudem werden des Öfteren Lösungsmittelmischungen wie THF / H2O oder THF / MeOH zur Reaktivitäts-Steigerung von Samariumdiiodid eingesetzt.[95,97,107] Allerdings ist HMPA nachweislich krebserregend und daher die Verwendung aufgrund der hohen Toxizität ein großer Nachteil. Auf Grund dessen wurden Methoden ohne diese Additive entwickelt.[95,97,108,109] Schema 40 Beispielsweise desulfonierte Keck[109] den Aminoester 114 mit Samariumdiiodid in abs. THF bei -78 °C in 73 % Ausbeute (Schema 40). Durch Entschützung des Diols konnte der 44 Naturstoff (-)-Lycoricidin 116 in 77 % Ausbeute erhalten werden. Ein Nachteil der Reduktionsmethode könnte sein, dass aufgrund der hohen Reaktivität von Samariumdiiodid einige unerwünschte Nebenreaktionen möglich sind.[110] Obwohl allgemein angenommen wird, dass Carbonsäuren durch Ein-Elektronen-Reduktionsmittel nicht einfach reduziert werden können, wurde beispielsweise die Reduktion von Carbonyl-Funktionalitäten durch Samariumdiiodid beobachtet.[103,111] Aus diesem Grund wurde zunächst das Methyl- geschützte syn-103 in der Samariumdiiodid-vermittelten Detosylierung eingesetzt (Tabelle 6). Dazu wurde in Anlehnung an Keck[109] und Eckelbarger[106] der Methylester syn-103 in abs. THF gelöst und mit Methanol versetzt (Tabelle 6, Eintrag 1). Tabelle 6: Samariumdiiodid-vermittelte Detosylierung von Methylestern syn-103 und anti-103 und tosylierter seco-Säure syn-62. Eintrag Edukt R SmI2 (Äquiv.) Lösungsmittel Ausbeute 1 syn-103 Me 3 THF / MeOH 0 [a] 2 syn-103 Me 2.2 THF / MeOH 0 [b] 3 anti-103 Me 2.2 THF 0 [b] 4 syn-62 H 2.2 THF / MeOH 0 [a] [a] Zersetzung des Edukts [b] Edukt vollständig reisoliert Anschließend wurde eine Lösung aus Samariumdiiodid (3 Äquiv.) in abs. THF bei –78 °C zugetropft. Nach 2 h wurde wässrig aufgearbeitet, jedoch konnten im 1H-NMR-Spektrum des Rohprodukts syn-108 keine Produktsignale oder Signale des Edukts syn-103 detektiert werden. Möglicherweise zersetzte sich syn-103 durch den dreifachen Überschuss des Reduktionsmittels Samariumdiiodid. Um die Zersetzung des Edukts syn-103 zu vermeiden, wurden in einem nächsten Versuch nur 2.2 Äquiv. an Samariumdiiodid eingesetzt (Eintrag 2). Jedoch wurde nach der wässrigen 45 Aufarbeitung das Edukt syn-103 vollständig reisoliert. Auch die Verwendung von abs. THF als einziges Lösungsmittel war nicht erfolgreich, da auch im Falle der Reaktion mit anti-103 Edukt anti-103 reisoliert wurde (Eintrag 3). Zuletzt wurde diese Methode der Detosylierung von syn-62 zur freien seco-Säure syn-24 getestet. Allerdings konnte auch hier nur die Zersetzung des Edukts syn-62 festgestellt werden. Möglicherweise führte die Reaktion von Samariumdiiodid mit der freien Carbonsäure zu Nebenreaktionen. In den bisherigen Experimenten zur Detosylierung wurde entweder kein Umsatz oder die Zersetzung der Edukte syn-62 oder anti-62 beobachtet. Daher zeigte sich die von Addie und Taylor[70] entwickelte Reaktion als die vielversprechendste Methode zur Detosylierung. Auf Grund dessen wurde in den nächsten Versuchen der Fokus auf die Optimierung der von Schmid[32] verwendeten Detosylierung mit Natriumamalgam gelegt (Tabelle 7). Daher wurde in Anlehnung an Schmid[32] anti-62 in einer Mischung aus abs. THF und abs. Ethanol (1 : 1) gelöst und im Ultraschallbad bei Raumtemperatur mit Dinatriumhydrogenphosphat versetzt (Tabelle 7, Eintrag 1). Nach 10 min wurde frisch hergestelltes Natriumamalgam (5 Äquiv.) zugegeben und die Reaktionsmischung im Ultraschall behandelt. Da nach 2 h Reaktionszeit das Edukt anti-62 laut DC-Kontrolle noch nicht vollständig umgesetzt war, wurde erneut Natriumamalgam (5 Äquiv.) zugegeben. Jedoch konnte entgegen den Ergebnissen von Schmid[32] nach weiteren 2 h Reaktionszeit nur die Zersetzung des Edukts anti-62 beobachtet werden. Da in der Literatur[95,97] die Ausbeuten von Detosylierungs-Reaktionen durch die Verwendung von abs. Methanol gesteigert werden konnten, wurde in den folgenden Versuchen abs. THF und abs. Methanol (1 : 1) als Lösungsmittelsystem verwendet. Zudem wurden in den nächsten Experimenten die Methylester syn-103 und anti-103 verwendet, um den Einfluss der freien Carbonsäure in syn-62 und anti-62 auf die Detosylierung zu untersuchen (Eintrag 2 und 3). Nach Schmid[32] wurden Methylester syn-103 bzw. anti-103 und Dinatrium- hydrogenphosphat im Ultraschallbad mit Natriumamalgam behandelt. Jedoch konnte in beiden Versuchen nach 4 h kein Umsatz von syn-103 bzw. anti-103 beobachtet werden. Aus diesem Grund wurden die Reaktionszeiten auf 24 h (Eintrag 2) und 48 h (Eintrag 3) verlängert, allerdings zersetzten sich auch hier die Edukte syn-103 und anti-103 in beiden Fällen. Möglicherweise führte die zusätzliche Aktivierung des Natriumamalgams durch Ultraschall zu einer gesteigerten Reaktivität, welche die Zersetzung beschleunigte.[112] 46 Tabelle 7: Untersuchung der Detosylierung mittels Natriumamalgam und Na2HPO4. Eintrag Edukt R Lösungsmittel Zeit [t] Umsatz [%] 117 [%] Ausbeute [%] 1 [a] anti-62 H THF / EtOH 4 100 - Zersetzung 2 [a] syn-103 Me THF / MeOH 24 100 - Zersetzung 3 [a] anti-103 Me THF / MeOH 48 100 - Zersetzung 4 [b] syn-62 H THF / MeOH 4 100 - 20 [d] 5 [b] anti-62 H THF / MeOH 4 100 - 29 [e] 6 [b] syn-62 H THF / MeOH 24 71 34 - 7 [b] anti-62 H THF / MeOH 48 100 - [c] - [c] 8 [b] syn-62 H THF / MeOH 48 100 - [c] - [c] [a] Ultraschall als Mischungsmethode. [b] Rühren als Mischungsmethode [c] Mischung von syn-24 und syn-117 bzw. anti-24 und anti-117. [d] dr (syn-24 / anti-24) = 100 : 0 (1H-NMR) [e] dr (syn-24 / anti-24) = 0 : 100 (1H-NMR). Um die Reaktivität des Natriumamalgams zu senken, wurde in den nächsten Experimenten auf das Ultraschallbad verzichtet und nur gerührt. Beispielsweise wurde die freie 47 seco-Säure syn-62 mit Dinatriumhydrogenphosphat in abs. THF und abs. Methanol (1 : 1) gelöst und bei Raumtemperatur mit Natriumamalgam (5 Äquiv.) versetzt (Eintrag 4). Nach 2 h wurde erneut Natriumamalgam (5 Äquiv.) zugegeben und die Reaktionsmischung für weitere 2 h gerührt. Nach der wässrigen Aufarbeitung konnten im 1H-NMR-Spektrum Signale des Rohprodukts syn-24 detektiert werden. Durch die Aufreinigung mittels präparativer HPLC an einer Reversed-Phase Säule konnten 20 % der detosylierten seco-Säure syn-24 isoliert werden. Mittels der gleichen Vorgehensweise konnte anti-62 erfolgreich in 29 % Ausbeute zu anti-24 entschützt werden (Eintrag 5). Obwohl die Reaktion mit gleicher Vorgehensweise mehrmals durchgeführt wurde, konnte nicht immer nach 4 h ein vollständiger Umsatz des Edukts syn-62 bzw. anti-62 beobachtet werden. Auf Grund dessen wurde der Einfluss der Reaktionszeiten auf die Detosylierung untersucht (Eintrag 6 und 7). Als beispielsweise die Reaktion von syn-62 mit Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumamalgam nach 24 h durch wässrige Aufarbeitung beendet wurde, konnte nur ein Umsatz von 71 % (1H-NMR) festgestellt werden (Eintrag 6). Durch Massenspektrometrie konnte die Bildung eines Nebenprodukts mit einem Massenverhältnis m/z = 280 [M − H] nachgewiesen werden. Es wurde angenommen, dass durch den 10-fachen Überschuss des Reduktionsmittels Natriumamalgam eine Überreduktion zum Nebenprodukt syn-117 stattfand. Zwar wurde das Rohprodukt mittels präparativer HPLC aufgereinigt, jedoch konnte syn-117 nur mit Verunreinigungen isoliert werden. Dennoch konnte durch 1H-NMR-Spektroskopie das Fehlen der γ,δ-Doppelbindungssignale festgestellt werden. Auch Keck[108] beobachtete in der Detosylierungs-Reaktion mit Natriumamalgam die Überreduktion des Triens 118 (Schema 41). Schema 41 48 Im Falle einer Detosylierungen von syn-62 und anti-62 wurde hingegen nach 48 h ein vollständiger Umsatz erzielt (Eintrag 7 und 8). Dabei konnten allerdings nur Gemische von syn-24 und syn-117 bzw. anti-24 und anti-117 isoliert werden, welche mit präparativer HPLC nicht auftrennbar waren. Demnach zeigte sich, dass längere Reaktionszeiten aufgrund der hohen Reaktivität des Natriumamalgams die Nebenproduktbildung zu beispielsweise syn-117 bzw. anti-117 begünstigte. Auch durch die Verwendung von Ultraschall als Mischungsmethode verstärkte sich diese Reaktivität, wodurch vornehmlich die Zersetzung der Produkte syn-62 und anti-62 angeregt wurde. Nachdem syn-24 und anti-24 erfolgreich in 20 % bzw. 29 % Ausbeute isoliert werden konnten, wurde als letzter Schritt die Makrolaktonisierung zum Naturstoff syn,syn-7a und dem Derivat anti,anti-7a untersucht. 49 3.7 Makrolaktonisierung zu Tosyl-Samroiyotmycin syn,syn-(63) In den Vorarbeiten von Schmid[32] stellte sich die Makrolaktonisierung der freien seco-Säuren syn-24 und anti-24 sowie der tosylierten Säuren syn-62 und anti-62 als schwierig heraus. Zum Beispiel konnte bei der Reaktion des Diastereomerengemischs 62 mit Hf(OTf)4 oder Dy(OTf)3 in Anlehnung an Léséleuc und Collins[113] das gewünschte Produkt 63 nicht isoliert werden (Schema 42, Methode A). Auch durch andere Methoden wie durch die Mitsunobu-Reaktion[114,115] (Methode B), unter Steglich-Bedingungen[116] (Methode C), durch das Tosyl-Chlorid / Pyridin-System[117] (Methode D) oder durch die Methode nach Shiina[118] (Methode E) konnte das Produkt 63 nicht dargestellt werden. Erst durch die Yamaguchi-Makrolaktonisierung gelang die Synthese des tosylierten Makrodiolids 63 in 29 % Ausbeute (Schema 42, Methode F; Produktgemisch aus syn,syn-63, syn,anti-63, anti,anti-63; für Details siehe Schema 43). Im Gegensatz dazu konnte 7a nur in 9 % Ausbeute (Produktgemisch aus syn,syn-7a, syn,anti-7a, anti,anti-7a; für Details siehe Schema 43) erhalten werden. Die Auswertung der NMR-Spektren wurde durch die Überlappung einiger Signale erheblich erschwert und deutete auf die Bildung weiterer Nebenprodukte hin. Eine Abtrennung dieser Nebenprodukte gelang nicht, allerdings wurde die Bildung des gewünschten Produkts 7a durch ESI-MS nachgewiesen.[32] Um die Ergebnisse von Schmid[32] besser einordnen zu können, wurde die Makrolaktonisierung des Gemischs 24 stereochemisch betrachtet (Schema 43). Dabei wurde festgestellt, dass im Falle einer (1 : 1)-Mischung von 24 (dr (syn-24 / anti-24) = 56 : 44) theoretisch die Bildung von vier Makrodioliden (syn,syn-7a, syn,anti-7a, anti,syn-7a und anti,anti-7a) erwartet werden kann. Die mathematische Wahrscheinlichkeit würde in diesem Fall bei 25 . 25 : 25 : 25 liegen. Wie aber aus Schema 43 ersichtlich ist, sind syn,anti-7a und anti,syn-7a identisch. Daraus folgt eine statistische Verteilung der Diastereomer-Bildung von syn,syn-7a : syn,anti-7a / anti,syn-7a : anti,anti-7a = 25 : 50 : 25. Das Gleiche gilt für die Reaktion der tosylierten seco-Säure 62 (dr (syn-62 / anti-62) = 54 : 46). 50 Schema 42 51 Das in Schema 43 gezeigte Produktgemisch erschwerte demnach die Zuordnung der NMR- Signale, sowie die Synthese des gewünschten Naturstoffs syn,syn-7a. Schema 43: Das Schema wurde nach Literatur[119] modifiziert. Darüber hinaus untersuchte Schmid[32] getrennt voneinander die Makrolaktonisierung der jeweils diastereomerenreinen seco-Säuren syn-24 und anti-24. Jedoch konnten auch hier die 52 gewünschten Produkte syn,syn-7a und anti,anti-7a nur mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Aus diesem Grund wurde die Yamaguchi-Veresterung in Anlehnung an Schmid[32] ausgehend von den diastereomerenreinen Verbindungen syn-24 und anti-24 weiter untersucht (Schema 44). Dazu wurde in einem ersten Versuch syn-24 in abs. THF gelöst und mit 2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid versetzt (Schema 44, Eintrag 1). Bei Raumtemperatur wurde langsam Triethylamin zugetropft und die Reaktionsmischung für 8 h gerührt. Anschließend wurde der entstandene Niederschlag Triethylaminhydrochlorid über Kieselgel abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Benzol aufgenommen und mit Dimethylaminopyridin (3 Äquiv.) versetzt. In diesem Schritt wurde auf eine sehr geringe Konzentration der Reaktionsmischung geachtet. Nach Reaktion über Nacht wurde wässrig aufgearbeitet, allerdings konnten nach der säulenchromatographischen Aufreinigung nur Spuren des Produkts syn,syn-7a mittels Massenspektrometrie detektiert werden. Möglicherweise zersetzte sich der Naturstoff syn,syn-7a an Kieselgel während der chromatographischen Aufreinigung. Deshalb wurde in einem weiteren Versuch der ausgefallene Niederschlag nur abfiltriert und anschließend direkt mittels Reversed-Phase HPLC aufgereinigt. Doch auch hier konnte das Produkt syn,syn-7a nur in Spuren mittels ESI-MS detektiert werden. Auch im Falle der Reaktion mit anti,anti-62 konnte das gewünschte Produkt anti,anti-7a nicht isoliert werden (Eintrag 2). In der Synthese von 63 verwendete Schmid[32] im zweiten Reaktionsschritt neben Benzol auch DMF als Lösungsmittel. Trotz Wechsel des Lösungsmittels gelang die Darstellung des Produkts 63 mit 22 % in vergleichbarer Ausbeute. In Anlehnung dazu[32,120] wurde syn-24 in das gemischte Anhydrid überführt und in DMF weiter umgesetzt. Jedoch auch hier war die Makrolaktonisierung erfolglos (Eintrag 3). Wie im Kapitel 3.6, Tabelle 7 beschrieben, wurde in der Detosylierung der seco-Säuren syn-62 bzw. anti-62 ein nicht trennbares Gemisch der Produkte syn-24 und syn-117 bzw. anti-24 und anti-117 durch Überreduktion erhalten. Da eine Trennung möglicherweise in einem späteren Reaktionsschritt erfolgreich sein könnte, wurden diese Produktgemische syn-24 und syn-117 bzw. anti-24 und anti-117 in der Yamaguchi- Makrolaktonisierung eingesetzt (Eintrag 4 und 5). 53 Schema 44 54 Allerdings konnten auch hier nach der Aufreinigung mittels HPLC nur Spuren des Naturstoffs syn,syn-7a und der Derivats anti,anti-7a durch Massenspektrometrie detektiert werden. In der Theorie ist es zudem möglich, dass im Falle der Makrolaktonisierung des (1 : 1)-Gemischs syn-24 und syn-117 ein Produktgemisch aus syn,syn-7a, syn,syn-121 und syn,syn-122 mit gleicher Wahrscheinlichkeit gebildet wird (Schema 44). Die drei Produkte syn,syn-7a, syn,syn-121 und syn,syn-122 konnten jedoch nicht isoliert und charakterisiert werden. Gleiches gilt für die Reaktion des (1 : 1)-Gemischs anti-24 und anti-117, in der vermutlich eine Mischung aus anti,anti-7a, anti,anti-121 und anti,anti-122 gebildet wurde. Da bisher die Veresterung der freien seco-Säuren syn-24 und anti-24 unter Yamaguchi- Bedingungen nicht gelang, wurde im Folgenden die Makrolaktonisierung der diastereomerenreinen tosylierten Säuren syn-62 und anti-62 untersucht (Schema 45). Schema 45 55 Analog zu den vorherigen Versuchen wurden syn-62 und anti-62 getrennt voneinander mit 2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid und Triethylamin in abs. THF umgesetzt (Schema 45, Eintrag 1 und 2). Nach Filtration über Kieselgel wurde das entstandene Anhydrid in abs. Benzol gelöst und mit Dimethylaminopyridin (3 Äquiv.) versetzt. Doch auch in diesen Versuchen konnten die gewünschten Produkte syn,syn-63 und anti,anti-63 nicht isoliert werden. In mehreren Arbeiten berichtete Yonemitsu,[121–124] dass ein großer Überschuss an Dimethylaminopyridin für das Gelingen der Reaktion unabdingbar war. Auf Grund dessen wurde in den nächsten Experimenten das gemischte Anhydrid dargestellt, anschließend in Benzol gelöst und mit Dimethylaminopyridin (6 Äquiv.) versetzt (Eintrag 3). Nach der wässrigen Aufarbeitung und Aufreinigung mittels präparativer HPLC, konnte das gewünschte Produkt syn,syn-63 in einer Ausbeute von 20 % erfolgreich isoliert werden. Mittels 1H-NMR- Spektroskopie konnten keine weiteren Diastereomere detektiert werden. Das Diastereomerenverhältnis wurde zu dr (syn,syn-63 / syn,anti-63 / anti,anti-63) = 100 : 0 : 0 (1H-NMR) bestimmt. Nach gleicher Vorgehensweise konnte anti,anti-63 in einer Ausbeute von 23 % (dr (syn,syn-63 / syn,anti-63 / anti,anti-63) = 0 : 0 : 100 (1H-NMR)) erhalten werden (Eintrag 4). Diese optimierten Bedingungen sollten anschließend auf die freien seco-Säuren syn-24 und anti-24 übertragen werden (Schema 46). Jedoch konnten auch mit dieser Methode syn,syn-7a und anti,anti-7a nicht dargestellt werden. Schema 46 56 Möglicherweise zeigte sich auch hier, dass die ungeschützte Oxazol-Funktionalität die Reaktion negativ beeinflusste. Daher wurde in einem nächsten Schritt versucht, die erfolgreich isolierten tosylierten Makrodiolide syn,syn-63 und anti,anti-63 mit Natriumamalgam zu detosylieren (Schema 47). Allerdings war diese Reaktion auch mit den zuvor optimierten Reaktionsbedingungen und in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von Schmid[32] nicht erfolgreich. Schema 47 Gleichwohl gelang die Darstellung der Samroiyotmycin-Derviate syn,syn-63 und anti,anti-63 über 7 Stufen mit einer Gesamtausbeute von 6 % (syn,syn-63) und 4 % (anti,anti-63). Damit konnte die Syntheseroute nach Schmid[32] erfolgreich optimiert werden. 57 3.8 Synthese der Naphthyl-, Thiophenyl- und Pyridyl-Derivate Um ein besseres Verständnis für den Wirkmechanismus von Samroiyotmycin A syn,syn-7a und die Rolle einzelner Struktur-Bausteine zu bekommen, sollten Struktur-Aktivitäts- Beziehungen aufgestellt werden. Nachdem die tosylierten Makrodiolide syn,syn-63 und anti,anti-63 erfolgreich dargestellt werden konnten, wurde daher der Fokus auf die Synthese von Naturstoff-Derivaten von syn,syn-7a gelegt. Aufgrund der herausfordernden Synthese des Oxazol-Substituenten, war vor allem die Variation des Aryl-Rests von großem Interesse. Damit könnte die Darstellung eines potenten Wirkstoffs-Derivats weiter vereinfacht werden. Im Zuge dessen untersuchten Weng und Schmid[32,125] die Synthese des Benzyl- Derivats 125 (Schema 48). Dazu setzten sie Aldehyd 27 mit Benzylmagnesiumchlorid in einer Grignard-Reaktion um. Benzyl-Alkohol 123 konnte in einer Ausbeute von 36 % und einem Diastereomerenverhältnis von dr (syn-123 / anti-123) = 67 : 33 (1H-NMR) isoliert werden. Schema 48 Durch eine Grubbs-II-Metathese mit der freien Sorbinsäure 25 konnte die seco-Säure 124 in 77 % Ausbeute (dr (syn-124 / anti-124) = 63 : 37 (1H-NMR)) erhalten werden. Eine Yamaguchi-Makrolactonisierung als finalen Schritt lieferte das Wirkstoff-Derivat 125 in einer 58 Ausbeute von 36 % (Mischung aus syn,syn-125, syn,anti-125, anti,anti-125; analog Kapitel 3.7, Schema 43). Jedoch konnte das gewünschte Produkt 125 auch nach mehrmaligen Aufreinigungsschritten nicht von letzten Verunreinigungen abgetrennt werden.[32,125] Durch einen analogen Ansatz untersuchte Schmid[32] die Darstellung von Samroiyotmycin- Derivaten mit unterschiedlichen Ringgrößen 130a,b (Schema 49). Zudem wurde in der Synthese von 130a,b auf die Darstellung der stereogenen Methylgruppe verzichtet, um den Einfluss von Stereozentren auf die biologische Aktivität zu untersuchen. Daher wurden Benzaldehyd 126 und 1-Pentenylbromid 127a bzw. 1-Hexenylbromid 127b in einer Grignard- Reaktion zu den entsprechenden Alkoholen 128a in 72 % (dr = 51 : 49, n = 1) und 128b in 59 % (dr = 50 : 50, n = 2) umgesetzt. Durch eine Grubbs-II-Metathese und einer anschließenden Veresterung konnten die Makrodiolide 130a in 23 % (Ph, n = 1, über zwei Stufen, Mischung aus (R,R), (R,S) und (S,S)) und 130b in 12 % (Ph, n = 2, über zwei Stufen, Mischung aus (R,R), (R,S) und (S,S)) erhalten werden. Schema 49 Anhand dieser Vorarbeiten[32,125] wurde im Rahmen dieser Arbeit die Darstellung von weiteren Derivaten untersucht. Als geeignete Aryl-Funktionalitäten wurden dabei der 59 Naphthyl-Substituent mit einem erweitertem π-System, sowie Thiophen und Pyridin als weitere Heteroaryl-Substituenten ausgewählt. Zu Beginn wurde die Aryl-Addition mit trans-Crotonaldehyd 131 als Testsystem untersucht. Dazu wurde in Anlehnung an die Literatur[70,126] 2-Methylnaphthalin 132a bzw. 2-Methylpyridin 132b mit n-BuLi in abs. THF bei -78 °C deprotoniert und anschließend Aldehyd 131, gelöst in abs. THF, bei gleicher Temperatur zugetropft (Schema 50). Nach dem Aufwärmen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur und einer anschließenden wässrigen Aufarbeitung konnten die gewünschten Produkte 133a bzw. 133b allerdings nicht isoliert werden. Schema 50 Im Gegensatz dazu konnten in den Grignard-Reaktionen der entsprechenden Arylbromide 134a-c vielversprechende Ergebnisse erzielt werden (Schema 51). Schema 51 Nach einer Vorschrift von Lonca[127] wurde das entsprechende Arylbromid 134a-c in abs. THF mit Magnesium-Granulat versetzt. Das entstandene Grignard-Reagenz wurde anschließend zu trans-Crotonaldehyd 131 getropft. Nach der säulenchromatographischen 60 Aufarbeitung konnten 135a in 81 %, 135b in 60 % und 135c in 82 % erfolgreich isoliert werden. Diese Reaktionsbedingungen sollten anschließend auf die Synthese der Arylalkohole 136a-c übertragen werden. Dazu wurde zunächst der Aldehyd 27 wie in Kapitel 3.2 beschrieben dargestellt. Dieser wurde anschließend in einer Grignard-Reaktion analog zu den Testreaktionen mit den entsprechenden Arylbromiden 134a-c weiter umgesetzt (Tabelle 8, Methode A). Die Arylalkohole 136a-c konnten allerdings nur in Ausbeuten von 12 – 15 % erhalten werden (Eintrag 1 – 3, Methode A). Tabelle 8: Synthese der Arylalkohole 135a-c. Eintrag 134 R 136 Methode A Methode B Ausbeute [%] dr [a] Ausbeute [%] dr [a] 1 a R1 a 12 51 : 49 49 58 : 42 2 b R2 b 15 58 : 42 30 61 : 39 3 c R3 c 12 52 : 48 71 56 : 44 [a] dr (syn / anti) bestimmt mittels 1H-NMR-Spektroskopie. Da die Arylalkohole 136a-c unter den optimierten Bedingungen nur in geringen Ausbeuten synthetisiert werden konnten, wurde ein Lithium-Halogen-Austausch als alternative Synthesestrategie herangezogen. Die Reaktion von Organolithium-Verbindungen mit Kohlenstoff-Elektrophilen ist eine der wirksamsten Methoden zur C-C-Bindungsknüpfung und vielfältig anwendbar.[128] Dazu wurde beispielsweise 2-Bromnaphthalin 134a in abs. THF gelöst und bei -78 °C mit n-BuLi versetzt (Tabelle 8, Eintrag 1, Methode B). Nach 30 min Reaktionszeit wurde der Aldehyd 27, gelöst in abs. THF, langsam zugegeben und auf Raumtemperatur erwärmt. Nach der säulenchromatographischen Aufarbeitung und Aufreinigung mittels HPLC, konnte das 61 gewünschte Produkt 136a in 49 % Ausbeute und einem Diastereomerenverhältnis von dr (syn-136a / anti-136a) = 58 : 42 (1H-NMR) erhalten werden. Eine Trennung der Diastereomere syn-136a und anti-136a mittels HPLC gelang nicht. Durch die neue Synthesestrategie konnte jedoch eine Steigerung der Ausbeute des Naphthylalkohols 136a von 12 % auf 49 % erzielt werden. Auch mit Brompyridin 134b und Bromthiophen 134c konnte die Ausbeute auf 30 % (136b, dr (syn-136b / anti-136b) = 61 : 39 (1H-NMR), Eintrag 2, Methode B) und 71 % (136c, dr (syn-136c / anti-136c) = 56 : 44 (1H-NMR), Eintrag 3, Methode B) gesteigert werden. Zudem war im Falle des Pyridin-Derivats die Trennung der Diastereomere syn-136b und anti-136b mittels HPLC erfolgreich. Die Zuordnung der absoluten Konfiguration von syn-136b und anti-136b erfolgte dabei anhand des Drehwertes und durch den Vergleich mit den Oxazol-substituierten Diastereomeren syn-62 und anti-62. Nachdem die Arylalkohole 136a-c erfolgreich dargestellt werden konnten, wurde in den nächsten Experimenten die Grubbs-II-katalysierte Kreuzmetathese von 136a-c mit Sorbinsäuremethylester 100 untersucht (Tabelle 9). Tabelle 9: Grubbs-II-katalysierte Kreuzmetathese der Arylalkohole 136a-c. Eintrag Edukt R Produkt Ausbeute [%] dr [a] 1 136a R1 137a 77 58 : 42 2 syn-136b R2 syn-137b 22 100 : 0 3 anti-136b R2 anti-137b 20 0 : 100 4 136c R3 137c 60 54 : 46 [a] dr (syn / anti) bestimmt über 1H-NMR Zunächst wurde 136a in Dichlormethan gelöst, mit Sorbinsäuremethylester 100 und Grubbs-II-Katalysator versetzt und für 18 h refluxiert (Tabelle 9, Eintrag 1). Nach der säulenchromatographischen Aufreinigung konnte 137a in 77 % Ausbeute und einem 62 Diastereomerenverhältnis von dr (syn-137a / anti-137a) = 58 : 42 (1H-NMR) erhalten werden. Eine Trennung der Diastereomere syn-137a und anti-137a mittels HPLC gelang allerdings nicht. Im Falle des Pyridin-Substituenten wurden die Diastereomere syn-136b und anti-136b getrennt voneinander umgesetzt. Allerdings konnten hier nur Ausbeuten von 22 % (syn-137b, Eintrag 2, dr (syn-137b / anti-137b) = 100 : 0 (1H-NMR)) und 20 % (anti-137b, Eintrag 3, dr (syn-137b / anti-137b) = 0 : 100 (1H-NMR)) erzielt werden. Im Gegensatz dazu wurde 137c in 60 % Ausbeute (Eintrag 4, dr (syn-137c / anti-137c) = 54 : 46 (1H-NMR)) isoliert, wobei auch hier die Trennung der Diastereomere syn-137c und anti-137c mittels HPLC nicht erfolgreich war. Anschließend sollte die Verseifung des Esters zu den freien seco-Säuren 138a-c erfolgen. Dazu wurde der entsprechende Methylester 137a-c in einer Mischung aus THF und demin. Wasser (1 : 1) gelöst und mit frisch gemörsertem Kaliumhydroxid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 4 Tagen bei Raumtemperatur und Aufreinigung mittels Reversed-Phase HPLC konnten 138a in 70 % (dr (syn-138a / anti-138a) = 69 : 31 (1H-NMR)) und 138c in 45 % (dr (syn-138c / anti-138c) = 55 : 45 (1H-NMR)) isoliert werden (Schema 52). Schema 52 Allerdings war diese Entschützung der Carbonsäure nur im Falle des Naphthyl- und Thiophenyl-Substituenten erfolgreich. Die Verseifung der Pyridyl-Derivate syn-137b und anti-137b führte nach der wässrigen Aufarbeitung und Aufreinigung mittels Reversed-Phase HPLC in beiden Fällen nur zu einem Nebenprodukt mit einer Ausbeute von 19 % (Schema 53). Interessanterweise war das 1H-NMR-Spektrum der Produkte sowohl aus der Reaktion von syn-137b, als auch von anti-137b identisch. Demnach wurde das gleiche Nebenprodukt gebildet. Wie in Schema 53a gezeigt, ist die Bildung der Nebenprodukte 139 – 144 denkbar. 63 Beispielsweise können 139 und 140 durch nucleophile Addition des Hydroxid-Ions an den Pyridin-Substituenten gebildet werden. Schema 53 64 Allerdings wurde durch massenspektrometrische Analyse nur ein Nebenprodukt mit m/z = 274.14 [M+H] detektiert, was zum Ausschluss von 139 und 140 führte. Weiter könnte beispielsweise durch die Eliminierung der Hydroxygruppe die Bildung der Nebenprodukte 141 und 142 mit einem Massenverhältnis von m/z = 274.14 [M+H] möglich sein. Jedoch wurde durch die Auswertung der Protonensignale im 1H-NMR-Spektrum und dem Abgleich mit den zugehörigen 2D-NMR-Spektren festgestellt, dass weder das Proton am C-9- Kohlenstoff noch das Hydroxy-Protonen-Signal detektiert wurden. Die Analyse deutete vielmehr auf die Oxidation der Hydroxygruppe zum Keton 144 hin. Abbildung 4 zeigt a) das 1H-NMR-Spektrum (700 MHz, CDCl3) von 144 und b) die Zuordnung der entsprechenden Protononensignale in der Vergrößerung im Bereich zwischen 3.80 – 8.80 ppm. Abbildung 4: a) 1H-NMR-Spektrum (700 MHz, CDCl3) von 144. b) Vergrößerung des 1H-NMR-Spektrums von 144 im Bereich zwischen 3.80 – 8.80 ppm. 65 Ein möglicher Syntheseweg wäre die Reaktion von syn-137b und anti-137b mit Kaliumhydroxid und Luftsauerstoff (Schema 53b). In der Literatur[129,130] sind Oxidationen unter aeroben Bedingungen zwar bekannt, jedoch werden dazu oft stärkere Basen wie Natriumhydrid oder Natriummethanolat verwendet. Allerdings ist die Nebenreaktion durch den