Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von Propylenoxid und Phenol mittels Ganzzellbiokatalyse unter Nutzung der Methan-Monooxygenase des Organismus Methylosinus trichosporium OB3b von der Fakultät 4 Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart zur Erlangung der Würde eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung vorgelegt von Ilka Madeleine Derwenskus geb. Mühlemeier aus Ludwigsburg Hauptberichter: Prof. Dr. Thomas Hirth 1. Mitberichter: Prof. Dr. Markus Pietzsch 2. Mitberichter: apl. Prof. Dr. Günter Tovar Tag der mündlichen Prüfung: 25.03.2022 Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik und Plasmatechnologie der Universität Stuttgart 2022 Eidesstattliche Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbst, lediglich unter Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel, verfasst habe. Ilka Derwenskus, Stuttgart den 21.09.2021 Diese Arbeit wurde im Rahmen des durch das Ministerium für Wissenschaft und Kunst (MWK), Baden-Württemberg geförderten Forschungsprojektes „Entwicklung eines Bioreak- tors zur stofflichen Verwertung von Biogas“ (7533-10-5-/103/1) und als Teil des begleitenden Graduiertenprogramms „BBW ForWerts“ angefertigt. Teile dieser Arbeit wurden bereits in verschiedenen wissenschaftlichen Zeitschriften (sog. „peer-reviewed journals“) veröffentlicht: Publikation Mühlemeier, Ilka Madeleine, Speight, Robert, und Strong, Peter James. „Biogas, Bioreactors and Bacterial Methane Oxidation“. In Methane Biocatalysis: Paving the Way to Sustainability, herausgegeben von Marina G. Kalyuzhnaya und Xin-Hui Xing, 213–35. Cham: Springer Inter- national Publishing, 2018. https://doi.org/10.1007/978-3-319-74866-5_14. https://doi.org/10.1007/978-3-319-74866-5_14 KURZFASSUNG - I - Kurzfassung Die wichtigen chemischen Synthesebausteine Propylenoxid und Phenol werden derzeit groß- technisch in mehrstufigen umweltbelastenden Prozessen hergestellt. Bei der Propylenoxidsyn- these entstehen über das vorwiegend genutzte Chlorhydrinverfahren 2,1 t Calciumchlorid und 2,2 t Natriumchlorid pro Tonne Propylenoxid, dessen Entsorgung das Abwasser stark belastet. Phenol wird gegenwertig im industriellen Maßstab über die Hock‘sche Phenolysnthese herge- stellt, wobei als Nebenprodukt zwangsläufig große Mengen Aceton anfallen. Da für Aceton nur ein sehr geringer Marktpreis erzielt werden kann, wird dadurch die Gesamtwirschaftlichkeit des Prozesses deutlich gemindert. Der notwendige Energieeintrag ist bei beiden chemischen Herstellungsverfahren wegen der hohen erforderlichen Temperaturen und des hohen erforder- lichen Druckes erheblich (Bernhard et al., 2017; Jeffrey S. Plotkin, 2021; Schmidt, 2005; Winnacker, 2004). Aus den genannten Gründen wird derzeit intensiv an der Entwicklung nach- haltiger Verfahren zur Produktion beider Wertstoffe gearbeitet. Ein umweltschonendes, biotechnologisches Verfahren zur Synthese beider Substanzen stellt die Biokatalyse ausgehen von den Edukten Propylen und Benzol mit Hilfe des Enzyms Methan- Monoxygenase (MMO) dar. Das Enzym wird auf natürliche Weise durch aerobe, methanotro- phe Bakterien (MOB), wie z.B. Methylosinus trichosporium OB3b, gebildet. Im Metabolismus der MOB liegt das Enzym abhängig von den zugrundeliegenden Kulturbedingungen in löslicher (sMMO) oder gebundener Form (pMMO) vor. Im natürlichen Stoffwechsel ist dieses Enzym für die Oxidation von Methan zu Methanol verantwortlich. Es kann aber aufgrund seines breiten Substratspektrums in Abhängigkeit vom eingesetzten Ausgangsstoff auch zur Oxidation ande- rer n-Alkane, n-Alkene (z.B. Propylen) und von aromatischen Kohlenwasserstoffen (z.B. Ben- zol) eingesetzt werden. Zur fermentativen Herstellung des Ganzzellbiokatalysators und zur Selektivoxidation von Pro- pylen und Benzol wurde der Organismus M. trichosporium OB3b in dieser Arbeit sowohl im Rührkesselreaktor als auch erstmals in zwei unterschiedlichen Membranbioreaktoren einge- setzt. Dabei wurden zunächst grundlegende Untersuchungen zur Erhöhung der Biomasseausbeute durch eine CO2-induzierte Verkürzung der Lag-Phase im Rührkesselreaktor durchgeführt. An- schließend erfolgte die Etablierung der Kultivierung von M. trichosporium OB3b in den aus- gewählten Membranbioreaktoren. Obwohl die Verwendung von Membranbioreaktoren zur Fer- mentation aerober, methanotropher Bakterien aufgrund des geringen Leistungseintrags sowie KURZFASSUNG - II - der Möglichkeit zur getrennten, blasenfreien Begasung mit Methan- und Sauerstoff einen er- heblichen sicherheitstechnischen Vorteil gegenüber Rührkesselreaktoren bieten können, exis- tieren hierzu nach Kenntnisstand der Autorin bisher keine publizierten Daten. Durch die ge- trennte blasenfreie Begasung können zudem potentiell explosive Gasgemische vermieden wer- den, und eine bessere Subratverfügbarkeit durch die blasenfreie Begasung ist zu erwarten. Die Ergebnisse der grundlegenden Versuche im Doppelmembranbioreaktor (DMBR) zeigen erstmals, dass eine Fermentation des Organismus M. trichosporium OB3b im DMBR bis zu einer Biomassekonzentration von 0,84 ± 0,16 g L-1 möglich ist. Die Biomassekonzentration liegt damit derzeit noch deutlich unter der im Rührkesselreaktor erreichten maximalen Bio- massekonzentration von 15,3 ± 1,7 g L-1. Die Untersuchungen ermöglichen eine erste Orientie- rung um zukünftig sowohl die Produktivität als auch die Biomassekonzentration durch Opti- mierung der Prozessparameter, wie z.B. der Pumpgeschwindigkeit, der Erhöhung des Gasdru- ckes sowie einer Vergrößerung des Verhältnisses von Membranoberfläche zum Volumen der flüssigen Phase, zu steigern. Auf Basis des Ganzzellbiokatalystators M. trichosporium OB3b wurde nachfolgend ein mehr- stufiger Prozess zur Selektivoxidation von Propylen zu Propylenoxid und von Benzol zu Phenol mit sequenzieller Cofaktorregeneration im Rührkesselreaktor entwickelt. Insbesondere für die Biokatalyse von Benzol zu Phenol mittels MMO wurde bisher lediglich die prinzipielle Mach- barkeit publiziert. Es war daher notwendig, zunächst essentielle Parameter wie die Produktto- xizität und die zur Biokatalyse verwendete Biomassekonzentration hinsichtlich deren Einflus- ses auf die Reaktionskinetik zu untersuchen. Aufbauend auf den erzielten Ergebnissen konnte anschließend eine Strategie zur sequenziellen Cofaktor-Regeneration im Hinblick auf eine mehrfache Oxidationsreaktion evaluiert und optimiert werden. Zur Analyse beider enzymati- scher Reaktionen wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein neuartiges Echtzeit-Membran- einlass-Massenspektrometer eingesetzt, welches die simultane Aufzeichnung einer Edukt- und Produktkinetik in der Flüssigphase in Echtzeit ermöglicht. Um einen stabilen Prozess über einen möglichst langen Zeitraum aufrecht erhalten zu können, wurden experimentelle Daten zur Produkttoxizität von Propylenoxid und Phenol gegenüber M. trichosporium OB3b ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass Propylenoxid bei kurzeitiger Exposition (30 min) bis zu einer Konzentration von 100 mM keinen signifikanten, toxischen Effekt auf den Ganzzellbiokatalysator aufweist. Phenol hingegen zeigte schon ab einer Konzentration von 50 mM eine wachstumsinhibierende Wirkung. Eine Langzeitexposition, die über die gesamte Dauer der Kultivierung erfolgte, mit beiden Substanzen führte – selbst bei KURZFASSUNG - III - einer geringen Konzentration von 13 mM Propylenoxid bzw. von 30 mM Phenol – zur nahezu vollständigen Inhibition des Wachstums von M. trichosporium OB3b. Folglich ist ein kontinuierlicher Austrag beider Produkte aus dem Reaktor im Hinblick auf einen semi- kontinuierlichen Herstellungsprozess auf Basis des Ganzzellbiokatalysators zwingend erforderlich. Dies konnte durch die Etablierung von geeigneten sequenziellen Regenerationsintervallen mit Methan und Sauerstoff erreicht werden. Gleichzeitig wurden dadurch auch die Cofaktoren des Ganzzellbiokatalysators regeneriert. Hierdurch wurde eine mehrfache Wiederverwendung des Ganzzellbiokatalysators für beide Oxidationsreaktionen ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten dadurch mehr als drei Oxidationszyklen erfolgreich durchgeführt werden. Die Ergeb- nisse lassen jedoch erwarten, dass die Produktausbeute durch die Einführung zusätzlicher Re- generations- und Oxidationsphasen zukünftig weiter erhöht werden kann. Die zuvor genannten Erkenntnisse, in Verbindung mit dem Einsatz der in dieser Arbeit erstmals untersuchten pro- zessbegleitenden massenspektroskopischen Echtzeitanalytik, können somit zukünftig die Grundlage für eine mehrstufige semi-kontinuierliche Oxidation von Benzol zu Phenol und Pro- pylen zu Propylenoxid auf Basis von M. trichosporium OB3b bilden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in einem neu entwickelten Doppelmemb- ranbioreaktor bei kontinuierlicher Prozessführung die biokatalystische Oxidation sowohl von Propylen als auch von Benzol über einen Zeitraum von mindestens 6 h durchgeführt werden kann. Durch die Einführung einer kontinuierlichen Produktabtrennung sollte es daher möglich sein, die Wirtschaftlichkeit dieses Prozesses weiter zu verbessern. Aufgrund des breiten Sub- stratspektrums der Methan-Monooxygenase eröffnen die in dieser Arbeit gewonnenen Daten und technischen Grundlagen die Möglichkeit, zukünftig weitere Verfahren zu entwickeln, wel- che zur umweltverträglichen biokatalytischen Oxidation zahlreicher wichtiger chemischer Syn- thesebausteine, wie z.B. Ethylen zu Ethylenoxid, dienen können. ABSTRACT - IV - Abstract The chemicals propylene oxide and phenol are currently produced in a large scale in a multi- stage process with negative impact on the environment. During propylene oxide synthesis, the predominantly used chlorohydrin process produces 2.1 t of calcium chloride and 2.2 t of sodium chloride per metric ton of propylene oxide. Both byproducts have to be disposed causing heav- ily polluted wastewater. Phenol is currently produced in idustrial scale by the Hock process, which inevitably produces large quantities of acetone as a by-product. Since only a very low market price can be obtained for acetone, the overall economic efficiency of the process is greatly reduced. The energy input required for both chemical production processes is consider- able due to the high temperatures and pressure required (Bernhard et al., 2017; Jeffrey S. Plot- kin, 2021; Schmidt, 2005; Winnacker, 2004). For this reasons the development of sustainable processes for the production of both valuable substances is currently in scope of many research projects. An environmentally friendly, biotechnological process for the synthesis of both substances starting form the substrates propylene and benzene is the enzymatic biocatalysis using methan- monooxygenase (MMO). This enzyme is formed naturally by aerobic, methanotrophic bacteria (MOB), such as Methylosinus trichosporium OB3b. In the metabolism of MOB, the enzyme is present in soluble (sMMO) or bound (pMMO) form depending on the underlying culture con- ditions. In natural metabolism, this enzyme is responsible for the oxidation of methane to meth- anol. However, due to its broad substrate spectrum, it can also be used for the oxidation of other n-alkanes, n-alkenes (e.g. propylene) and ali-cyclic hydrocarbons (e.g. benzene). For the fermentative production of the whole-cell biocatalyst and the selective oxidation of propylene as well as for benzene, the organism M. trichosporium OB3b was used in this study both in the stirred tank reactor and, for the first time, in two different membrane bioreactors. For the production of the whole-cell biocatalyst, basic investigations were first carried out in the stirred tank reactor to increase the biomass yield by shortening the lag phase by supplying additional CO2. Furthermore, the cultivation of M. trichosporium OB3b in membrane bioreactors was estab- lished. Although the use of membrane bioreactors for the fermentation of aerobic, metha- notrophic bacteria can offer a considerable safety advantage over stirred tank reactors due to the low power input and the possibility of separate, bubble-free gassing with methane and ox- ygen, to the author's knowledge there are no published data available yet. The separate, bubble- ABSTRACT - V - free gassing avoids potentially explosive gas mixtures and can potentially enable a better sub- strate availability. The results of the basic experiments in the double membrane bioreactor (DMBR) show for the first time that fermentation of the organism M. trichosporium OB3b in the DMBR is possible up to a biomass concentration of 0.84 ± 0.16 g L-1. The biomass concentration is thus currently still significantly below the maximum biomass concentration of 15.3 ± 1.7 g L-1 achieved in the stirred tank reactor. The investigations provide an initial orientation for increasing both produc- tivity and biomass concentration in the future by optimizing the process parameters, such as the pumping speed, increasing the gas pressure and increasing the ratio of membrane surface to liquid phase volume. Based on the M. trichosporium OB3b whole-cell biocatalyst, a multistage process for the selec- tive oxidation of propylene to propylene oxide and of benzene to phenol with sequential regen- eration was developed in a stirred tank reactor. Since for the biocatalysis of benzene to phenol using MMO, only the basic feasibility has been published so far. Thus, it was necessary first to investigate essential operating parameters such as product toxicity and the biomass concentra- tion used for biocatalysis with regard to their influence on the reaction kinetics. Based on the results obtained, a strategy for sequential cofactor regeneration was evaluated and optimized with respect to a multiple oxidation reaction. To investigate both reactions, a novel real-time membrane inlet mass spectrometer was used for the first time, which allowed the simultaneous recording of reactant and product kinetics in the liquid phase in real time. In order to maintain a stable process over a long period of time, experimental data were col- lected on the product toxicity of propylene oxide and phenol to M. trichosporium OB3b. The results showed that propylene oxide had no significant toxic effect on the whole-cell biocatalyst at short-term exposure (30 min) up to a concentration of 100 mM. Phenol, on the other hand, showed a growth inhibitory effect at concentrations as low as 50 mM. A long-term exposure, which took place over the entire duration of cultivation, with both substances - even at a low concentration of 13 mM propylene oxide or of 30 mM phenol - led to the almost complete inhibition of the growth of M. trichosporium OB3b. Therefore, a continuous removal of both products is mandatory with respect to a semi-continuous production process. Based on the knowledge gained, suitable sequential regeneration intervals with methane and oxygen were established to remove the products from the reaction medium and to regenerate the cofactors of the MMO over multiple oxidation cycles. This allowed multiple reuse of the whole cell biocatalyst for both propylene to propylene oxide and benzene to phenol oxidation ABSTRACT - VI - reactions. Thus, at least three oxidation cycles for each substrate could be successfully per- formed in this work. By introducing additional regeneration and oxidation phases, it can be expected that the product yield could be further increased. The aforementioned findings, in conjunction with the use of in-process real-time mass spectroscopic analysis, which was inves- tigated for the first time in this work, may thus in future form the basis for a multi-stage semi- continuous oxidation of benzene to phenol and propylene to propylene oxide based on M. tri- chosporium OB3b. Within the scope of this work, it was shown that the biocatalytic oxidation of both propylene and benzene can be carried out over a period of at least 6 h in the newly developed double- membrane bioreactor in a continuous process. By introducing continuous product separation, it should be possible to further improve the economic efficiency of this process. Due to the broad substrate spectrum of the methane monooxygenase, the data and technical principles obtained in this work open up the possibility of developing further processes in the future, which can be used for the environmentally compatible biocatalytic oxidation of numerous important chemi- cal synthesis building blocks, such as ethylene to ethylene oxide. DANKSAGUNG - VII - Danksagung Meinen herzlichen Dank möchte ich aussprechen an… … Herrn Prof. Dr. Thomas Hirth für das entgegengebrachte Vertrauen, das stetige Interesse am Fortgang der Arbeit sowie die vielen hilfreichen fachlichen Diskussionen und Treffen. Insbe- sondere möchte ich mich für die fortwährende Untersützung nach dem Wechsel an das KIT bedanken. … Herrn Prof. Dr. Markus Pietzsch (Universität Halle) und Herrn apl. Prof. Dr. Günter Tovar für die konstruktiven Gespräche zu dieser Arbeit und die Bereitschaft zur Übernahme der Gut- achten. … Dr. Matthias Stier für die inhaltliche Ausrichtung und die thematische Eingrenzung. Durch sein großes Engagement, seine fachliche Unterstützung war es mir möglich, diese Arbeit ziel- gerichtet durchzuführen. ... Dr. Franziska Seifert und allen beteiligten des Projektes ECOX II für die Einarbeitung in das neue Themengebiet und die gute Zusammenarbeit. … Dr. James Strong, der mir ein meinen Forschungsaufenthalt an der University of Queensland in Brisbane (Australien) ermöglichte und mich stets bei der Erstellung von Publikationen un- terstütze und bei fachlichen Fragen zur Verfügung stand. … alle Studenten, deren Arbeiten ich im Laufe meiner Dissertation betreuen durfte, Ervin Sivic, Lukas Maier, Bernd Eppinger, Michael Kommander, Lorena Rincón Rincón, Gerhard Brebeck, Mykhailo Reidman, Sarah Uhl, Soniya Lal und Sandra Lichtenberger die die Untersuchungen im Labor, stets mit Motivation und Eigeninitiative durchgeführt haben. … die Mitarbeiter des Innovationsfelds Funktionelle Inhaltsstoffe und des Innovationsfelds Wasser des Fraunhofer IGB insbesondere Hedwig Pilgram, Martina Wanner, Gerhard Gott- schling, Lukas Kriem und Bryan Lotz für das motivierende und angenehme Arbeitsklima. … Meinen Schwestern Swantje, Meike und Anke sowie ihren Partnern, meinen Eltern Rita und Jörg sowie meinen Schwiegereltern Karin und Karl-Heinz, meinem Mann Felix und unserer Tochter Palina, die mich auch in schwierigen Zeiten unterstützten und immer wieder aufgehei- tert haben. Dies war stets ein großer Rückhalt für mich. INHALTSVERZEICHNIS - VIII - Inhaltsverzeichnis 1 Kurzfassung I Abstract IV Danksagung VII Inhaltsverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis XI Abbildungsverzeichnis XIII Tabellenverzeichnis XVI 1 Einleitung 1 1.1 Ausgangssituation 1 1.2 Zielsetzung 3 2 Theoretische Grundlagen 6 2.1 Herstellverfahren für Propylenoxid und Phenol im industriellen Maßstab 6 2.1.1 Oxidation von Propylen zu Propylenoxid 6 2.1.2 Oxidation von Benzol zu Phenol 9 2.1.3 Oxidation von Propylen zu Propylenoxid und Benzol zu Phenol 10 2.2 Aerobe, methanotrophe Bakterien 10 2.3 Methylosinus trichosporium OB3b 12 2.4 Eigenschaften der Methan-Monooxygenase 14 2.4.1 Membrangebundene Methan-Monooxygenase für die Selektivoxidation von Propylen zu Propylenoxid 15 2.4.2 Lösliche Methan-Monooxygenase für die Selektivoxidation von Benzol zu Phenol 16 2.4.3 Strategien zur Kofaktor-Regeneration während der Oxidation von Benzol und Propylen 17 3 Stand der Technik 20 3.1 Reaktorkonzepte für die Fermentation aerober, methano-tropher Bakterien 20 3.1.1 Kontinuierlicher Rührkesselreaktor 21 3.1.2 Blasensäulenreaktoren und Gaslift-Reaktoren 22 3.1.3 Membranbioreaktoren 24 3.1.4 Wirbelschicht- und Festbett-Reaktoren 27 3.2 Membranen zur blasenfreien Begasung von Nährmedien mit Methan und Sauerstoff 28 4 Materialien und Methoden 30 4.1 Membranscreening 30 INHALTSVERZEICHNIS - IX - 4.2 Stammhaltung und Vorkulturen 31 4.3 Zusammensetzung des Kultivierungsmediums 31 4.4 Verwendete Reaktortypen für die Fermentation von Methylosinus trichosporium OB3b 32 4.4.1 Kultivierung in Serumflaschen 32 4.4.2 Kultivierung im Schüttelkolben 32 4.4.3 Kultivierung im Rührkesselbioreaktor 33 4.4.4 Kultivierung im Hochzelldichtemembranbioreaktor 33 4.4.5 Kultivierung im neuartigen Doppelmembranbioreaktor 34 4.5 Analytische Methoden 35 4.5.1 Bestimmung der Biotrockenmasse 35 4.5.2 Quantifizierung der Formiatkonzentration mittels HPLC 35 4.5.3 Gaschromatographische Analyse (Mikro GC) 36 4.5.4 Quantifizierung leicht flüchtiger Substanzen mittels Echtzeit-Massenspektrometrie 36 4.6 Untersuchungen zum Einfluss des CO2-Gehaltes auf die Fermentation 38 4.7 Untersuchungen zur Toxizität von Propylenoxid und Phenol auf M. trichosporium OB3b 38 4.7.1 Wachstumsinhibierungstest mit kurzzeitiger Exposition 39 4.7.2 Wachstumsinhibierungstest mit Langzeitexposition 40 4.8 Ganzzellbiokatalyse mit M. trichosporium OB3b 40 4.8.1 Bestimmung einer geeigneten Biomassekonzentration für die Ganzzell-biokatalyse 40 4.8.2 Untersuchung eines einstufigen Prozesses zur Selektivoxidation von Pro-pylen und Benzol ohne Regeneration des Ganzzellbiokatalysators 41 4.8.3 Untersuchung eines mehrstufigen Prozesses zur Selektivoxidation von Propylen und Benzol mit sequenzieller Regeneration des Ganzzellbiokatalysators 42 4.8.4 Versuche zur Ganzzellbiokatalyse im Doppelmembranbioreaktor 43 4.9 Berechnung von Sekundärgrößen aus direkten Messwerten 44 5 Ergebnisse und Diskussion 46 5.1 Untersuchung verschiedener Membranen für einen neu entwickelten Doppelmembranbioreaktor 46 5.2 Fermentation von M. trichosprium OB3b 49 5.2.1 Kultivierung des Ganzzellbiokatalysators in ausgewählten Fermentationssystemen 50 5.2.2 Einfluss der Nährmedienzusammensetzung 54 5.2.3 Einfluss von CO2 auf das Wachstumsverhalten in Serumflaschen 57 5.2.4 Einfluss von CO2 auf das Wachstumsverhalten im Rührkesselreaktor 60 5.2.5 Gegenüberstellung ausgewählter Reaktorsysteme zur Herstellung des Ganzzellbiokatalysators 64 5.2.6 Zusammenfassung der Fermentationsergebnisse 67 INHALTSVERZEICHNIS - X - 5.3 Kontinuierliche Ganzzellbiokatalyse für die Oxidation von Propylen und Benzol 68 5.3.1 Einfluss der Konzentration von Propylenoxid und Phenol auf die Wachstumskinetik von Methylosinus trichosporium OB3b nach kurzzeitiger Exposition 70 5.3.2 Einfluss der Konzentration von Propylenoxid und Phenol auf die Wachstumskinetik von Methylosinus trichosporium OB3b bei dauerhafter Exposition 72 5.3.3 Einfluss der Biomassekonzentration auf die Selektivoxidation von Propylen und Benzol 74 5.3.4 Untersuchungen zur Selektivoxidation ohne Regeneration im Rührkesselreaktor 76 5.3.5 Sequenzielle Selektivoxidation von Propylen zu Propylenoxid mit intermittierenden Regenerationsphasen 78 5.3.6 Sequenzielle Selektivoxidation von Benzol zu Phenol mit intermittierenden Regenerationsphasen 88 5.3.7 Kontinuierliche Ganzzellbiokatalyse im Doppelmembranbioreaktor 94 5.3.8 Gegenüberstellung des Doppelmembranbioreaktors und des Rührkesselreaktors für die Ganzzellbiokatalyse 96 6 Zusammenfassung und Ausblick 99 7 Literaturverzeichnis 104 8 Anhang 117 8.1 Materialien und Methoden 117 8.1.1 Geräteliste 117 8.1.2 Verwendete Chemikalien 118 8.1.3 Verwendete Verbrauchsmaterialien 120 8.1.4 Zusammensetzung des verwendeten Kulturmediums 121 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS - XI - Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Beschreibung Einheit ADP Adenosindiphosphat - ATP Adenosintriphosphat - BTM Biotrockenmasse - C Elementarer Kohlenstoff - CH4 Methan - CO2 Kohlenstoffdioxid - C3H6 Propylen - C3H6O Propylenoxid - DMBR Doppelmembranbioreaktor - FADH Formaldehyddehydrogenase - FDA Formiatdehydrogenase - FIA Fließinjektionsanalyse - GC Gaschromatographie - HDC High density incubator HPLC High-performance liquid chromatography - HPPO Hydrogen peroxide to propylene oxide - IGB Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfah- renstechnik - k Kilo - KIT Karlsruher Institut für Technologie - M Molar (Mol L-1) M. trichosporium Methylosinus trichosporium - MDH Methanoldehydrogenase - MS Massenspektrometer - MBR Membranbioreaktor - MMO Methan-Monooxygenase MMOB Methan-Monooxygenase Regulatorisches Protein - MMOH Methan-Monooxygenase Hydroxylase - MMOR Methan-Monooxygenase Reduktase - MOB Aerobe, methanotrophe Bakterien - n Anzahl biologischer Replikate - ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS - XII - Abkürzung Beschreibung Einheit N Elementarer Stickstoff - NAD+ Nicotinamidadenindinukleotid - NADH Nicotinamidadenindinukleotid - NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate - NaCl Natriumchlorid - NaOH Natriumhydroxid - n.b. Nicht bestimmt - NMS Nitrate mineral salts - OD600nm Optische Dichte bei 600 nm - pH Potentia hydrogenii - pMMO Membrangebundene Methan-Monooxygenase - PO Propylenoxid - PTFE Polytetrafluorethylen - Pfinal Erreichte Biomassekonzentation g L-1 rpm Umdrehungen pro Minute - RuMP Ribulose-Monophosphat - SEM Secondary Electron Multiplier - sMMO Lösliche Methan-Monooxygenase - t Zeit (z.B. Kultivierungsdauer) (d); (h); (min) T Temperatur (°C) TS Trockensubstanz - UV Ultraviolet - V Volumen (L); (ml) (v/v) Verhältnis bezogen auf das Volumen (%) (w/w) Verhältnis bezogen auf das Gewicht - µX Spezifische Wachstumsrate (h-1) ABBILDUNGSVERZEICHNIS - XIII - Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematische Darstellung des Gesamtprozesses für die direkte Oxidation von Propylen zu Propylenoxid und Benzol zu Phenol. ....................................... 4 Abbildung 2: Schematische Darstellung der Epoxidationsreaktion von Propylen zu Proylenoxid. ......................................................................................................... 6 Abbildung 3: Herstellungsverfahren für Propylenoxid und ihr Marktanteil gezeigt am Beispiel der Jahre 2010 und 2015. ....................................................................... 7 Abbildung 4: Hauptroute des Chlorhydrin-Verfahrens. ............................................................. 8 Abbildung 5: Schematische Darstellung der Oxidationsreaktion von Benzol zu Phenol. ......... 9 Abbildung 6: Schematisierte Darstellung der Formaldehydassimilation. ................................ 11 Abbildung 7: Mikroskopische Aufnahme von Methylosinus trichosporium OB3b im Transmissionselektronenmikroskop. ................................................................. 12 Abbildung 8: Schematische Darstellung des Serinwegs. ......................................................... 13 Abbildung 9: Kristallstruktur der pMMO aus dem Organismus M. trichosporium OB3b ...... 16 Abbildung 10: Schematische Anordnung der sMMO-Untereinheiten ..................................... 17 Abbildung 11: Schematische Darstellung des Methan-Metabolismus mit den zugehörigen Enzymen. ........................................................................................................... 18 Abbildung 12: Übersicht über wesentliche Reaktortypen zur Kultivierung von MOB. .......... 21 Abbildung 13: Gezeigt ist der U-Loop-Reaktor zur Gasfermentation. .................................... 23 Abbildung 14: Aufnahmen der HDC10-Membranbioreaktoren der Firma CellDEG. ............. 25 Abbildung 15: Doppelmembranbioreaktor für die Kultivierung von MOB. ........................... 26 Abbildung 16: Strukturformel von Polydimethylsiloxan. ........................................................ 28 Abbildung 17: Membranreaktor zu blasenfreien Begasung von Zellkulturen. ........................ 30 Abbildung 18: Darstellung des neu entwickelten DMBR. ....................................................... 34 Abbildung 19: Fließbild des Aufbaus für die Fermentation von M. trichosporium OB3b im DMBR. .............................................................................................................. 35 Abbildung 20: Schematische Darstellung der Flüssigkeit und der Gase durch den Membraneinlass. ............................................................................................... 37 Abbildung 21: Schematischer Versuchsaufbau für die Echtzeit-Messung leicht flüchtiger Substanzen mit dem Massenspektrometer ........................................................ 37 Abbildung 22: Schematische Darstellung des Wachstumshinhibiertungstests nach 30- minütiger Exposition. ....................................................................................... 39 Abbildung 23: Schematische Darstellung des Wachstumsinhibierungstests bei dauerhafter Exposition der Zellen mit Phenol und Propylenoxid. ....................................... 40 Abbildung 24: Darstellung der drei im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Regenerationsstrategien. ................................................................................... 42 Abbildung 25: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur semikontinuierlichen Selektivoxidation im 1 L Rührkesselreaktor. ................................................... 43 ABBILDUNGSVERZEICHNIS - XIV - Abbildung 26: Fließbild für die Ganzzellbiokatalyse am Beispiel von Propylen zu Propylenoxid. .................................................................................................... 44 Abbildung 27: Konzentrationsprofil von Gasen durch eine Membran. ................................... 47 Abbildung 28: Konzentration von Sauerstoff über die Zeit bei Begasung von Wasser durch dichte Silikonmembranen. ................................................................................ 48 Abbildung 29: Blasenfreie Begasung von Wasser mit Methan über eine Silikonmembran. ... 49 Abbildung 30: Vergleich der Wachstumskinetik von M. trichosporium OB3b unter Verwendung von VE-Wasser, bidestilliertem Wasser und Milli-Q-Wasser. ... 51 Abbildung 31: Dargestellt ist die Wachstumskinetik von M. trichosporium OB3b im Rührkesselbioreaktor mit und ohne Kupfer. ..................................................... 52 Abbildung 32: Dargestellt ist die Wachstumskinetik von M. trichosporium Ob3b im kommerziell erhältlichen HDC10-Inkubator. ................................................... 53 Abbildung 33: Dargestellt ist die Wachstumskinetik von M. trichosporium Ob3b im neu entwickelten DMBR Reaktor. .......................................................................... 54 Abbildung 34 A-D: Gezeigt sind Wachstumskinetiken mit unterschiedlichen (A) Eisen-, (B) Ammonium-, (C) Nitrat- und (D) Phosphatkonzentrationen im NMS- Medium. ............................................................................................................ 55 Abbildung 35 E-F: Gezeigt sind Wachstumskinetiken mit unterschiedlichen NaNO3- Konzentrationen (E) im NMS-Nährmedium und das optimierte NMS- Medium (F) Kultiviert wurde in HDC10-Inkubatoren. .................................... 56 Abbildung 36: Einfluss von extern zugeführtem CO2 auf die Wachstumskinetik von M. trichosporium OB3b. ........................................................................................ 58 Abbildung 37: Zusammensetzung der Gase CO2, Sauerstoff und Methan ( % v/v) an drei unterschiedlichen Zeitpunkten während der Fermentation in Serumflaschen bei unterschiedlichen CO2-Konzentrationen. ................................................... 59 Abbildung 38: Dargestellt ist das Verhältnis von CO2 zu CH4 in der Gasphase zur Verdeutlichung der Stoffwechselaktivität. ....................................................... 59 Abbildung 39: Dargestellt sind Fermentationen im 1 L Rührkesselreaktor ohne Kupfer (A/a) und mit Kupfer im NMS-Medium (B/b). ................................................ 61 Abbildung 40: Wachstumskinetik von M. trichosporium OB3b in frischem NMS- Nährmedium im Anschluss an eine 30 min Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von Propylenoxid A und Phenol B sowie die metabolische Aktivität nach der Behandlung mit Propylenoxid C und Phenol D als Funktion des Verhältnisses von CO2 und CH4 zu Beginn und am Ende des Versuches.. ........................................................................................................ 71 Abbildung 41: Einfluss ausgewählter Propylenoxid- (A,C) und Phenol-Konzentrationen (B,D) auf das Wachstum von M. trichosporium OB3b bei dauerhafter Exposition.. ....................................................................................................... 73 Abbildung 42: Effekt der Biomassekonzentration auf die Selektivoxidation von Propylen zu Propylenoxid. ............................................................................................... 74 Abbildung 43: Effekt der Biomasse auf die Selektivoxidation von Benzol zu Phenol.. .......... 75 ABBILDUNGSVERZEICHNIS - XV - Abbildung 44: Verlauf der Eduktkonzentration (Benzol und Propylen) sowie der jeweiligen Produktkonzentration (Phenol und Propylenoxid) während der Ganzzellbiokatalyse mit M. trichosporium OB3b. ........................................... 78 Abbildung 45: Sequenzielle Epoxidation von Propylen zu Propylenoxid mit drei Epoxidationsphasen über eine Zeitspanne von jeweils 30 min mit intermittierenden Regenerationsphasen über jeweils 30 min. .......................... 81 Abbildung 46: Sequenzielle Epoxidation von Propylen zu Propylenoxid mit drei Epoxidationsphasen über eine Zeitspanne von jeweils 30 min mit intermittierenden Regenerationsphasen über jeweils 60 min. .......................... 82 Abbildung 47: Dargestellt ist Enzymaktivität der pMMO in Abhängigkeit von der Propylenkonzentration während der Ganzzellbiokatalyse. ............................... 83 Abbildung 48: Sequenzielle Epoxidation von Propylen zu Propylenoxid mit drei Epoxidationsphasen über eine Zeitspanne von jeweils 30 min mit Formiat als Elektronendonor. ......................................................................................... 86 Abbildung 49: Sequenzielle Oxidation von Benzol zu Phenol mit drei Oxidationsphasen über eine Zeitspanne von jeweils 30 min und drei Regenerationszyklen über jeweils 30 min. .................................................................................................. 89 Abbildung 50: Sequenzielle Oxidation von Benzol zu Phenol mit drei Oxidationsphasen über eine Zeitspanne von jeweils 30 min sowie einer intermittierenden Regenerationsphase von jeweils 60 min. .......................................................... 90 Abbildung 51: Sequenzielle Oxidation von Benzol zu Phenol mit drei Oxidationsphasen über eine Zeitspanne von jeweils 30 min mit Formiat als Elektronendonor. ... 91 Abbildung 52: Dargestellt ist die Abhängigkeit der Enzymaktivität der sMMO von der Benzolkonzentration während der Ganzzellbiokatalyse vor (Oxidation 1) und nach (Oxidation 2) der Regeneration der Zellen. ...................................... 94 Abbildung 53: Ganzzellbiokatalyse von Propylen zu Propylenoxid (A) und Benzol zu Phenol (B) durch M. trichosporium OB3b im neu entwickelten Doppelmembranbioreaktor (DMBR). ............................................................... 94 TABELLENVERZEICHNIS - XVI - Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Volumetrische Zusammensetzung des mod. NMS-Nährmediums. ........................ 31 Tabelle 2: Variation der Medienbestanteile ............................................................................. 32 Tabelle 3: Gaszusammensetzung für die Untersuchungen zum Einfluss von CO2 auf die Fermentation von M. trichosporium OB3b.............................................................. 38 Tabelle 4: Wachstumsraten von M. trichosporium OB3b bei ausgewählten CO2 Konzentrationen ....................................................................................................... 58 Tabelle 5: Vergleich relevanter Fermentationsparameter für die Kultivierung von MOB ohne und mit zusätzlicher Zugabe von CO2 in der Gasphase der in dieser Arbeit enthaltenen Daten mit bereits publizierter Daten von Acha et al. und Park et al.. .. 63 Tabelle 6: Vergleich des Leistungseintrages ausgewählter Reaktortypen ............................... 64 Tabelle 7: Fermentationsparameter für die Fermentation im RK, im DMBR und im HDC10-Inkubator .................................................................................................... 66 Tabelle 8: Spezifische Wachstumsraten nach 30-minütiger Exposition der Zellen mit Propylenoxid bzw. Phenol und anschließender Rekultivierung in frischem Nährmedium. ........................................................................................................... 72 Tabelle 9: Wesentliche Kenngrößen zur Selektivoxidation von Propylen zu Propylenoxid und Benzol zu Phenol im 20 mL Maßstab. .............................................................. 75 Tabelle 10: Vergleich wesentlicher Kenngrößen zur Selektivoxidation von Benzol- und Propylen zu Phenol- und Propylenoxid. ................................................................ 77 Tabelle 11: Enzymaktivität der pMMO bei der Epoxidierung von Propylen zu Propylenoxid über eine Zeitspanne von 30 min mit intermittierenden Regenerationsphasen über jeweils 30 min. ........................................................... 80 Tabelle 12: Enzymaktivität der pMMO bei der Epoxidation von Propylen zu Propylenoxid über eine Zeitspanne von 30 min mit intermittierenden Regenerationsphasen über jeweils 60 min. .............................................................................................. 81 Tabelle 13: Enzymaktivität der pMMO bei der Epoxidierung von Propylen zu Propylenoxid über eine Zeitspanne von 30 min mit Formiat als Elektronendonor. ................................................................................................... 84 Tabelle 14: Gemessene Formiatkonzentrationen während der Versuchsdurchführung. .......... 85 Tabelle 15: Enzymaktivitäten der sMMO bei der Oxidation von Benzol zu Phenol über eine Zeitspanne von 30 min mit intermittierenden Regenerationsphasen über jeweils 30 min........................................................................................................ 89 Tabelle 16: Enzymaktivitäten der sMMO bei der Oxidation von Benzol zu Phenol über eine Zeitspanne von 30 min mit intermittierenden Regenerationsphasen über jeweils 60 min........................................................................................................ 90 Tabelle 17: Enzymaktivitäten der sMMO bei der Oxidation von Benzol zu Phenol über eine Zeitspanne von 30 min mit Formiat als Elektronendonor. ............................ 92 Tabelle 18: Übersicht über die Formiatkonzentration während der sequenzielle Oxidation von Benzol zu Phenol zu ausgewählten Zeitpunkten über die gesamte Prozessdauer. ......................................................................................................... 92 TABELLENVERZEICHNIS - XVII - Tabelle 19: Verwendete Versuchsparameter sowie die erreichte maximale Produktkonzentration und Enzymaktivität für die Ganzzellbiokatalyse von Propylen und Benzol im DMBR. .......................................................................... 95 Tabelle 20: Ausgewählte Reaktor- und Prozesskenngrößen für die Selektivoxidation von Propylen zu Propylenoxid und Benzol zu Phenol im Rührkessel und im DMBR. .................................................................................................................. 97 Tabelle 21: Liste der verwendeten Geräte .............................................................................. 117 Tabelle 22: Liste der verwendeten Chemikalien .................................................................... 118 Tabelle 23: Liste der verwendeten Verbrauchsmaterialien .................................................... 120 Tabelle 24: Komponenten für die Zusammensetzung des NMS-Mediums. .......................... 121 Tabelle 25: Zusammensetzung des NMS-Mediums .............................................................. 121 EINLEITUNG - 1 - 1 Einleitung 1.1 Ausgangssituation Propylenoxid (PO) stellt ein wichtiges Zwischenprodukt bei der industriellen Herstellung von Polyetherpropylenen dar und bildet somit die Grundlage zur Produktion von maßgeschneider- ten Polyurethanen, welche z.B. bei der Schaumstoffherstellung für Matratzen, Isoliermateria- lien oder der Herstellung von Ausstattungselementen für Kraftfahrzeuge zum Einsatz kommen (Bernhard et al., 2017). Phenol wird zur Herstellung von verschiedenen pharmazeutischen Pro- dukten, Farbstoffen und Pflanzenschutzmitteln eingesetzt (Michałowicz and Duda, 2007). An- gesichts des Marktvolumens für Phenol von 23,17 Mrd. USD für das Jahr 2020 und 22,5 Mrd. USD für Propylenoxid im Jahr 2021 handelt es sich in beiden Fällen um Industriechemikalien von globaler Bedeutung (Expert market research, 2021; Markets and Markets, 2021). Die Produktion beider Chemikalien basiert bis zum heutigen Tag auf chemischen Verfahren, welche die Umwelt aus ökologischen Gesichtspunkten stark belasten. Wesentliche Gründe stel- len unerwünschte Nebenprodukte und ein hoher Energieverbrauch, verursacht durch hohe Pro- zesstemperaturen und den zur Synthese notwendigen hohen Druck, dar. Bei der Propylenoxid- herstellung über den derzeit primär eingesetzten Chlorhydrinprozess fallen beispielsweise große Mengen Calciumchlorid an. Bei der Phenolsynthese über das Hock‘sche Verfahren ent- steht neben Phenol auch ein sehr hoher Anteil Aceton. Eine detaillierte Erläuterung der Verfah- ren findet sich in den Kapiteln 2.1.1 und 2.1.2 dieser Arbeit (Bernhard et al., 2017; Weissermel and Arpe, 2008). Eine zukünftige Alternative zu konventionellen chemischen Verfahren kann die biotechnologi- sche Oxidation von Propylen zu Propylenoxid und Benzol zu Phenol mittels Ganzzellbiokata- lyse darstellen. Die enzymatische Oxidation kann in diesem Fall bei moderaten Temperaturen (30°C), ohne Einsatz toxischer Lösemittel und ohne Bildung von potentiell umweltschädlichen Nebenprodukten erfolgen (Colby et al., 1977; Higgins et al., 1979; Stanley et al., 1992; Stanley and Dalton, 1992). Eine Grundlage für ein solches Verfahren bildet das Enzym Methan-Monoxygenase (MMO), welches auf natürliche Weise durch aerobe, methanotrophe Bakterien (MOB), wie z.B. Methy- losinus trichosporium OB3b, gebildet wird. Anders als heterotrophe Bakterien sind MOB auf Basis der MMO in der Lage, Kohlenstoff ausgehend von Methan über Methanol als Intermediat zu assimilieren. EINLEITUNG - 2 - Das Treibhausgas Methan kommt natürlicherweise in Feuchtgebieten, Flussbetten, Seen und Ozeanen vor. Es entsteht aber auch durch anthropogene Quellen, wie z. B. Landwirtschaft, Mülldeponien, Erdgasspeicher sowie Biogasanlagen. Die Verwendung von Methan als Substrat für biotechnologische Verfahren ist nicht nur im Hinblick auf den fortschreitenden globalen Klimawandel, sondern auch aus ökonomischen Ge- sichtspunkten erstrebenswert. Bezogen auf den enthaltenen Kohlenstoff ist das gasförmige Sub- strat derzeit kostengünstiger verfügbar als klassische biotechnologisch eingesetzte Kohlenhyd- rate wie Glucose. Zudem steht Methan als Substrat im Gegensatz zu Glucose für biotechnolo- gische Prozesse nicht im direkten Konflikt mit der Verwendung als Nahrungsmittel. Es ist be- reits beschrieben, dass MOB Methan aus landwirtschaftlichen Biogasanlagen ohne weitere Aufbereitung in Gegenwart von Sauerstoff assimilieren können. Sie ermöglichen perspekti- visch somit eine stoffliche Nutzung des Gases, welches derzeit in etwa 9.500 Biogasanlagen in Deutschland erzeugt wird (Fischer, 2020; Mühlemeier et al., 2018). Derzeit können zwischen 289 Nm3 und 2179 Nm3 Methan abhänging von der Art und der Menge des eingesetzten Sub- strats pro Anlage produziert werden (FNR, 2021). Es ist bekannt, dass die MMO aufgrund ihres breiten Substratspektrums in der Lage ist, nicht nur Methan zu Methanol sondern auch weitere Alkane sowie ungesättigte, verzweigte, zykli- sche, aromatische und halogenierte Kohlenwasserstoffe (KW) zu hydroxylieren oder epoxidie- ren (Burrows et al., 1984; Colby et al., 1977; Grosse et al., 1999). Diese können somit in hö- herwertige Produkte umgewandelt werden (Patel et al., 2016; Sheets et al., 2016; Strong et al., 2015; Yoo et al., 2015; Zhang et al., 2016). Dabei ist die biokatalystische Epoxidierung von Propylen zu Proyplenoxid durch MOB bereits durch Hill et al. (1990) publiziert wurden. Die Oxidation von Benzol zu Phenol wurde bisher lediglich im kleinen Maßstab demostriert. (Burrows et al., 1984; Dalton et al., 1986; Hall, 1983; Higgins et al., 1981; Hyman et al., 1985). Eine wesentliche Herausforderung bei der Fermentation von MOB stellt die effektive Versor- gung der Mikroorganismen mit Methan dar. Das Gas ist schwer in Wasser löslich, so dass die Verfügbarkeit dieser Kohlenstoffquelle im wässrigen Kulturmedium bei hohen Zelldichten pri- mär durch den Stoffübergang von Methan in die wässrige Phase limitiert ist (Bowman and Sayler, 1994). Der Eintrag des Gases in einen Bioreaktor kann zudem – in Anwesenheit von Sauerstoff unter Ausbildung von Gasblasen – zu potentiell explosiven Gasgemischen führen. Ein Ansatz, um die genannte Herausforderung zu adressieren, kann eine blasenfreie Begasung, z.B. durch den Einsatz geeigneter Membranen, darstellen. Nach Kenntnisstand der Autorin EINLEITUNG - 3 - existieren bisher jedoch keine Untersuchungen zur blasenfreien Begasung von geeigneten Nährmedien mit Methan und Sauerstoff. Wenngleich die biokatalytische Epoxidierung von Propylen zu Propylenoxid und die Oxidation von Benzol zu Phenol bereits beschrieben wurde, fehlt es derzeit an grundlegenden Daten z.B. zur Toxizität der Edukte und Produkte auf MOB. Des Weiteren sind wesentliche Betriebspara- meter, wie eine geeignete Biomassekonzentration, zur Etablierung eines idealerweise kontinu- ierlichen Verfahrens auf Basis von Bioreaktoren derzeit nicht bekannt. Bisher wurde die Ver- wendung von Membranbioreaktoren zur blasenfreien Methan- und Sauerstoffversorgung weder für die fermentative Herstellung von MOB, noch für die Ganzzellbiokatalyse von Benzol- zu Phenol oder von Propylen- zu Propylenoxid beschrieben. 1.2 Zielsetzung Ein Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung des Ganz- zellbiokatalysators M. trichosporium OB3b zu erarbeiten. Unter der Nutzung des Enzyms Me- than-Monooxygenase soll anschließend ein Prozess zur Epoxidation von Propylen zu Propy- lenoxid sowie zur Oxidation von Benzol zu Phenol ohne Bildung von unerwünschten Kopro- dukten entwickelt werden (Abbildung 1). Hierbei ist ein Teilziel, die Lag-Phase des aeroben, methanotrophen Bakteriums (MOB) wäh- rend der Fermentation im Bioreaktor zu verkürzen. Aus der Literatur geht hervor, dass eine CO2-Zugabe – zusätzlich zum natürlichen CO2-Anteil in der Umgebungsluft – das initiale Wachstum von MOB positiv beeinflussen kann. Um diesen Sachverhalt zu untersuchen, sollen in dieser Arbeit, neben dem Einfluss verschiedener Nährmedienkomponenten (Kap. 5.2.2), auch die Auswirkungen unterschiedlicher CO2-Konzentrationen auf die Wachstumskinetik während der Fermentation von M. trichosporium OB3b gemessen werden (Kap. 5.2.3 und Kap. 5.2.4). Wie zuvor beschrieben, unterliegt die Fermentation von M. trichosporium OB3b aufgrund der Gefahr der Ausbildung von explosiven Sauerstoff-Methan-Gemischen sicherheitstechnischen Anforderungen. Es soll, in dieser Arbeit daher erstmals die Verwendung eines speziell zur Kul- tivierung und Ganzzellbiokatalyse mit MOB entwickelten neuartiger Doppelmembranbioreak- tor eingesetzt werden. Hierzu soll zunächst ein kommerziell erhältlicher Membranbioreaktor, sowohl zur fermentativen Herstellung von M. trichosporium OB3b als auch zur Biokatalyse beider zuvor genannter Reaktionen etabliert und anschließend mit einem konventionellen Rühr- kesselreaktor verglichen werden (Kap. 5.2.1, Kap. 5.2.5, Kap 5.2.6). Hierfür müssen zunächst EINLEITUNG - 4 - geeignete Membranen hinsichtlich Durchlässigkeit für die gasförmigen Substrate Methan und Sauerstoff charakterisiert werden. (Kap. 5.1). Abbildung 1: Schematische Darstellung des Gesamtprozesses für die direkte Oxidation von Propylen zu Propylenoxid und Benzol zu Phenol mittels Ganzzellbiokatalyse und der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen. Während die enzymatische Epoxidation von Propylen zu Propylenoxid mittels MOB bereits beschrieben wurde, ist bisher lediglich die prinzipielle Machbarkeit der Oxidation von Benzol zu Phenol gezeigt worden. Zur optimalen Prozessführung für beide Edukte fehlen jedoch Daten, z.B. hinsichtlich einer geeigneten Biomassekonzentration während der Ganzzellbiokatalyse mittels M. trichoproium OB3b. Weiterhin sind aktuell nur unzureichende Daten zur Toxizität von Propylenoxid und keine toxikologischen Daten zu Phenol für den genannten Organismus in der Literatur verfügbar. Auch im Hinblick auf eine geeignete Oxidations- sowie Regenerati- onszeit für M. trichoproium OB3b sind lediglich erste Untersuchungen zum Einfluss des Sub- strates Propylen publiziert. Daten zur Oxidation von Benzol mit M. trichosporium OB3b wur- den nach Wissensstand der Autorin bislang nicht publiziert. Ziel dieser Arbeit ist es daher, ge- eignete Reaktionsbedingungen und grundlegende Betriebsparameter – wie geeignete Oxida- EINLEITUNG - 5 - tions- und Regenerationsintervalle – und damit verbunden auch Prozessstrategien zur sequen- ziellen Produktabtrennung zu evaluieren, welche idealerweise eine stufenweise, semi-kontinu- ierliche Oxidation von Propylen und Benzol mit M. trichosporium OB3b ermöglichen. Zur Aufnahme von entsprechenden Edukt- und Produktkonzentrationen soll im Rahmen dieser Ar- beit erstmals ein Echtzeit-Membraneinlassmassenspektrometer eingesetzt werden (Kap. 5.3). Ein grundlegendes Verständnis wesentlicher Kenngrößen soll die Grundlage für ein Scale-up des Prozesses und somit auch für eine zukünftige industrielle Nutzung von methanotrophen Bakterien für die biotechnologische Herstellung von wichtigen Synthesebausteinen schaffen. THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 6 - 2 Theoretische Grundlagen In dieser Arbeit wurde der Organismus M. trichosporium OB3b als Ganzzellbiokatalysator für die Oxidation von Propylen zu Propylenoxid sowie Benzol zu Phenol eingesetzt. Im nachfol- genden Kapitel werden die für das Verständnis dieser Arbeit notwendigem theoretischen Grundlagen zusammengefasst. 2.1 Herstellverfahren für Propylenoxid und Phenol im industri- ellen Maßstab Die industrielle Produktion von Propylenoxid und Phenol basiert derzeit auf chemischen Ver- fahren. Bei den meisten chemischen Verfahren entstehen Nebenprodukte, die nur einen gerin- gen Marktpreis aufweisen oder deren Entsorgung zusätzliche Kosten verursacht. Eine direkte Oxidation von Propylen zu Propylenoxid oder von Benzol zu Phenol unter Vermeidung von Nebenprodukten ist daher aus industriellen und ökologischen Gesichtspunkten von großem In- teresse. In den nachfolgenden Kapiteln werden zunächst die aktuellen Verfahren zur Herstel- lung von Propylenoxid (Kap. 2.1.1) und Phenol (Kap. 2.1.2) beschrieben und anschließend bi- otechnologische Alternativen zur direkten Oxidation beider Stoffe aufgezeigt (Kap. 2.1.3). 2.1.1 Oxidation von Propylen zu Propylenoxid Propylen (C3H6) (CAS Nr: 115-07-1) ist ein Alken und zählt aufgrund seiner Doppelbindung zu den ungesättigten Kohlenwasserstoffen. Das in Wasser schwachlösliche Gas ist farb- und geruchlos. Mit Luft bildet Propylen ein leicht entzündliches Gemisch (GESTIS-Stoffdatenbank, 2020a). Durch Aufbrechen der Doppelbindung und Integration eines Sauerstoffatoms entsteht das Epoxid 1,2-Epoxypropan (Propylenoxid, PO) (CAS Nr: 75-56-9), welches zu den wichtigs- ten Grundbausteinen in der chemischen Industrie zählt (Abbildung 2). Abbildung 2: Schematische Darstellung der Epoxidationsreaktion von Propylen zu Proylenoxid. PO ist ein leicht entflammbarer Stoff mit der chemischen Formel C3H6O. Im Vergleich zu Pro- pylen ist es leicht in Wasser löslich (681 g l−1 bei 20 °C). PO ist farblos und weist einen ätheri- schen Geruch auf (GESTIS-Stoffdatenbank, 2020b; Kahlich et al., 2011). THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 7 - Es wird unter anderem bei der Synthese von Polyetherpropylenen für maßgeschneiderte Po- lyurethane eingesetzt, die beispielsweise bei der Schaumstoffherstellung für Matratzen, Isolier- materialien oder Ausstattungselemente im Auto zum Einsatz kommen, Anwendung finden (Bernhard et al., 2017). Basierend auf verschiedenen zumeist chemischen Herstellungsprozes- sen lag die produzierte PO Menge für das Jahr 2015 bei etwa neun Millionen Tonnen (Bernhard et al., 2017). Das globale Marktvolumen für PO beträgt im Jahr 2021 etwa 22,5 Mrd. USD und wird bis zum Jahr 2026 vorrausichlich auf etwa 29,5 Mrd. USD ansteigen (Markets and Mar- kets, 2021). Obwohl in den vergangenen Jahrzehnten an Verfahren zur umweltfreundlichen Produktion von PO geforscht wurde, stellt das Chlorhydrinverfahren bislang immer noch das bedeutendste Verfahren zur PO-Produktion dar. Die Verhältnisse der Marktanteile der einge- setzten Verfahren sind in in Abbildung 3 dargestellt (Bernhard et al., 2017). Abbildung 3: Herstellungsverfahren für Propylenoxid und ihr Marktanteil gezeigt am Beispiel der Jahre 2010 und 2015. Die Abbildung wurde aus Bernhard et al. 2017 übernommen. HPPO-Verfahren = „Hydrogen-Peroxide-to-Propylene-Oxide“- Verfahren, SMPO-Verfahren = „Styrol Monomer and Propylene Oxide“-Verfahren, MTBE-PO = „Methyl-tert-butyl-ether- Propylenoxide“-Verfahren, CU-PO = „Cumene-to-Propylene-Oxide“-Verfahren. Bei dem Chlorhydrinverfahren wird Propylen bei 35 bis 50 °C und 2 bis 3 bar mit Chlor und Wasser zu den zwei isomeren Propylenchlorhydrinen umgesetzt. Anschließend werden die er- haltenen Isomere zusammen mit einer Lösung aus Calciumhydoxid und Natriumhydroxid aus einer Blasensäule in einen weiteren Reaktor überführt. Dort findet bei ca. 25 °C die Dehydro- chlorierung der Chlorhydrine unter der Bildung von PO statt. Neben PO entstehen jedoch auch etwa 100 bis 150 kg des Koppelproduktes 1,2-Dichlorpropan pro Tonne PO, für welches es keinen bedeutenden Absatzmarkt gibt. Ein weiteres Problem liegt zudem in der Entstehung von ca. 2,1 t Calciumchlorid (CaCl2) und 2,2 t Natriumchlorid (NaCl) pro Tonne Propylenoxid (Ab- bildung 4). Die Entsorgung dieser Salze über das Abwasser resultiert in einer erheblichen Um- weltbelastung (Bernhard et al., 2017; Weissermel and Arpe, 2008). Die Hauptsyntheseroute des Chlorhydrinverfahrens ist in Abbildung 4 schematisch dargestellt. THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 8 - Abbildung 4: Hauptroute des Chlorhydrin-Verfahrens. Propylen wird mit Chlor und Wasser zu den zwei isomeren Propy- lenchlorhydrinen umgesetzt. In einem zweiten Schritt entsteht aus den Chlorhydrinen unter Abspaltung von Salzsäure Propy- lenoxid. Neben Propylenoyid entsteht zudem noch des Calziumchlorid (CaCl2). Die Graphik wurde aus Bernhard et al. 2017 übernommen. Weitere – wenngleich unbedeutendere – Verfahren zur Herstellung von PO sind das HPPO Verfahren („Hydrogen Peroxide to Propylene Oxide“-Verfahren) und der Oxiran-Prozess. Im Oxiran-Prozess wird zunächst ein organisches Hydroperoxid, z.B. aus Isobutan oder Ethylben- zol, gebildet. Diese werden zur Sauerstoffübertragung auf das Propylen eingesetzt. Als Kop- pelprodukte entstehen tert.-Butanol oder Methylphenylcarbinol. Diese Verfahren werden bei sehr hohen Temperaturen (bis 140 °C) und einem Druck von bis zu 60 bar durchgeführt. Aus diesem Grund konnte dieses Verfahren bislang noch keine wirtschaftliche Bedeutung erlangen (Bernhard et al., 2017; Winnacker, 2004). Des Weiteren entstehen auch zwischen 2,5 bis 3,5 t tert.-Butanol oder 2,2 bis 2,5 t Styrol, abhängig von den Ausgangschemikalien (Isobutan oder Ethylbenzol) pro produzierter Tonne PO (Kahlich et al., 2011). Als deutlich umweltfreundlichere Möglichkeit zur Synthese von PO gilt das HPPO-Verfahren. Bei diesem Verfahren wird Propylen mit Wasserstoffperoxid (H2O2) zu PO umgesetzt. Das einzige Nebenprodukt ist hierbei Wasser. Als limitierender Faktor für eine industrielle Anwen- dung erwies sich in der Vergangenheit die Verfügbarkeit des Eduktes H2O2. Aktuelle Verfahren beruhen auf der Verwendung eines Katalysators auf Silikat-Basis, welche ein redoxaktives Übergangsmetall enthalten (Bernhard et al., 2017). Wesentliche Nachteile dieses Verfahrens sind die hohen Kosten der Ausgangsmaterialien und die erheblichen Sicherheitsanforderungen aufgrund des Einsatzes von hochkonzentriertem Wasserstoffperoxid (Khatib and Oyama, 2015). THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 9 - 2.1.2 Oxidation von Benzol zu Phenol Das als Stammverbindung für aromatische Kohlenwasserstoffe bekannte Benzol (nach IUPAC Benzen) (CAS Nr: 71-43-2) ist ein flüssiger zyklischer Kohlenwasserstoff mit der Summenfor- mel C6H6. Benzol ist eine farblose Substanz mit einem charakteristischen aromatischen Geruch. Weiterhin handelt es sich um eine bei Atmosphärendruck leicht entzündbare Flüssigkeit. Phe- nolische Dämpfe können mit Luft explosive Gemische bilden. Die Löslichkeit in Wasser ist mit 1,77 g L-1 bei 20 °C sehr gering (GESTIS-Stoffdatenbank, 2021a). Benzol dient unter anderem als Lösemittel und als Intermediat für die Synthese von Phenol (CAS Nr: 108-95-2). Eine sche- matische Darstellung der Reaktion ist in Abbildung 5 gezeigt. Abbildung 5: Schematische Darstellung der Oxidationsreaktion von Benzol zu Phenol. Phenol besteht aus einer Phenylgruppe (-C6H5) und einer Hydroxygruppe (-OH) und hat die Summenformel C6H6O. Dieser farblose, kristalline Feststoff zeichnet sich durch einen durch- dringenden Geruch aus. Im Vergleich zu Benzol ist Phenol mit 84 g L-1 bei 20 °C gut löslich in Wasser (GESTIS-Stoffdatenbank, 2021b). Phenol ist vor allem zur Produktion von Phenolhar- zen von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung. Aber auch Farbstoffe, Arzneimittel (z.B. Ace- tylsalizylsäure) sowie viele weitere organische Substanzen können auf Basis von Phenol her- gestellt werden (Michałowicz and Duda, 2007). Der weltweite Bedarf an Phenol lag im Jahr 2015 bei etwa zehn Millionen Tonnen (Jeffrey S. Plotkin, 2021), wobei Phenol industriell hauptsächlich über das Hock-Verfahren (auch Cumolhydroperoxid-Verfahren) hergestellt wird. Hierbei wird zunächst über eine Alkylierung von Benzol mit Propen Cumol (IUPAC Propan- 2-ylbenzen) synthetisiert. Anschließend wird Cumol mit Sauerstoff bei ca. 130 °C und einem Druck von zwei bis fünf bar zu Hydroperoxid oxidiert, welches schlussendlich mit Säuren zu Phenol und Aceton gespalten wird. Wesentliche Nachteile dieses Verfahrens sind die Bildung von 0,62 t Aceton pro Tonne Phenol sowie die Tatsache, dass es sich um eine stark exotherme Reaktion handelt. Um eine unkontrollierte Reaktion zu vermeiden, muss die Anlage daher ge- kühlt werden (Jeffrey S. Plotkin, 2021; Schmidt, 2005). THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 10 - 2.1.3 Oxidation von Propylen zu Propylenoxid und Benzol zu Phenol Gegenüber den genannten chemischen Verfahren stellt die direkte Oxidation von Propylen zu Propylenoxid und von Benzol zu Phenol basierend auf dem Enzym MMO (Kap. 2.4.1) eine interessante biotechnologische Alternative dar . Hierfür kann das Enzym isoliert (in vitro) oder in Form von intakten Zellen (in vivo) eingesetzt werden (siehe Kap. 2.2) (Stanley et al., 1983; Stanley and Dalton, 1992). Wesentliche Vorteile der Ganzzellbiokatalyse sind unter anderem, dass die Zelllyse sowie die Enzymaufreinigung entfällt und die Zellen wiederholt verwendet werden können. Weiterhin ermöglicht die Ganzzellbiokatalyse eine einfache Implementierung von enzymatischen Kaskaden und die Versorgung mit Cofaktoren, die für die Biotransforma- tion benötigt werden, ist deutlich leichter (Lin and Tao, 2017). Durch die enzymatische Kata- lyse kann die Umsetzung beider Edukte bei moderaten Temperaturen (30 °C) erfolgen (Colby et al., 1977; Higgins et al., 1979; Stanley et al., 1992; Stanley and Dalton, 1992). Zudem ent- stehen bei der Reaktion keine toxischen oder umweltschädlichen Nebenprodukte. Bei der Oxidation mittels Ganzzellbiokatalyse diffundiert Propylen bzw. Benzol in die Zelle und wird durch die MMO umgesetzt. Die entstandenen Produkte PO und Phenol diffundieren anschließend aus der Zelle und liegen somit extrazellulär im Reaktionsmedium vor. Eine groß- technische Anlage zur direkten Oxidation von Kohlenwasserstoffen mittels aerober, methanot- ropher Bakterien existiert derzeit jedoch nicht. Wirtschaftliche Hindernisse stellen hierbei das langsame Wachstum der Organismen bedingt durch den schlechten Gastransfer der Kohlen- stoffquelle Methan und der schlechte Sauerstofftransfer dar. Weitere Hidnernisse für eine kom- merzielle Nutzung stellen die besonderen Sicherheitsanforderungen an die Fermentationsanla- gen, die bislang kurze maximale Oxidationsdauer von etwa einer Stunde sowie die Toxizität der Produkte auf die Zellen dar. Es ist ein wesentliches Ziel dieser Arbeit, die genannten Her- ausforderungen und Hindernisse zu adressieren, um der industriellen Verwendung methanot- ropher Bakterien unter Nutzung der MMO ein Stück näher zu kommen. Im Hinblick auf eine industrielle Anwendung sollen als ein wesentliches Ziel dieser Arbeit des- halb Möglichkeiten aufgezeigt werden, diese kritischen Prozesschritte ökonomischer zu gestall- ten. 2.2 Aerobe, methanotrophe Bakterien Aerobe, methanotrophe Bakterien (MOB) sind in der Lage, Methan als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen. Da sie basierend auf dieser Fähigkeit einen bedeutenden Beitrag THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 11 - zur veringerung der Methanemissionen leisten, sind MOB von erheblicher Bedeutung im glo- balen Kohlenstoffkreislauf (Hanson and Hanson, 1996; Park et al., 2002; Tol et al., 2003). Im Jahr 1970 wurden erstmals etwa einhundert Stämme durch Whittenbury isoliert, wodurch eine ausführliche Charakterisierung erfolgen konnte (Whittenbury et al., 1970b, 1970a). MOB sind gramnegative Bakterien und kommen hauptsächlich als Kokken, Vibrionen oder Stäbchen vor (Hanson and Hanson, 1996). Einige der MOB besitzen Flagellen und sind dadurch beweglich (Dedysh and Knief, 2018). Typischerweise werden MOB basierend auf ihrer 16S rRNA in drei Gruppen (Typ I, Typ II und Typ X) unterteilt. Vertreter von Typ I (z.B. Methylobacter, Methy- lomonas, Methylosoma uvm.) und Typ X (z.B. Methylococcus, Methylocalum) gehören zu den γ-Proteobakterien, welche den Ribulose-Monophosphat-Weg (RuMP) zur Kohlenstoffassimi- lation nutzen. Vertreter der Typ II methanotrophen Bakterien, wie z.B. Methylosinus, Methyl- ocystis, Methylocapsa, Methylocella, zählen zu den α-Proteobakterien und assimilieren den Kohlenstoff über den sogenannten Serinweg (Han et al., 2009; Hanson and Hanson, 1996). Im ersten Schritt des Kohlenstoffmetabolismus der MOB wird durch das Enzym Methan-Mo- nooxygenase (MMO) das Methan (CH4) zu Methanol (CH3OH) oxidiert. Die MMO kann dabei in membrangebundener Form (pMMO) oder als im Zytoplasma gelöste MMO (sMMO) vorlie- gen (detaillierte Beschreibung in Kap. 2.4). Im weiteren Verlauf wird das entstandene Methanol u.a. durch das Enzym Methanol-Dehydrogenase (MDH) zu Formaldehyd umgewandelt. An- schließend erfolgt abhängig vom jeweiligen Bakterienstamm die Assimilation des Kohlenstof- fes über den Serin- oder den Ribulose-Monophosphat-Weg (RuMP-Weg). Unter Bildung von CO2 wird im oxidativen Stoffwechsel Energie in Form von Reduktionsäquivalenten gewonnen (Acha et al., 2002; Merkx et al., 2001; Strong et al., 2015). Eine schematische Darstellung des Stoffwechselweges zeigt Abbildung 6. Abbildung 6: Schematisierte Darstellung der Formaldehydassimilation zur Biomassegewinnung mit den beteiligten Enzymen pMMO (membrangebundene Methan-Monooxygenase), sMMO (lösliche Methanmono-Oxygenase), MDH (Methanoldehyd- rogenase), FAD (Formaldehyddehydrogenase) und FDA (Formiatdehydrogenase). Die Abbildung wurde modifiziert nach (Acha et al., 2002). THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 12 - Das gebildete Kohlenstoffdioxid könnten MOB zur Bildung von Biomasse nutzen. So können beispielweise die α-Proteobakterien bis zu 50 % ihrer Biomasse aus CO2 assimilieren. Im Fall von γ-Proteobakterien liegt der Anteil hingegen bei lediglich 15 %. Für die Kultivierung von MOB – als wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit – bedeutet dies, dass die zur Verfügung ste- hende CO2-Konzentration einen Einfluss auf die jeweilige Wachstumskinetik der Bakterien ha- ben kann (Strong et al., 2015; Trotsenko and Murrell, 2008). Neben ihrer Fähigkeit Methan als Kohlenstoffquelle zu nutzen, können MOB eine Vielzahl industriell interessanter Wertstoffe synthetisieren (näher beschrieben in Kap. 2.4). Dies macht sie für eine Reihe biotechnologischer Applikationen interessant. Beispiele für Wertstoffe sind Single-Cell-Proteine (SCP), Biopolymere (PHB), Ectoin, Lipide und Vitamin B12 (Strong et al., 2015). Darüber hinaus sind sie aufgrund der geringen Selektivität der MMO in der Lage, Bodenschadstoffe wie Tri-chlorethen, Dichlormethan, Chloroform, Vinylchlorid oder Dichlo- rethen abzubauen (Hakemian and Rosenzweig, 2007; Oldenhuis et al., 1989; Sullivan et al., 1998). 2.3 Methylosinus trichosporium OB3b In dieser Arbeit wurde die prozesstechnische Verwendung des MOB Methylosinus trichospo- rium OB3b (M. trichosporium OB3b) als Ganzzellbiokatalysator untersucht. Die Abkürzung „OB3b“ steht für „odd ball Nr. 3b“ und beschreibt somit die typische kokkenförmige, runde Morphologie des Bakteriums. Eine Transmembranmikroskopaufnahme von M. trichosporium OB3b mit und ohne peripheren Transmembranstapeln ist in Abbildung 7 gezeigt. Abbildung 7: Mikroskopische Aufnahme von Methylosinus trichosporium OB3b im Transmissionselektronenmikroskop. A: Kultivierung mit Methan/Sauerstoff im Verhältnis 5:1 (v/v). Zu erkennen sind die peripheren Membranstapel, die auf eine pMMO-Aktivität hinweisen. B: Kultivierung mit Methan/Sauerstoff im Verhältnis 1:5 (v/v). Das Fehlen der peripheren Memb- ranstapel deutet auf sMMO-Aktivität hin. Der dargestellte Maßstabsbalken (jeweils links unten) entspricht 0,2 µm. Die Abbil- dung wurde übernommen aus Scott 1981 (Scott et al., 1981). THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 13 - M. trichosporium OB3b wurde erstmals durch Whittenbury et al. (Whittenbury et al., 1970b, 1970a) isoliert und beschrieben. Stein et al. sequenzierten schließlich im Jahre 2010 das ge- samte Genom (Stein et al., 2010). In der Natur kommt der Organismus überwiegend in den oberen Schichten von Mooren, Reisfeldern und Sumpfgebieten vor (Nazaries et al., 2013; Strong et al., 2015). Durch den anaeroben Abbau von organischem Material in tieferen Boden- schichten entsteht Methan. Durch die Atmosphäre gelangt Sauerstoff in die oberen Material- schichten, wodurch die Organismen sowohl mit Methan als auch Sauerstoff versorgt werden. Die optimalen Wachstumsbedingungen von M. trichosporium OB3b liegen bei einer Tempera- tur von 30 °C und einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0 (Park et al., 1991). Der Organismus gehört zu den bislang am besten untersuchten Typ II (α-Proteobakterien) MOB und stellt daher eine Art Modellorganismus für die Forschung dar. Wie in Kap. 2.2 beschrieben, nutzen Typ II me- thanotrophe Bakterien den Serinweg zur Kohlenstoffassimilation (Abbildung 8). Abbildung 8: Schematische Darstellung des Serinwegs. Ausgehend von der Kondensation von Methylentetrahydrofolat und Glycin wird Serin gebildet. Diese C3-Verbindung wird über eine Reihe von Transformationen zu Phosphoenolpyruvat umge- wandelt. Durch das Einspeisen von CO2 in den Serinzyklus kann im weiteren Verlauf Oxalacetat gebildet werden, wodurch anschließend Malat entsteht. Durch die Spaltung des Malat in zwei Kohlenstoffverbindungen entsteht wieder Glycin, womit der Zyklus geschlossen wird (Anthony, 1982; Dworkin et al., 2006). Hierbei wird ausgehend von der Kondensation von Methylentetrahydrofolat und Glycin das Serin gebildet. Diese C3-Verbindung wird über eine Reihe von Transformationen zu Phos- phoenolpyruvat umgewandelt. Durch das Einspeisen von CO2 in den Serinzyklus kann im wei- teren Verlauf Oxalacetat gebildet werden, wodurch anschließend Malat entsteht. Durch die Spaltung des Malats in zwei Kohlenstoffverbindungen entsteht wieder Glycin, wodurch der THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 14 - Zyklus geschlossen wird (Abbildung 8) (Anthony, 1982; Dworkin et al., 2006). Über den Ci- tratzyklus oder den Ribulose-5-phosohat- Weg wird Biomasse gebildet (Anthony, 2011). Für den Aufbau von Amino- bzw. Fettsäuren gelten Glycin bzw. Acetyl-CoA als Ausgangsmeta- bolite (Hanson and Hanson, 1996; Matsen et al., 2013). Damit im Serinweg das Phos- phoenolpyruvat zu Oxaloacetat umgewandelt werden kann, werden pro zwei Moleküle Formal- dehyd ein Molekühl CO2 benötigt (Acha et al., 2002; Anthony, 1982; Park et al., 1991). Dabei wird das benötigte CO2 vom Organismus selbst gebildet (Kap. 2.2). Wie z.B. durch Acha et al. und Park et al. beschrieben, entstehen bei Fermentationen von M. trichosporium OB3b jedoch zu Beginn einer Fermentation nur geringe Mengen CO2, weshalb durch die Zugabe von CO2 die anfängliche Lag-Phase verkürzt werden kann (Acha et al., 2002; Park et al., 1992, 1991). 2.4 Eigenschaften der Methan-Monooxygenase Die Aktivierung der sehr starken C-H Bindung (104 kcal mol-1) im Methanmolekül erfordert hohe Temperaturen und es entstehen Nebenprodukte. Die MMO katalysiert die Reaktion von Methan zu Methanol hingegen bei niedrigen Temperaturen (30 °C) ohne die Bildung von Ne- benprodukten (Balasubramanian et al., 2010). Die MMO stellt somit das Schlüsselenzym im Metabolismus der MOB dar. Die Hydroxylierungsreaktion läuft nach folgender Gleichung ab (Tinberg and Lippard, 2011). CH4 + O2 + NADH + H+ → CH3OH + H2O + NAD+ (I) Wie in Kap. (2.2) bereits erwähnt, kann die MMO als membrangebundene pMMO oder auch als lösliche sMMO vorliegen. Bei methanotrophen Bakterien hängt das Vorkommen von pMMO und sMMO entscheidend von der Kupferkonzentration im vorliegenden Nährmedium ab. So wird bei hohen Kupferkonzentrationen (>2.5 mmol g-1 Zellen) die pMMO gebildet, wohin- gegen in Abwesenheit von Kupfer die sMMO synthetisiert wird (Dalton et al., 1986; Davis et al., 1987; Park et al., 1991; Scott et al., 1981; Stanley et al., 1992, 1983). Beide Enzyme weisen eine unterschiedliche Aminosäuresequenz auf und sind auf jeweils unterschiedliche metalli- sche Cofaktoren angewiesen (Dalton, 2005; Hakemian and Rosenzweig, 2007; Trotsenko and Murrell, 2008). Mit der Ausnahme der Gattungen Methylocella und Methyloferula wird die pMMO von allen MOB exprimiert (Dedysh et al., 2015). Die sMMO findet sich hingegen nur in wenigen MOB, wie beispielsweise M. trichosporium OB3b. Wie von Trotsenko und Murrel publiziert, kann die Ausbildung der pMMO bei M. trichosporium OB3b zu einer gegenüber der sMMO um etwa 34 % erhöhten Methankonversion führen (Trotsenko and Murrell, 2008). THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 15 - Beide MMOs sind in der Lage, neben Methan weitere Kohlenwasserstoffe zu hydroxylieren als auch zu epoxidieren. Wie zuvor erwähnt, ist die Methankonversion mit der pMMO effizienter, dafür ist die sMMO weniger selektiv und kann verwendet werden, um längere und komplexere Kohlenwasserstoffe zu hydroxylieren oder zu epoxidieren (detaillierte Beschreibung in 2.4.1 und 2.4.2). Auch der in dieser Arbeit eingesetzt Organismus M. trichosporium OB3b ist in der Lage, sowohl die sMMO als auch die pMMO zu exprimieren. Diese Tatsache macht den Orga- nismus für den Einsatz als Ganzzellbiokatalysator für die Oxidation von Propylen zu Propylen- oxid und von Benzol zu Phenol interessant. Weiterhin handelt es sich bei der MMO um ein wachstumsassoziiertes Enzym. Dies bedeutet, dass mit zunehmender Biomassekonzentration die Biokonversionsrate erhöht wird (Xin et al., 2002, 2003, 2010). Die nachfolgen Kapitel 2.4.1 und 2.4.2 geben einen Einblick in die Struktur und Funktionsweise beider Enzyme. Eine detailliertere Beschreibung der Struktur und Funktion sind in den Arbeiten von Chan et al. (2004), Dalton (2005), Hakemian and Rosenzweig (2007), Lieberman und Ro- senzweig (2004) zu finden (Chan et al., 2004; Dalton, 2005; Hakemian and Rosenzweig, 2007; Lieberman and Rosenzweig, 2004). 2.4.1 Membrangebundene Methan-Monooxygenase für die Selektivoxidation von Propylen zu Propylenoxid Die pMMO besteht aus den drei Untereinheiten α (pmoA), β (pmoB) sowie γ (pmoC) und ist in einem α3β3γ3-Trimer angeordnet (Hakemian and Rosenzweig, 2007; Lieberman and Rosen- zweig, 2004). Die drei Untereinheiten haben eine Größe von jeweils etwa 26 kDa (α), 45 kDa (β) bzw.23 kDa (γ). Die pMMO ist intrazellulär in cytoplasmatischen Membranstapeln lokali- siert (Scott et al., 1981). Bislang wurde davon ausgegangen, dass das aktive Zentrum des En- zyms aus zwei Eisenatomen und ca. 15 Kupfer Atomen pro Molekül besteht (Trotsenko and Murrell, 2008). Blasubramanian et al. (2010) widerlegten diese Theorie jedoch und zeigten, dass das aktive Zentrum lediglich zwei Kupferatome aufweist. Des Weiteren fanden sie heraus, dass das aktive Kupferzentrum nicht innerhalb der Membran, sondern in der N-terminalen lös- lichen pmoB- bzw. spmoB-Untereinheit lokalisiert ist. Rekombinante spmoB-Fragmente bin- den Kupfer und weisen eine Methan- und Propylenoxidationsaktivität auf (Balasubramanian et al., 2010). Die Kristallstruktur der pMMO ist in Abbildung 9 dargestellt. Das Reduktionsmittel für die pMMO ist bislang noch nicht ganz geklärt (Hakemian and Rosenzweig, 2007). In-vitro kann NADH als Reduktionsmittel fungieren. In aufgeschlossenen Zellen führte jedoch nur die Zu- gabe von Quinolin zu einer Enzymaktivität (Basu et al., 2003; Lieberman et al., 2003; Zahn and THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 16 - DiSpirito, 1996). Mit Douroquinon als natürliches Reduktionsmittel wurden hierbei die besten Ergebnisse erzielt (Shiemke et al., 1995; Trotsenko and Murrell, 2008). Abbildung 9: Kristallstruktur der pMMO aus dem Organismus M. trichosporium OB3b (Proteine Data Bank, 2020). Die Un- tereinheiten pmoA und pmoB sind innerhalb der Membran lokalisiert. In der Untereinheit pmoB ist das aktive Zentrum loka- lisiert. Neben Methan kann die pMMO Alkane bis zu einer Länge von 5-C-Atomen, wie beispielsweise Propylen sowie einige halogenierte Kohlenwasserstoffe hydroxylieren oder epoxidieren (Burrows et al., 1984; Merkx et al., 2001; Xin et al., 2002). Bei der Oxidation von Propylen aktiviert die MMO zunächst den molekularen Sauerstoff und oxidiert dann das Propylen zu Propylenoxid (Avdeeva and Gvozdev, 2019). 2.4.2 Lösliche Methan-Monooxygenase für die Selektivoxidation von Benzol zu Phenol Die sMMO ist im Cytoplasma lokalisiert und besteht aus drei Komponenten, einer Hydroxylase (MMOH), einer Reduktase (MMOR) und einem regulatorischen Protein (MMOB) (Scott et al., 1981). Als natürliches Reduktionsmittel dient NADH (Fox et al., 1989; Semrau et al., 2010). Die MMOH besteht aus drei Polypeptiden, welche als ein α2β2γ2-Dimer angeordnet sind. Die Peptide weisen eine Größe von jeweils etwa 60 kDa (α), 45 kDa (β) bzw. 20 kDa (γ) auf. In- nerhalb der α-Untereinheit der MMOH befindet sich das aktive Zentrum (Merkx et al., 2001). THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 17 - Es besteht aus einem Glutamat- und Histidin-verbrückten Nicht-Häm-Dieisen-Zentrum und ist in einer bis-µ-hydroxo-Struktur angeordnet (Wang et al., 2015). Die MMOR hat eine Größe von etwa 38 kDa und dient dem Elektronentransfer von NADH zum aktiven Zentrum. Das regulatorischen Protein (MMOB) ist für die Enzymaktivität verantwortlich und weist eine Größe von etwa 15 kDa auf (Dalton, 2005; Ross and Rosenzweig, 2017; Trotsenko and Murrell, 2008). Das natürliche Reduktionsmittel der sMMO ist NADH (Fox et al., 1990; Semrau et al., 2010). Die Kristallstruktur ist in Abbildung 10 dargestellt. Abbildung 10: Schematische Anordnung der sMMO-Untereinheiten (links). Kristallstruktur der Hydroxylase und des regula- torischen Komplexes mit kleinen organischen Carboxylat-Gruppen im aktiven Zentrum der sMMO aus M. trichosporium OB3b (rechts) (Protein Data Bank, 2020) Neben Methan kann die sMMO Alkane (bis C 8) sowie ungesättigte, verzweigte, zyklische, aromatische und halogenierte Kohlenwasserstoffe (KW) hydroxylieren oder epoxidieren (Burrows et al., 1984; Colby et al., 1977; Grosse et al., 1999). Damit ist ihr Substratspektrum größer als das der pMMO. Diese Tatsache macht die sMMO aus industrieller Sicht für einen Einsatz in der Bodensanierung, aber auch für die Anwendung als Biokatalysator, interessant (Dalton, 2005; Sullivan et al., 1998). 2.4.3 Strategien zur Kofaktor-Regeneration während der Oxidation von Benzol und Propylen Wie zuvor erwähnt, kann abhängig vom jeweiligen Substrat bzw. Zielprodukt, sowohl die sMMO als auch die pMMO zur Ganzzellbiokatalyse eingesetzt werden (Kap. 2.4.1 und Kap. 2.4.2). In bisherigen Untersuchungen zeigte sich, dass eine Cofaktorregeneration für die Oxidation von Propylen zu Propylenoxid und von Benzol zu Phenol in beiden Fällen unerläss- lich ist (Hou, 1984; Stanley et al., 1992; Xin et al., 2002). Im natürlichen Stoffwechsel der MOB werden die Cofaktoren durch eine Enzymkaskade regeneriert. In Abbildung 11 ist der Methan- THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 18 - Metabolismus mit den zugehörigen Enzymen schematisch dargestellt. Zusätzlich zeigt Abbil- dung 11 die Oxidation von Benzol zu Phenol mit der sMMO und die Epoxidierung von Propy- len zu Propylenoxid mittels pMMO. Sowohl Propylen als auch Benzol stellen hierbei soge- nannte Nichtwachstumssubtrat dar. Die Oxidation von Methan wird in Anwesenheit der Nicht- wachstumssubrate inhibiert. Das bedeutet, dass der Organismus während der Biokatalyse bei- der Edukte nicht in der Lage ist, ausreichend Cofaktoren zu regenerieren (Higgins et al., 1979; Xin et al., 2010). Abbildung 11: Schematische Darstellung des Methan-Metabolismus mit den zugehörigen Enzymen sMMO (lösliche Methan- Monooxygenase), pMMO (membrangebundene Methan-Monooxygenase), MDH (Methanol-dehydrogenase), FADH (Formal- dehyddehydrogenase) und FDH (Formiatdehydrogenase). Zusätzlich sind die Oxidationsreaktionen von Propylen zu Propylen- oxid und Benzol zu Phenol inklusive der Kofaktorregenerieung skizziert. Modifiziert nach Hanson und Hanson (Hanson and Hanson, 1996). Ohne die Zugabe eines zusätzlichen Elektronendonors endet die Oxidationsreaktion von Alka- nen, Alkenen oder zyklischen Kohlenwasserstoffen mittels Methan-Monooxygenase, sowohl bei der pMMO als auch sMMO, bereits nach wenigen Minuten (Stanley and Dalton, 1992). Durch die gezielte Bereitstellung des Elektronendonors NADH oder dessen fortlaufende Be- reitsstellung über einen Regenerationszyklus durch die Zugabe von Formiat, Formaldehyd, Me- thanol oder Methan, kann die Oxidationsreaktion hingegen verlängert werden (Hou, 1984; Stanley et al., 1992; Stanley and Dalton, 1992). Die toxische Wirkung von Formiat, Formalde- hyd und Methanol auf lebende Zellen hat zufolge, dass diese potentiellen Substrate bei einer Ganzzellbiokatalyse nur in geringen Konzentrationen (Methanol > 2 mM, Formiat > 3 mM) THEORETISCHE GRUNDLAGEN - 19 - zugeführt werden können. Zudem handelt es sich bei den genannten Stoffen um kostenintensive Substanzen, weshalb die Regeneration mit Methan aus ökomischen Gesichtspunkten eine sehr vielversprechende Alternative darstellt (Xin et al., 2002). Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Regenerationsstrategien zur sequenziellen, mehrstufigen Regeneration der MMO auf Basis von Methan und Formiat erarbeitet (siehe Kap. 5.3.5 und 5.3.6). STAND DER TECHNIK - 20 - 3 Stand der Technik In dieser Arbeit wurden sowohl ein Rührkesselreaktor als auch erstmals zwei Membranbiore- aktoren hinsichtlich der Fermentation von MOB zur Herstellung der sMMO und pMMO als auch der prozesstechnischen Durchführung der Ganzzellbiokatalyse von Benzol- und Propylen zu PO bzw. Phenol, untersucht. Alle wesentlichen, bislang für die biotechnologische Nutzung von MOB eingesetzten, Bioreaktoren werden in den folgenden Kapiteln beschrieben (Kap. 3.1.1 bis 3.1.4). Weiterführend wird zudem auf die Möglichkeit der blasenfreien Begasung mit- tels Membranen hinsichtlich eines effizienten Gaseintrages in flüssige Medien eingegangen (Kap. 3.2). 3.1 Reaktorkonzepte für die Fermentation aerober, methano- tropher Bakterien Für biotechnologische Anwendungen stehen derzeit eine Vielzahl von Reaktortypen zur Ver- fügung. Für die Fermentation von MOB werden bislang hauptsächlich der klassische Rührkes- selreaktor (engl. „stirred-tank reactor“, „STR“) im Satzbetrieb und im kontinuierlichen Betrieb (engl. „continuous stirred-tank reactor“, CSTR) eingesetzt. Die größte technische Herausforde- rung bei der Gasfermentation im großen Maßstab ist ein effizienter Eintrag der schwer löslichen gasförmigen Substrate in die wässrige Phase (Mühlemeier et al., 2018; Munasinghe and Khanal, 2011). Wesentliche Einflussfaktoren auf die Gaslöslichkeit und die Transferrate sind die Tem- peratur, der Druck, die Medienzusammensetzung, der Oberflächenkontaktbereich der Gase (Gasblasengröße) sowie die Durchmischung des Reaktors (Chmiel, 2011). Eine detaillierte Übersicht über alle wesentlichen Reaktortypen zur Gasfermentation findet sich im Buch „Methane Biocatalysis: Paving the Way to Sustainability“(Kalyuzhnaya and Xing, 2018; Mühlemeier et al., 2018). Abbildung 12 gibt einen Überblick über alle wesentlicheen Reaktortypen. Diese werden im Einzelnen in den nachfolgenden Kapiteln genauer beschrieben. STAND DER TECHNIK - 21 - Abbildung 12: Übersicht über wesentliche Reaktortypen zur Kultivierung von MOB. Die roten Pfeile illustrieren den jeweiligen Gasfluss. Die blauen Pfeile zeigen den Stoffstrom. Die Abbildung wurde übernommen aus Mühlemeier et al. und geringfügig modifiziert (Mühlemeier et al., 2018). 3.1.1 Kontinuierlicher Rührkesselreaktor Der in der Biotechnologie am umfangreichsten charakterisierte und am häufigsten eingesetzte Reaktor ist der Rührkesselreaktor (engl. „Stirred tank reactor“, STR) (Chmiel, 2011; Ka- lyuzhnaya and Xing, 2018). Der kontinuierlich betriebene Rührkesselreaktor (engl. „Conti- nuous stirred tank reactor“, CSTR) erlaubt es, viele Fermentationsparameter zu variieren. Ty- pischerweise besteht der Reaktor aus einem schlanken Glasbehälter welcher über Pratzen, Trag- ringe oder eine Standzarge fixiert wird. Über ein Rührwerk, welches über eine Antriebsstange STAND DER TECHNIK - 22 - mit Motor und Getriebe von oben eingebaut ist, wird die Flüssigkeit im Reaktor durchmischt, sodass idealerweise weder Konzentrations- noch Temperaturgradienten entstehen. Zudem kön- nen pH-Elektroden zur pH-Überwachung und -Regelung, Temperaturfühler zur Temperatu- rüberwachung und -regelung angeschlossen werden. Ist es notwendig den Reaktor zusätzlich mit Gas zu versorgen, werden die Gase meist über eine Leitung unterhalb des Rührers in den Reaktor eingespeist. Durch den Rührer werden die Gase dispergiert und im Reaktor verteilt (Chmiel, 2011). Steigt allerdings der volumetrische Gasanteil im Hinblick auf das Gesamtvo- lumen des Reaktors, ist der CSTR nicht mehr effizient einsetzbar (Petersen et al., 2017; Villa- dsen et al., 2011). So können sich beispielsweise bei einem zu hohen Gasanteil Hohlräume um den Rührer bilden. Dies führt zu einer Minderung der ins flüssige Medium eingebrachten Ener- gie und hat somit auch Einfluss auf den Massentransfer im Reaktor (Nienow and Lilly, 1979). Aus den genannten Gründen eignet sich der CSTR auch nur sehr bedingt für die großtechnische Produktion von SCP (Petersen et al., 2017). Für die Fermentation von MOB wurde der CSTR beispielsweise von Gilman et al. 2015 zur Untersuchung des Effektes einer Methan- und Sauerstofflimitierung auf den Organismus Me- thylomicrobium buryatense 5GB eingesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 30 °C, einer relativ hohen Rührerdrehzahl von 1000 rpm sowie bei pH 8,8. Zur Substratversorgung wurden die Gase Methan und Sauerstoff vorab gemischt (Gilman et al., 2015). Wesentlich früher führten Park et al. (1991/1992) Fermentationen im CSTR durch. Ziel ihrer Arbeit war es, die pMMO- Synthese bzw. die sMMO-Synthese im Organismus M. trichosporium OB3b zu optimieren. Während der pMMO-Synthese erfolgte die Einleitung der Gase Methan und Sauerstoff in den Reaktor getrennt voneinander. Methan wurde mit 600 mL min-1 und Sauerstoff mit 200 mL min-1 zudosiert. Die Temperatur des Reaktors wurde auf 30 °C gehalten und der pH- Wert lag zwischen 4,2 und 6,8. Durchmischt wurde die Flüssigphase bei einer Rührerdrehzahl von 500 rpm. Außerdem wurde während der Fermentation eine Verdünnungsrate von 0,06 h-1 eingestellt (Park et al., 1992, 1991). Die durch Park et al. publizierten Betriebsparameter bilden eine erste Grundlage zur Fermentation von M. trichosporium OB3b im CSTR und dienten daher auch als Basis für die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Fermentationsversu- che. 3.1.2 Blasensäulenreaktoren und Gaslift-Reaktoren Bei Blasensäulen oder auch Gaslift-Reaktoren handelt es sich um Bioreaktoren, welche in der Biotechnologie für Fermentationen mit großen Gasvolumenströmen eingesetzt werden. Durch das Einbringen der Gase am unteren Ende des Reaktors wird eine Durchmischung der flüssigen STAND DER TECHNIK - 23 - Phase erzielt. Dies ermöglicht einen Betrieb ohne weitere mechanische Mischer und somit ohne zusätzlichen Energieeintrag. Wird der Blasensäulenreaktor durch ein coaxiales Rohr oder ein seitliches Rohr zur Mediumsrückführung erweitert, spricht man von einem Gaslift-Reaktor. Durch die zusätzliche Mediumsrückführung wird die Durchmischung im Reaktor verbessert. Bedingt durch den vergleichsweise geringen Energieeintrag sind Gaslift-Reaktoren im indust- riellen Maßstab, im Vergleich zu herkömmlichen CSTR, deutlich interessanter für Gasfermen- tationen. Zudem ist der volumenbezogene Stoffübergangskoeffizient (kLa) mit 200 - 1800 h-1 deutlich höher als im CSTR mit 50 - 500 h-1 (Bredwell et al., 1999; Chmiel, 2011; Yazdian et al., 2012). Zur Verbesserung der Rezirkulation der Gase kann zusätzlich eine Düse in den Re- aktor integriert werden. Folglich wird in diesem Fall von einem Loop-Reaktor gesprochen. Die Düse dispergiert die Gase und als Folge des entstehenden Differentialdruckes wird eine Rezir- kulation der Gase erreicht. Loop-Reaktoren können im Labormaßstab und im industriellen Maßstab mit einem Volumen von bis zu 3000 m3 betrieben werden (Baerns et al., 2014). Eine weitere Modifikation des Loop-Reaktors stellt der U-Loop-Reaktor dar (Abbildung 13). Abbildung 13: Gezeigt ist der U-Loop-Reaktor zur Gasfermentation. (1) Entgasungseinheit, (2) Kontinuierliche Ernte der Biomasse, (3) CO2-Auslass, (4) Pumpendüse, (5) Einlass für das Nährmedium, (6) Propeller Pumpe, (7) Kühlung, (8) stati- sche Mischer (Petersen et al., 2017; Unibio, 2020). Dieser unterscheidet sich hinsichtlich des klassischen Loop-Reaktors durch ein vertikales Rohr, in dem die Gas- und die Flüssigphase durch statische Mischer durchmischt werden. Der zylind- rische Tank oberhalb des U-Rohrs dient dabei als Entgasungseinheit. Um dem Prozess etwaige durch den Stoffwechsel der verwendeten Mikroorganismen gebildeten Gase zu entziehen, ist STAND DER TECHNIK - 24 - ein Rohrwärmetauscher integriert (Petersen et al., 2017). Wesentlicher Nachteil dieses Reak- torsystems ist die Tatsache, dass bei hohen Biomassekonzentrationen die durch die notwendige Pumpe verursachten Energiekosten steigen und sich der Gastransfer bei hohen Biomassekon- zentrationen deutlich verschlechtert (Stone, 2017). Anwendung findet der U-Loop-Reaktor im industriellen Maßstab bei der Produktion von Single Cell Proteinen (SCP) auf Basis des Orga- nismus Methylococcus capsulatus. Ein entsprechender Prozess wird derzeit beispielsweise von der Firma Unibio durchgeführt (Unibio, 2020). 3.1.3 Membranbioreaktoren Membranbioreaktoren (MBR) werden in der Biotechnologie meist zur Dialyse, in der Abluft- reinigung oder zur Zellrückhaltung eingesetzt (Chmiel, 2011). In MBR können Zellen frei oder immobilisiert vorliegen. Die Integration sogenannter dichter Membranen (Lösungs-Diffusions- Membranen) in einen Bioreaktor ermöglicht eine blasenfreie Begasung (Kahlig, 2018). Dies hat z.B. gegenüber CSTR den Vorteil, dass die Bildung explosiver Gasgemische bei der Fer- mentation von MOB mit Sauerstoff und Methan verhindert werden kann1 (Yaws and Braker, 2001). Bei Nutzung makroporöser Membranen kann die blasenfreie Begasung jedoch nur bei sehr niedrigem Druck erfolgen, da sonst zweiphasige Gemische entstehen können. Beispiels- weise legten Pen et al. (2014) einen Druck von ca. 0,13 bar an die integrierte makroporöse Membran an (Pen et al., 2014). Die Verwendung von dichten Membranen ermöglicht hingegen das Anlegen von höherem Druck. In dieser Arbeit wurden bis zu 4 bar Druck auf die Membran angelegt (Kap. 5.1). In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals geschüttelte Bioreaktoren zur blasenfreien Bega- sung von MOB eingesetzt, wie sie typischerweise in der Algenbiotechnologie eingesetzt wer- den, um eine ausreichende CO2-Versorgung der photoautotrophen Organismen zu gewährleis- ten. Die sogenannten Hochdichtekultivatoren (engl. „High-Density Cultivators“, HDC) sind mit einer 40 µm dünnen hydrophoben Polypropylen-Membran (TreoPore PDA 40) ausgestat- ten, welche den Boden der Reaktoren bilden (siehe Abbildung 14). Die Gase werden an der Membran vorbeigeleitet und gelangen durch diffusiven Stofftransport in das flüssige Medium. 1Für ein Methan-Luftgemisch liegt die untere Explosionsgrenze bei einem Methananteil von etwa 5 % und die obere Explosionsgrenze bei etwa 15 % (Yaws and Braker, 2001). STAND DER TECHNIK - 25 - Die, bedingt durch den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorgansimen entstehenden Gase kön- nen über eine zweite, in den Deckel des Reaktors integrierte Membran, entweichen (Bähr et al., 2016; CellDEG, 2020). Diese kommerziell erhältlichen Reaktoren bieten den Vorteil, dass die Kulturen blasenfrei begast werden können. Zudem bieten sie die Möglichkeit bis zu 45 Inku- batoren gleichzeitig zu verwenden. Das maximale Kultivierungsvolumen beträgt 2 L. In der Literatur sind bislang keine Fermentationsprozesse von MOB mittels Membranbioreaktoren beschrieben. Abbildung 14: Aufnahmen der HDC10-Membranbioreaktoren der Firma CellDEG. Zu erkennen ist die Kultivierungsplattform mit den zugehörigen HDC10-Inkubatoren (links) sowie ein einzelner 10 mL-Inkubator (rechts) (CellDEG, 2020). Im Hinblick auf Membranreaktoren wurden bislang hauptsächlich Prozesse zur Herstellung von Methanol mit MOB beschreiben. Pen et al. (2014) nutzten beispielsweise makroporöse Holfa- sermodule um MOB während der Methanolsynthese mit Methan und Luft zu versorgen (Pen et al., 2014). Auf DEAE-Zellulose-Membranen immobilisierte M. trichosporium OB3b Zellen wurden von Mehta et al. (1991) zur Produktion von Methanol eingesetzt (Mehta et al., 1991). Die Versorgung der Zellen erfolgte hierbei mit einem Methan-Sauerstoff Gemisch im Verhält- nis 1:2. Die Experimente wurden bei 35 °C und pH 6,4 in 100 mM Phosphatpuffer mit 5 mM MgCl2 durchgeführt. Yu et al. (2003) demonstrierten die Verwendung eines MBR zur Zellrück- haltung. Hierbei wurde ein Hohlfasermembranmodul zur Zellrückhaltung verwendet. Dadurch wurde eine definierte Kupferkonzentration im Nährmedium über den zeitlichen Verlauf der Fermentation in einem klassischen CSTR erreicht. Zur eigentlichen Fermentation des Organis- mus Methylococcus capsulatus (Bath) wurde ein 5 L CSTR mit Methan (0,7 L min-1) und Sau- erstoff (1,3 L min-1) begast. Der verwendete pH-Wert lag zwischen 6,8 und 7,4, bei einer Rüh- rerdrehzahl zwischen 200 und 800 rpm. Mit dieser neuen Methode der Kultivierung gelang es den Autoren den Effekt der Kupferkonzentration im Nährmedium auf die Kupferkonzentration der Membran als auch die spez. Aktivität des Enzyms zu untersuchen. STAND DER TECHNIK - 26 - Die optimale Kupferkonzentration während dieser Untersuchungen lag bei 30 bis 35 µM (Yu et al., 2003). Dichte Silikonmembranen fanden zur Herstellung von Methanol in der Arbeit von Dua- net al. (2011) Verwendung. Duan et al. integrierten zwei Silikonschläuche in einen Rührkes- selreaktor, sodass Sauerstoff und Methan getrennt voneinander blasenfrei in die wässrige Phase eingebracht werden konnten. Dabei variierten sie das Methan-Sauerstoff-Verhältnis zwischen 10:1 und 5:1. Während der Experimente wurde eine Temperatur von 30 °C und ein pH-Wert von 7,0 verwendet. Die Rührerdrehzahl variierte je nach Bedarf. Unter optimierten Bedingun- gen gelang es ihnen, 1,1 g L-1 Methanol im Reaktionsmedium anzureichern (Duan et al., 2011). Weil für einen optimalen Stoffeintrag die Membranoberfläche bei diesem Prozess sehr hoch sein muss, ist diese Variante nicht für den großtechnischen Maßstab geeignet. Ein Reaktor, der die blasenfreie Begasung von Methan und Sauerstoff räumlich getrennt von- einander gewährleisten kann und zudem skalierbar ist, wurde am Institut für Grenzflächenver- fahrenstechnik und Plasmatechnologie (IGVP) der Universität Stuttgart entwickelt. Dieser bis- lang nicht kommerziell erhältliche Doppelmembranbioreaktor (DMBR) basiert auf dem Prinzip einer Kammerfilterpresse (Abbildung 15, A). Der Reaktor besteht aus sechs Modulen (Abbil- dung 15, B). Ein Modul (siehe Abbildung 15 C) besteht jeweils aus einem Gaskompartiment sowie einer Flüssigkammer und einem zweiten Gaskompartiment. Die Kammern werden je- weils durch eine dichte Silikonmembran voneinander getrennt (Brebeck, 2018). Der Name des Reaktors leitet sich von den zwei zur Trennung der Flüssig- und Gasphase benötigten Memb- ranen ab. Das Flüssigvolumen einer einzelnen Kammer beträgt 0,53 L, wodurch sich ein Ge- samtreaktorvolumen von 3,18 L ergibt (siehe Kap. 4.4.5). Die Kultivierung von MOB im DMBR wurde erstmals in der vorliegenden Arbeit untersucht. Abbildung 15: Doppelmembranbioreaktor für die Kultivierung von MOB. (A, B) DMBR mit 6 Modulen. (C) Ein Modul besteht aus je einem Gaskompartiment links, einer Flüssigkammer in der Mitte und einer Gaskompartiment rechts. Rechts ist ein Querschnitt des Reaktors dargestellt. STAND DER TECHNIK - 27 - 3.1.4 Wirbelschicht- und Festbett-Reaktoren Eine weitere Möglichkeit für die Zellrückhaltung stellt die Immobilisierung der Zellen auf Trä- germaterial dar. Die immobilisierten Zellen können anschließend entweder in Wirbelschichtre- aktoren oder auch in Festbettreaktoren z.B. zur Ganzzellbiokatalyse eingesetzt werden. Im Fall des Wirbelschichtreaktors werden die Zellen an eine Trägerschicht immobilisiert. Durch eine aufwärtsgerichtete Strömung werden diese in einen fluidisierten Zustand versetzt, wodurch eine Durchmischung im Reaktor erzielt wird. Im Festbettreaktor liegen die Zellen hingegen immo- bilisiert an ein Trägermaterial vor. Das Flüssigmedium fließt dabei meist von oben in einem dünnen Film an den Zellen vorbei, wobei Gase in entgegengesetzter Richtung durch den Reak- tor geleitet werden. Durch die Nutzung der Schwerkraft wird hierbei relativ wenig Energie be- nötigt. Beide genannten Reaktortypen finden typischerweise bei der Durchführung enzymati- scher Reaktionen Verwendung und werden nicht zur Biomassegewinnung eingesetzt. Shimomura et al. (1997) immobilisierten auf diese Weise methanoxidierende Bakterien in Al- ginatkügelchen zum Abbau von Trichlorethylen (TCE). Sie setzten einen 20 L Wirbelschicht- reaktor ein, welcher mit den immobilisierten Zellen befüllt wurde. Zur Methan- und Luftver- sorgung wurden die Gase vorab gemischt und mit einer Flussrate von 130 mL min-1 zugeführt. Im Reaktor war zudem eine Gasrückführung integriert. So konnten die nicht verbrauchten Gase mit 3 L min-1 wieder dem Kreislauf zugeführt werden. Im gezeigten Prozess gelang es den Autoren die TCE-Konzentration nach 2,56 h von 0,9 bis 1,6 mg L-1 auf 0,1 bis 0,2 mg L-1 zu reduzieren (Shimomura et al., 1997). Ein Zwei-Phasen-Rieselfilterreaktor, eine Art Festbettre- aktor, über den eine flüssige Phase von oben nach unten fließt, nutzten Lebrero et al. (2015) zum Methanabbau (Lebrero et al., 2015). Gepackt wurde ein 4 L-Reaktor mit den Außenmaßen 1 x 0,08 m, mit 1 cm3 großen Würfeln aus Polyurethanschaum. Zum Abbau von Methan wurde ein Methan-Luft-Gemisch von unten mit 1 L min-1 zugeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zugabe einer nicht-wässrigen Phase zu einer verbesserten Methanreduktion führt (Lebrero et al., 2015). Wenngleich die Immobilisierung von Zellen gegenüber dem Einsatz freier Zellen zusätzlichen präparativen Aufwand verursacht und auch die Regeneration der immobilisierten Zellen, z.B. durch das Zuführen von Cofaktoren, erschwert wird, funktionieren immobilisierte Ganzzellbi- okatalysatoren häufig stabiler. Während ihrer Untersuchung zur Herstellung von Methanol aus Methan zeigten Patel et al. (2016) beispielsweise, dass die immobilisierten Methylosinus spo- rium Zellen im Vergleich zu freien Zellen eine deutlich bessere Aktivität von 52 bis 62 % nach sechs Oxidationszyklen zeigten (Patel et al., 2016). STAND DER TECHNIK - 28 - 3.2 Membranen zur blasenfreien Begasung von Nährmedien mit Methan und Sauerstoff Da Sauerstoff und Methan unter atmosphärischem Druck nur eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser aufweisen, spielt der Gaseintrag in die flüssige Phase bei der Fermentation von MOB, eine entscheidende Rolle (Chmiel, 2011). Dabei bietet die blasenfreie Begasung über Mem- branen wesentliche prozesstechnische Vorteile gegenüber der direkten Begasung unter Blasen- bildung. Ein entscheidender Vorteil im Hinblick auf die Prozesssicherheit besteht darin, dass druch die Verwendung dichter Membranen keine Blasenkoaleszenz auftreten kann und somit keine explostinfähigen Gasblasen entstehen können. Des Weiteren entstehen keine blasenbe- dingten Scherkräfte und es kommt des