Untersuchungen zum p53-NFκB cross talk in UV-bestrahlten humanen Keratinozyten Von der Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart zur Erlangung der Würde eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung Vorgelegt von Ines Müller aus Kusel Hauptberichter: Prof. Dr. Klaus Pfizenmaier Mitberichter: Prof. Dr. Dagmar Kulms Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2015 Institut für Zellbiologie und Immunologie Universität Stuttgart 2015 Eidesstattliche Erklärung 2 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die vorgelegte Dissertation: Untersuchungen zum p53-NFκB cross talk in UV-bestrahlten humanen Keratinozyten ohne Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Diese Arbeit hat in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner Prüfungsbehörde vorgelegen. Ort, Datum Unterschrift Vorabveröffentlichung 3 Vorabveröffentlichung Teile dieser Arbeit wurden bereits vorab veröffentlicht: Ines Müller, Stefan Beissert and Dagmar Kulms (2014): Anti-apoptotic NFκB and “Gain of Function” mutp53 in concert act pro- apoptotic in response to UVB+IL-1 via enhanced TNF production. Journal of Investigative Dermatology 2014 Nov 7. doi: 10.1038/jid.2014.481. Danksagung 4 Danksagung An dieser Stelle möchte ich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner Promotion beigetragen und mir während dieser Zeit zur Seite gestanden haben. Mein erster Dank geht an Frau PD Dr. Dagmar Kulms, die mir die Möglichkeit gab unter ihrer Betreuung an diesem interessanten Thema zu arbeiten. Sie hat mir stets mit vielen Anregungen und der Bereitschaft zur wissenschaftlichen Diskussion weitergeholfen. Außerdem möchte ich mich bedanken, dass ich mit dem Labor von Stuttgart nach Dresden umziehen durfte, mir keine Nachteile entstanden sind und sie sich immer um die Finanzierung meiner Stelle gekümmert hat. Prof. Dr. Klaus Pfizenmaier möchte ich sowohl dafür danken, dass ich meine Promotion am Institut für Zell- und Immunologie in Stuttgart beginnen durfte, als auch dafür, dass er die Hauptberichterstattung meiner Arbeit übernommen hat. Ebenfalls möchte ich mich bei Prof. Dr. med. Stefan Beissert bedanken, dass ich in Dresden in der Experimentellen Dermatologie meine Promotion beenden durfte und dass er die Weiterfinanzierung meiner Doktorandenstelle übernommen hat. Ich möchte mich auch bei meinen Arbeitskollegen in Stuttgart und Dresden bedanken. Insbesondere bei Natalie Peters, mit der ich sehr gerne hier in Dresden weitergearbeitet hätte. Sie hat nicht nur die praktische Organisation übernommen, sondern mir auch bei meinen technischen Problemen weitergeholfen. Natürlich möchte ich mich auch bei all meinen Freunden bedanken, die mir stets zur Seite standen, mich im schönen Dresden besucht haben und mit mir ganz viel gespielt haben: Frederic Lorenz, Matthias Schneider, Dr. Ines Müller, Doro Theis und Norma Hager. Und natürlich bei Katja Schneider für die freundliche Aufnahme im Institut und die vielen außerlabortechnischen Aktivitäten. Mein letzter und größter Dank geht an meine Familie: meine Eltern Gabi und Hermann, die mich in jeder Lebenslage immer unterstützt haben, meinem Bruder Nikolas, meiner Großmutter Elli und meinen leider verstorbenen Großtanten Selma und Elfriede. Inhaltsverzeichnis 5 Inhaltsverzeichnis Eidesstattliche Erklärung……………………………………………………………....... -2- Vorabveröffentlichung……………………………………………………………...…… -3- Danksagung………………………………………………………………………….….. -4- Inhaltsverzeichnis……………………….………………………………………………. -5- Abkürzungsverzeichnis…………………….……………………………………………. -8- Zusammenfassung…………………………………………………………….………… -11- Abstract………………………………….………………………………………………. -12- 1. Einleitung………………………….………………………………………………...... -13- 1.1 Der Aufbau und die Funktionen der humanen Haut……………………………... -13- 1.2 Die biologischen Effekte von UV-Strahlung…………………………….............. -14- 1.3 Die Entstehung von Hautkrebs…...…………………………................................. -15- 1.4 Der apoptotische Zelltod…………………………….....………………………… -16- 1.4.1 Der extrinsische Signalweg……………………………................................. -16- 1.4.2 Der intrinsische Signalweg…………………………….................................. -17- 1.5 Der Transkriptionsfaktor NFB…………………………….................................. -19- 1.5.1 Der Aufbau und die Lokalisation von NFκB………………………….……. -19- 1.5.2 Der kanonische Signalweg…………………………….................................. -20- 1.5.3 Pro-apoptotisches NFκB und die Rolle der Phosphatase PP2A….…….…… -22- 1.6 Der Tumorsuppressor p53……………….………….............................................. -23- 1.6.1 Die p53-Familie: p53, p63 und p73…..…………………………………....... -23- 1.6.2 Die Regulierung und die zellulären Aufgaben von p53…….…………….… -23- 1.6.3 Mutationen in p53 und deren Rolle bei der Entstehung von Krebs….……... -25- 1.7 Vorarbeiten aus der Arbeitsgruppe………….………………………………….... -27- 1.8 Zielsetzung der Arbeit……………………….……………………........................ -29- 2. Material…………………………………………….………………………………..... -30- 2.1 Allgemeine Chemikalien…………..…………………………...……………….... -30- 2.2 Zellen, Puffer, Lösungen und Stimulanzien/Inhibitoren für die Zellkultur….…... -31- 2.2.1 Verwendete Zelllinien………………………….………………….................. -31- 2.2.2 Puffer, Lösungen und Zubehör für die Zellkultur ….………...……………… -31- 2.2.3 Stimulanzien/Inhibitoren…………………………….……………….............. -32- 2.3 Vektoren/Plasmide………………………………………………………….……. -32- 2.4 Reagenzien und siRNAs für die Lipofectamine® 2000-Transfektion…………… -32- 2.4.1 Reagenzien für die Lipofectamine® 2000-Transfektion…………...………… -32- 2.4.2 siRNAs für die Lipofectamine® 2000-Transfektion………….……………… -32- 2.5 Färben und Entfärben mit Kristallviolett…………………………….…...……… -32- 2.6 Kits für den TNF-ELISA und den Cell death detection ELISA….………….…… -33- 2.7 Puffer, Lösungen, Zubehör und Antikörper für die Proteinanalyse……………… -33- 2.7.1 Puffer und Lösungen für die Proteinanalyse………………………….……… -33- 2.7.2 Zubehör für die Proteinanalyse…………………..………………………….... -34- 2.7.3 Antikörper für die Western Blot-Analyse…………………………..………… -35- 2.8 Puffer und Antikörper für die South-Western dot-blot-Analyse….……………… -35- 2.8.1 Puffer für die South-Western dot-blot-Analyse………………………….…… -35- 2.8.2 Antikörper für die South-Western dot-blot-Analyse….……………………… -36- 2.9. Lysepuffer und Antikörper für die Co-IP………...……………………………… -36- 2.9.1 Lysepuffer für IP……………………………………………………………… -36- 2.9.2 Antikörper für die Co-IP……………………………………………………… -36- 2.10 Puffer, Zubehör und Kits für ChIP……………………………………………… -36- Inhaltsverzeichnis 6 2.10.1 Puffer für ChIP……………………………………………………………… -36- 2.10.2 Zubehör für ChIP……………………………………………………………. -38- 2.10.3 Antikörper für ChIP…………………………………………………………. -38- 2.11 Inhibitoren für die Co-IP und ChIP……………………………………………... -38- 2.12 Primer, Zubehör und Puffer für die PCR……………………………………….. -38- 2.12.1 Primer für die Promotor-PCRs……………………………………………… -38- 2.12.2 Zubehör für die PCR………………………………………………………… -39- 2.12.3 Puffer für die Gelelektrophorese……………………………………………. -39- 2.13 Zubehör für Klonierung, Mutagenese, Transformation in E. coli, Mini-/Midi- Präparation und Sequenzierung………………………………………………... -39- 2.13.1 Puffer und Platten für die Transformation in E. coli………………………... -39- 2.13.2 Kits für Klonierung, Mutagenese, Transformation in E. coli, Mini-/Midi- Präparation und Sequenzierung…………………………………………….. -40- 2.13.3 Antibiotikum und Bakterienzellen…………...……………………………… -40- 2.13.4 Reagenzien für die Mutagenese und Klonierung……………………………. -40- 2.13.5 Primer für die Mutagenese und Sequenzierung……………………………... -40- 2.14 Geräte/Zubehör…………………………………………………………………. -41- 2.15 Software………………………………………………………………………… -41- 2.16 Wiederholung der Experimente und statistische Analyse………………………. -41- 3. Methoden……………………………………………………………………………... -42- 3.1 Auftauen von Zellen……………………………………………………………… -42- 3.2 Kultivierung der Zelllinien……………………………………………………….. -42- 3.3 Zellzahlermittlung und Vitalbestimmung mittels Trypanblau-Färbung…………. -42- 3.4 Einfrieren der Zellen……………………………………………………………... -42- 3.5 Aussaat und Stimulation der verwendeten Zelllinien……………………………. -43- 3.6 Plasmid-Transfektion mittels Elektroporation…………………………………… -43- 3.7 Herstellung stabiler Zelllinien……………………………………………………. -43- 3.8 siRNA-Transfektion mittels Lipofectamine® 2000……………………………… -44- 3.9 Bestimmung der Fähigkeit zur klonalen Expansion mittels des clonogenic assays……………………………………………………………………………. -44- 3.10 Bestimmung der Fähigkeit zum Readhärieren mittels des Replattierungs- assays…………………………………………………………………………... -44- 3.11 Nachweis von Apoptose mittels des Cell death detection ELISAs……………... -44- 3.12 Bestimmung von TNF im zellfreien Überstand mittels ELISA………………… -44- 3.13 Herstellung der Proteinextrakte („hot lysis-Methode“)…………………………. -45- 3.14 SDS-PAGE, Western Blot-Analyse und Proteindetektion……………………… -45- 3.15 South-Western dot-blot-Analyse………………………………………………... -46- 3.16 Co-Immunopräzipitation (Co-IP)……………………………………………….. -47- 3.17 ChIP und PCR-Analyse………………………………………………………… -47- 3.18 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA und Plasmid-Präparation………. -49- 3.19 Klonierung der Caspase 3………………………………………………………. -49- 3.20 Gerichtete Mutagenese………………………………………………………….. -50- 4. Ergebnisse……………………………………………………………………..……… -51- 4.1 Die Wirkung von UVB und UVB+IL-1 auf HaCaT- und SCL-1-Zellen………... -51- 4.2 Langfristig zeigen HaCaT-Zellen keinen verstärkenden apoptotischen Effekt von IL-1………………………………………………………………………… -52- 4.3 SCL-1-Zellen sind im Replattierungsassay ebenfalls sensitiv gegenüber UVB- Bestrahlung……………………………………………………………………… -53- 4.4 Die Expression pro- und anti-apoptotischer Schlüsselproteine spricht nicht nur für eine verstärkte UVB-Resistenz von SCL-1-Zellen………………………….. -55- Inhaltsverzeichnis 7 4.5 P53 und XIAP nehmen keinen Einfluss auf die UVB-Suszeptibilität von SCL-1- Zellen……………………………………………………………………………. -56- 4.6 SCL-1-Zellen exprimieren unveränderte wtCaspase 3………………………..… -57- 4.7 TNF-Sezernierung führt auch in UVB+IL-1 stimulierten HaCaT-Zellen zur Verstärkung der Apoptose………………………………………………………. -58- 4.8 Nach Stimulation mit UVB+IL-1 bindet NFκB verstärkt an den TNF-Promotor.. -59- 4.9 Die TNF-Freisetzung ist nur partiell von NFκB abhängig………………………. -59- 4.10 Die Menge an sezerniertem TNF korreliert mit dem entstanden DNA- Schaden………………………………………………………………………… -60- 4.11 Der p63-Level bleibt durch den p53-Status unbeeinflusst……………….……... -62- 4.12 P53 unterstützt die Synthese von TNF……..…………………………………… -62- 4.13 NFκB und p53 werden in HaCaT-Zellen zur vollständigen Synthese von TNF benötigt………………………………………………………………………… -63- 4.14 Nur mutp53 verstärkt die NFκB-abhängige TNF-Synthese…………………….. -64- 4.15 Nur mutp53 bindet verstärkt an den TNF-Promotor……………………………. -66- 4.16 Zwischen p53 und NFκB liegt keine direkte Protein-Protein-Interaktion vor….. -67- 4.17 Die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NFκB, p53 und CREB erfolgt nach unterschiedlichen Stimuli………………………………………………… -67- 4.18 Das Phosphorylierungsmuster von p65 und CREB ist PP2A-abhängig…...…… -69- 5. Diskussion………………………..…………………………………………………… -71- Abbildungsverzeichnis…………...……………………………………………………… -78- Tabellenverzeichnis……….…………………………………………………………….. -80- Referenzen…...………………………………………………………………………….. -81- Abkürzungsverzeichnis 8 Abkürzungsverzeichnis µF Mikrofarad A Adenin Abb. Abbildung AK Antikörper Apaf-1 apoptotic protease activating factor 1 APS Ammoniumperoxodisulfat ATM ataxia telangiectasia-mutated ATP Adenosintriphosphat ATR ataxia telangiectasia and Rad3 related Bad Bcl-2 antagonist of cell death Bak Bcl-2 antagonistic killer Bax Bcl-2-associated X Bcl-2 B cell lymphoma-2 Bcl-XL B cell lymphoma-extra large BH Bcl-2 homology Bid BH3 interacting domain death agonist BL Blockierlösung BSA Bovines Serum Albumin C Cytosin Caspase cysteinyl-aspartate specific protease CBP CREB-binding protein CD cluster of differentiation cDNA complementary DNA cFLIP cellular FADD-like interleukin-1 beta-converting enzyme-like inhibitory protein ChIP Chromatin Immunopräzipitation cIAP cellular inhibitor of apoptosis CPD Cyclobutan Pyrimidin-Dimere CREB cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein DD death domain (Todesdomäne) Detek. selbst hergestellte Detektionslösung DISC death-induced signaling complex DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate DR death receptor (Todesrezeptor) Dura SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure ELISA enzyme linked immunosorbent assay ESMD↓S Glutaminsäure Serin Methionin Asparaginsäure (Spaltung) Serin EtBr Ethidiumbromid FADD Fas-associated protein with death domain FCS fetal calf serum (Fetales Kälberserum) FLIP FADD-like interleukin-1 beta-converting enzyme-like inhibitory protein G Guanin Abkürzungsverzeichnis 9 G418 Geneticin GADD45 growth arrest and DNA-damage-inducible protein α GOF gain-of-function H Histidin h Stunde H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid HaCaT Human adult low Calcium high Temperature keratinocytes HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure IETD↓S Isoleucin Glutaminsäure Threonin Asparaginsäure (Spaltung) Serin IKK inhibitor of nuclear factor kappa B kinase IL Interleukin IL-1R Interleukin-1Rezeptor IP Immunopräzipitation IRAK IL-1 receptor-associated kinase IκB inhibitor of kappa B IκB DN inhibitor of kappa B dominant negativ IκB-SR IκB-Superrepressor KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat LB lysogeny broth LiCl Lithiumchlorid LOF loss-of-function LUBAC linear ubiquitin chain assembly complex MAP2K3 mitogen-activated protein kinase kinase 3 Mcl-1 myeloid cell leukemia 1 Mdm2 murine double minute2 MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute mRNA messenger RNA mutp53 mutiertes p53 MyD88 myeloid differentiation primary response protein 88 Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat Na4P2O7 sodium pyrophosphate tetrabasic NaCl Natriumchlorid NaF Natriumfluorid NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat NaN3 Natriumazid NaOH Natriumhydroxid NEMO NFB essential modulator NFB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NLS nuclear localization signal (Kernlokalisierungssequenz) Noxa nach lat. für Schaden NP40 Nonidet™ P 40 Substitute PARP Poly (Adenosindiphosphat-ribose) polymerase PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PenStrep Penicillin Streptomycin Pico SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate pmol Pikomol Abkürzungsverzeichnis 10 PP2A protein phosphatase 2A PP2Ac katalytische Untereinheit von PP2A PRIMA-1 p53 reactivation and induction of massive apoptosis Pu Purin Puma p53 upregulated modulator of apoptosis Py Pyrimidin qPCR quantitative PCR R Arginin RHD Rel Homologie Domäne RIP1 receptor-interacting protein 1 RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm revolutions per minute s Sekunde SDS Natriumlaurylsulfat SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis shRNA small hairpin RNA siRNA small interfering ribonucleic acid Smac small mitochondria-derived activator of caspases T Thymin Tab. Tabelle TAD Transaktivierungsdomäne TAK1 transforming growth factor β-activated protein kinase 1 tBid truncated Bid TEMED Tetramethylethylendiamin TNF Tumornekrosefaktor TNFR1 TNF Rezeptor 1 TRADD tnf receptor type 1-associated death domain TRAF tumor necrosis factor receptor-associated factor TRAIL tnf related apoptosis inducing ligand TRAILR tnf related apoptosis inducing ligand receptor Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U Uracil UV Ultraviolett W Tryptophan wtp53 Wildtyp p53 XIAP X-linked inhibitor of apoptosis protein z. B. zum Beispiel Zusammenfassung 11 Zusammenfassung Durch UVB-Bestrahlung von Keratinozyten wird DNA-Schaden induziert, der durch Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 die Apoptose stark geschädigter Zellen initiieren kann. Der Verlust von wtp53 kann somit zur malignen Transformation beitragen. Mutationen in p53 können zu einem gegenteiligen Effekt führen (gain-of-function) und die Tumorprogression sogar noch verstärken. Auch konstitutiv aktives NFB wirkt pro- tumorigen und vermittelt z. B. Resistenzen gegenüber Chemotherapie. An welchen Punkten ein cross talk zwischen p53 und NFB stattfindet, wird stark diskutiert. Mit Hilfe der spontan transformierten Keratinozytenzelllinie HaCaT konnte gezeigt werden, dass das Zusammenspiel von chronisch aktiviertem NFB und mutp53 die UVB-induzierte Apoptose durch verstärkte TNF-Produktion nach IL-1-Stimulation erhöhte. Zum ersten Mal konnte über Chromatin Immunopräzipitation-Analysen nachgewiesen werden, dass nach Stimulation beide Transkriptionsfaktoren unabhängig voneinander an den humanen TNF- Promotor banden und dabei additiv zur TNF-Synthese beitrugen. In HaCaT-Zellen ohne intakten NFB- und p53-Signalweg wurde folglich kein TNF mehr sezerniert und es konnte keine verstärkende apoptotische Wirkung von IL-1 mehr nachgewiesen werden. Wtp53 nahm keinen Einfluss auf die TNF-Sezernierung. Das Wildtypprotein band nicht an diesen Promotor, was zeigt, dass der cross talk von NFB spezifisch mit mutp53 sattfindet. UVB-Strahlung führt dabei nicht nur zu einer aktivierenden Phosphorylierung von mutp53, sondern auch zur Inhibierung der katalytischen Untereinheit c der Serin-Threonin-Phoshatase PP2A. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass dadurch der negative Rückkopplungs- mechanismus von NFB inhibiert ist, da eine kontinuierliche proteasomale Degradation von IκB stattfindet. Diese verlängerte NFB-Aktivierung ist für die TNF-Synthese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PP2A einen direkten Einfluss auf die Phosphorylierungsdauer und somit die Aktivierung von NFB und CREB, der ebenfalls für die TNF-Transkription notwendig ist, nahm. In HaCaT-Zellen mit inhibierter PP2A waren diese beiden Modifikationen auch in unstimulierten Zellen nachzuweisen und die Transkriptionsfaktoren stellen somit zelluläre Ziele für die Phosphatase dar. Damit nimmt das Enzym einen äußerst wichtigen Stellenwert in der Regulation der TNF-Synthese ein. 4 % der Keratinozyten tragen Mutationen in p53, jedoch entwickeln sich deutlich weniger Zellen zum Hautkrebs. Da die humane Haut als einziges Organ ständiger UVB-Bestrahlung ausgesetzt ist und dies zur IL-1-Produktion führt, kann möglicherweise über den cross talk von NFB und mutp53 der Organismus vor Hautkrebs geschützt werden. Diese Zellen könnten durch die verstärkte TNF-Sezernierung gezielt die Apoptose induzieren, während Zellen, die wtp53 exprimieren davon nicht betroffen wären. Zwei initial anti-apoptotische Faktoren, NFB und mutp53, sind somit gemeinsam in der Lage eine pro-apoptotische Antwort zu generieren und zur Elimierung von Präkanzerosen in einem sehr frühen Stadium beizutragen. Abstract 12 Abstract UVB radiation induces DNA damage in human keratinocytes. Apoptosis can be induced in cells harboring irreparable DNA damaged by activation of the tumor suppressor p53 after UVB exposure. Loss of wtp53 function contributes to malignant transformation. Furthermore, p53 gain-of-function mutants result in the opposite wildtyp effect and can even enhance tumor progression. Constitutive NFκB activation is pro-tumorigenic and leads to resistance against chemotherapy. Still under debate is the point at which cross talk of these two transcription factors occurs. In the spontaneously transformed keratinocyte cell line HaCaT it was shown for the first time that chronically activated NFκB combined with mutp53 promotes apoptosis via cooperative TNF production in response to UVB+IL-1 treatment. After stimulation both transcription factors bind independently to the TNF promoter, shown by chromatin immunoprecipitation, and trigger additional TNF production. No secreted TNF or enhanced apoptotic response to IL-1 treatment could be detected in HaCaT cells without NFκB and p53 signaling pathways. Wtp53 does not affect TNF secretion. The wildtyp protein does not bind to the promoter, showing that the cross talk of NFκB is specific with mutp53. UVB does not only induce an activating phosphorylation of mutp53 but also an inhibition of the catalytic subunit c from the serin/threonine phosphatase PP2A. It was shown by our research group that this disrupts the negative feedback regulation of NFκB because IκB is continuously degraded. The prolonged NFκB activation is essential for TNF synthesis. In the context of this work it could be shown that PP2A also directly influences the phosphorylation time and therefore the activation of NFκB and CREB, a transcription factor which is important for TNF transcription. Even in unstimulated HaCaT cells with inhibited PP2A both modifications were detected, indicating that these proteins are cellular targets of the phosphatase and PP2A is an important factor in the regulation of the TNF synthesis. 4 % of all keratinocytes harbor mutations in p53 but only a few cells develop skin cancer. As the human skin is the only organ which is constantly exposed to UVB radiation causing IL-1 production, the cross talk of NFκB and mutp53 might protect the human being from getting skin cancer. Other than wtp53 expressing cells, cells with mutp53 might induce apoptosis via enhanced TNF secretion. Two anti-apoptotic factors, NFκB and mutp53, are thus able to possibly generate pro-apoptotic responses which may serve as protective function to eliminate precancerous cells at an early stage. 1. Einleitung 13 1. Einleitung 1.1 Der Aufbau und die Funktionen der humanen Haut Die Haut ist mit 16 % des Körpergewichts das größte Organ des Menschen und schützt den Organismus sowohl mechanisch als auch chemisch vor schädlichen Umwelteinflüssen [1;2]. Sie besteht aus zwei Hauptkompartimenten: der äußeren Epidermis (Oberhaut) und der inneren Dermis (Lederhaut). Die Epidermis ist unterteilt in vier Zellschichten (Abb. 1.1), in denen die Differenzierung der Keratinozyten stattfindet [3]. Die Keratinozyten proliferieren und differenzieren bis sie schließlich den programmierten Zelltod initiieren und sterben. Dabei übernehmen sie jedoch weiterhin Funktionen in der Haut, wie den Schutz vor Dehydrierung [1;4]. Die innerste Schicht, das stratum basale (Basalschicht), beinhaltet undifferenzierte epidermale Zellen, die sich häufig teilenden basalen Keratinozyten. Die basalen Keratinozyten beginnen mit der Differenzierung und wandern in die nächst höher liegende Schicht, das stratum spinosum (Stachelzellschicht), in der der Reifungsprozess beginnt. Während dieses Prozesses verändern die Zellen ihre äußere Form. Danach wandern sie in das stratum granulosum (Körnerzellschicht), in der das Absterben und die Verhornung der Zellen beginnt. Im stratum corneum (Hornschicht) finden die letzten Differenzierungs- schritte statt und der kernlose Korneozyt bildet die Grenze zur Umwelt [4]. Abb. 1.1: Der Aufbau der humanen Haut. Die Keratinozyten sind in den unterschiedlichen Differenzierungsstadien, die in der Epidermis stattfinden, abgebildet. In der Dermis finden sich neben Fibroblasten Immunzellen wie Makrophagen. Zwischen den Zellen der Epidermis und der Dermis findet eine starke Kommunikation statt, die wichtig für die Aufrechterhaltung der Homöostase ist [5]. 1. Einleitung 14 Keratinozyten sind für den Aufbau der Epidermis verantwortlich und mit über 90 % die am häufigsten vorkommenden Zellen in dieser Schicht. Einen weiteren wichtigen Zelltyp, der in diesem Kompartiment vorkommt, repräsentieren Melanozyten, die das Pigment Melanin synthetisieren und somit die Haut vor Ultraviolett (UV)-Strahlung schützen. Die Dermis weist eine größere Zelldiversität auf. Hier sind sowohl Fibroblasten als auch Immunzellen, wie Makrophagen, Mastzellen und unterschiedliche Dendritische Zellen und T-Zellen vorhanden [4]. Da die Haut die Grenze zur Umwelt bildet, ist dieses Organ fast ständig der Sonnen- strahlung, die UV-Strahlung beinhaltet, ausgesetzt. 1.2 Die biologischen Effekte von UV-Strahlung UV-Strahlung ist zu einem geringen Prozentsatz im kurzwelligen Sonnenlicht vertreten und über seine Wellenlänge in drei verschiedene Bereiche eingeteilt: UVA (320-400 nm), UVB (290-320 nm) und UVC (200-290 nm) [6]. UVC wird durch die Ozonschicht vollständig absorbiert, während UVB nur teilweise und UVA nicht von dieser Schicht absorbiert werden. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften dringt die energiereiche UVB-Strahlung nur in die obere Epidermis ein, während die energieärmere UVA-Strahlung bis in die tiefer liegende Dermis eindringen kann (Abb. 1.2) [7]. Abb. 1.2: UVA- und UVB-Strahlung führen zu zellulären Schäden in der Haut. UVA dringt bis in die Dermis ein und regt die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies an über die sekundär DNA- Schäden induziert werden können. UVB-Strahlung dringt nur in die Epidermis ein, wird von der DNA absorbiert und führt zu kovalenten Basenmodifikationen. UVC-Strahlung dringt nicht in die Erdatmosphäre ein und hat somit keinen Einfluss auf die Entstehung von Hautkrebs (verändert nach [6-9] und http://confettiskin.com/wp/2012/10/11/back-to-school-skin-basics; Stand: 06.11.2014). 1. Einleitung 15 UVB spielt bei der Entstehung von Hautkrebs eine größere Rolle als UVA, da UVB direkt von der Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid; DNA) absorbiert wird und so spezifische Schäden induzieren kann [8]. UVB-spezifische DNA-Schäden umfassen die Bildung von Cyclobutan Pyrimidin-Dimeren (CPD) und 6-4 Fotoprodukten. Beide Läsionen haben ihren Ursprung darin, dass benachbarte DNA-Basen eine kovalente Bindung eingehen. Dadurch kann Cytosin (C) durch Desaminierung in Uracil (U) umgewandelt werden. So können Basenaustausche von Cytosin nach Thymin (T) beziehungsweise von CC → TT stattfinden, was typische UV-induzierte Mutationen kennzeichnet [9]. Die meisten der UVB- induzierten Fotoprodukte werden über den Nukleotidexzisionsreparatur-Mechanismus erkannt und behoben [10;11]. UVA, das auf Grund seiner Wellenlänge fast nicht von genomischer DNA absorbiert wird, kann über die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies trotzdem zur DNA-Schädigung führen [9]. Hydroxylradikale können Guanin (G) zu 8-Hydroxyguanin oxidieren lassen, was in der Replikation zu G → T Transversionen führen kann und so Mutationen in der DNA hinterlässt [8]. Reaktive Sauerstoffspezies können jedoch auch nach UVB-Bestrahlung auftreten [12]. Des Weiteren führt UV-Strahlung zu ligandenunabhängiger, funktioneller Aggregation von Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche und initiiert die Apoptose über den extrinsischen Signalweg (siehe Abschnitt 1.4.1) [13]. All diese biologischen Effekte führen zu molekularen Veränderungen in der Haut und können die Entstehung von Hautkrebs begünstigen. 1.3 Die Entstehung von Hautkrebs Jährlich erkranken etwa zwei bis drei Millionen Menschen an weißem Hautkrebs, wobei die Zahl der Menschen, die Hautkrebs entwickeln, stetig steigt [14-16]. Der weiße Hautkrebs wird durch Basalzellkarzinome und Plattenepithelkarzinome repräsentiert. Dem gegenüber steht der schwarze Hautkrebs, der durch maligne Transformation der Melanozyten entsteht. Das Maligne Melanom stellt mit nur 4 % eine sehr kleine Gruppe des Hautkrebses dar, jedoch gehen 65 % der Todesfälle auf diese Tumorform zurück. Das Basalzellkarzinom, dessen Ursprung die Basalschicht der Epidermis ist, stellt mit 80 % die größte Gruppe des weißen Hautkrebses dar. Das Plattenepithel-karzinom repräsentiert die zweithäufigste Form und entsteht durch maligne Transformation von epidermalen Keratinozyten [14-16]. UV-Strahlung stellt die größte Quelle für die Entwicklung von weißem Hautkrebs dar. Die Strahlung kann entweder direkt oder indirekt, über die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, zu Mutationen in der DNA führen (siehe Abschnitt 1.2). Eine wichtige Rolle spielen hierbei Veränderungen in Tumorsuppressorgenen wie z. B. dem Transkriptions- faktor p53. Mutationen von p53 führen dazu, dass sowohl der DNA-Reparaturmechanismus als auch die Induktion des programmierten Zelltodes gestört sind [16;17]. Da UV-Licht auch das Immunsystem in der Haut beeinträchtigt, führt die Strahlung zusätzlich zur Immun- suppression und die Immunzellen können die Tumorzellen nicht mehr eliminieren [18]. So vermindert UV-Strahlung die Zahl von Antigenpräsentierenden Zellen und induziert die Synthese von immunsuppressiven Zytokinen wie Interleukin (IL)-10 [16;19]. Daneben spielen aber auch genetische Faktoren und familiäre Vorbelastungen eine Rolle. Die Augen- und Hautfarbe sind ebenfalls von wichtiger Bedeutung, da hellere Hauttypen generell ein 1. Einleitung 16 größeres Risiko tragen zu erkranken [14-16]. Um den Organismus vor transformierten Zellen zu schützen, können Keratinozyten über verschiedene Wege die Apoptose induzieren [1]. 1.4 Der apoptotische Zelltod Apoptose geht mit Veränderungen der Zelle einher. Charakteristisch hierfür sind die Ablösung aus dem umliegenden Gewebe, das Schrumpfen der Zelle, die Kondensierung des Chromatins, die DNA-Fragmentierung und das membrane blebbing (Membran wirft Blasen) [20;21]. Verantwortlich für die Veränderungen ist eine Kaskade von speziellen Enzymen, die Caspasen (cysteinyl-aspartate specific protease), die ein Cysteinrest im aktiven Zentrum aufweisen und ihre Substrate spezifisch nach einem Aspartart spalten [22]. Diese Enzyme werden als inaktive Zymogene synthetisiert und entweder über spezielle Plattformen oder durch Spaltung von vorgeschalteten Initiatorcaspasen aktiviert [23]. Caspasen, die bei der Apoptose eine wichtige Rolle einnehmen, sind die Initiatorcaspasen 8 und 9, sowie die Effektorcaspasen 3, 6 und 7 [24]. Die Induktion der Apoptose ist streng reguliert und kann über zwei Signalwege erfolgen: den intrinsischen und den extrinsischen Signalweg, wobei der extrinsische den intrinsischen zusätzlich aktivieren kann [21]. 1.4.1 Der extrinsische Signalweg Der extrinsische Weg kann über die Bindung von Todesliganden an ihre responsiven Rezeptoren aktiviert werden (Abb. 1.3). Die Todesrezeptorfamilie gehört zur Tumornekrose- faktor (TNF)-Superfamilie und lässt sich in zwei Gruppen teilen. Die eine Gruppe, zu der CD (cluster of differentiation) 95, TRAILR (tnf related apoptosis inducing ligand receptor) 1 und 2 gehören, vermittelt apoptotische Signale über eine spezielle intrazelluläre Plattform (death- induced signaling complex; DISC). Die andere Gruppe, zu der TNF Rezeptor 1 (TNFR1), Todesrezeptor (death receptor; DR) 3 und 5 gehören, rekrutieren andere intrazelluläre Moleküle und können sowohl apoptotische, als auch Überlebenssignale vermitteln [25;26]. Alle Todesrezeptoren besitzen zwei bis fünf extrazelluläre Cystein-reiche Domänen und eine intrazelluläre Todesdomäne (death domain; DD), die für die Weiterleitung des apoptotischen Signals essentiell ist [27]. Durch Ligandenbindung wird der Rezeptor aktiviert und es folgt die Aggregation der intrazellulären Todesdomänen. Danach werden verschiedene Moleküle rekrutiert und es kommt zur Ausbildung des DISC. Bei TNFR1 beinhaltet der DISC Procaspase 8, FADD (Fas-associated protein with death domain), TRADD (tnf receptor type 1-associated death domain) und TRAF2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor2) [28]. Die DISC-Bildung führt zur autokatalytischen Aktivierung der Procaspase 8. Caspase 8 spaltet die Effektorcaspasen 3, 6 und 7, die wiederrum spezifische Todessubstrate in der Zelle spalten und somit für die Induktion der Apoptose verantwortlich sind [21]. Zu den Substraten von Caspase 3 zählen z. B. Actin [25;29] und PARP (Poly (Adenosindiphosphat-ribose) polymerase). PARP ist ein Enzym, das an der DNA-Reparatur beteiligt ist und wurde als einer der ersten biologischen Marker für Apoptose identifiziert [30]. 1. Einleitung 17 Abb. 1.3: Der extrinsische und intrinsische apoptotische Signalweg. Die Initiierung kann über diverse Signale und Schäden für die Zelle erfolgen. Dazu zählt die Todesligandenbindung an res- ponsive Rezeptoren, sowie die Induktion durch intrazelluläre Schäden, wie einen DNA-Schaden, der den Transkriptionsfaktor p53 aufreguliert. Beide Signalwege aktivieren die Caspase-Kaskade, die die Apoptose induziert. An verschiedenen Stufen kann der Zelltod durch die Aufregulierung/Aktivierung anti-apoptotischer Proteine inhibiert werden. Einige Gene, die für diese Proteine codieren, werden durch den Transkriptionsfaktor NFB reguliert (detaillierte Erläuterungen siehe Abschnitte 1.4.1 und 1.4.2) [31]. 1.4.2 Der intrinsische Signalweg DNA-Schaden, oxidativer Stress oder das Fehlen von Wachstumsfaktoren können diesen Signalweg aktivieren (Abb. 1.3) [28]. All diese Schäden führen dazu, dass die äußere Mitochondrienmembran permeabilisiert wird und pro-apoptotische Faktoren in das Zytoplasma gelangen. Die Permeabilisierung wird über Bcl (B cell lymphoma)-2-Familien- mitglieder gesteuert [32]. Alle Mitglieder besitzen eine oder mehrere Homologiedomänen, BH1, BH2, BH3 und BH4 (BH: Bcl-2 homology), die für die Interaktion zwischen den einzelnen Familienmitgliedern notwendig sind. Die Bcl-2-Familie lässt sich in drei Gruppen unterteilen. Zur ersten Gruppe gehören pro-apoptotische Proteine wie Bad (Bcl-2 antagonist of cell death), Bid (BH3 interacting domain death agonist), Noxa (nach lat. für Schaden) oder 1. Einleitung 18 Puma (p53 upregulated modulator of apoptosis), die entweder direkt oder indirekt die pro- apoptotischen Mitglieder der zweiten Gruppe aktivieren. Dazu gehören Bax (Bcl-2-associated X) und Bak (Bcl-2 antagonistic killer), die oligomerisieren können und so eine Pore in der äußeren Mitochondrienmembran ausbilden. Die dritte Gruppe umfasst alle anti-apoptotischen Mitglieder wie Bcl-2, Bcl-XL (B cell lymphoma-extra large) oder Mcl-1 (myeloid cell leukemia 1), die prinzipiell alle pro-apoptotischen Mitglieder inhibieren und somit die Zelle vor Apoptose schützen können [33;34]. Das Protein Bid bildet eine Brücke zwischen dem extrinsischen und dem intrinsischen Weg. Caspase 8 kann das Protein Bid in tBid (truncated Bid) spalten, welches zur äußeren Mitochondrienmembran transloziert und die Freisetzung pro-apoptotischer Faktoren vermittelt [35]. Der intrinsische Signalweg kann aber auch durch DNA-Schaden aktiviert werden. Eine wichtige Rolle hierbei nimmt der Tumorsuppressor p53 ein, der die Transkription von mehreren pro-apoptotischen Faktoren initiiert. Dazu zählen z. B. Puma, Noxa und Bax [36]. Puma vermittelt die pro-apoptotischen Signale vor allem am Mitochondrium, wo es alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder antagonisieren kann und es zur mitochondrialen Dysfunktion kommt [37]. Noxa kann mit dem anti-apoptotischen Protein Mcl-1 interagieren und dieses für den proteasomalen Abbau markieren [38]. Der Transkriptionsfaktor p53 spielt somit eine direkte Rolle bei der Induktion des programmierten Zelltodes und kann dadurch die Entstehung von Hautkrebs verhindern [36]. Normalerweise besteht in Zellen ein Gleichgewicht zwischen pro- und anti-apoptotischen Proteinen und die Zelle leitet nicht den apoptotischen Zelltod ein. In Abhängigkeit von der Intensität der induzierten Zellschäden verlagert sich das Gleichgewicht zugunsten der pro- apoptotischen Proteine [39]. Durch die Poren in der äußeren Mitochondrienmembran können Cytochrom c, Smac (small mitochondria-derived activator of caspases) und weitere pro- apoptotische Faktoren aus dem Membranzwischenraum in das Zytoplasma gelangen [40]. Cytochrom c und ATP (Adenosintriphosphat) sind erforderlich damit Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1) oligomerisieren kann, was für die Aktivierung und Prozessierung der Procaspase 9 im Apoptosom notwendig ist [41]. Diese Initiatorcaspase kann dann im Folgenden die Effektorcaspasen 3, 6 und 7 durch Spaltung aktivieren. Die E3-Ligase XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) kann sowohl die finale Prozessierung von Caspase 3 als auch von Caspase 9 inhibieren. XIAP kann Caspase 3 ubiquitinieren und diese wird anschließend über das 26S-Proteasom degradiert. Smac wiederum ist ein pro-apototisches Protein, das XIAP kompetitiv inhibieren kann und somit eine wichtige Rolle in der Regulierung des intrinsischen Signalweges einnimmt [28;42]. Viele anti-apoptotischen Faktoren wie z. B. XIAP stehen unter der Kontrolle des Transkriptionsfaktors NFB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), der somit einen starken Einfluss auf das Überleben der Zelle nimmt [43]. 1. Einleitung 19 1.5 Der Transkriptionsfaktor NFB 1.5.1 Der Aufbau und die Lokalisation von NFB Der Transkriptionsfaktor NFB, der entweder aus einem Homo- oder Heterodimer besteht, spielt bei sehr vielen zellulären Prozessen, wie Inflammation, Regulierung der Immunantwort, Zellwachstum und der Zellentwicklung, eine wichtige Rolle [44]. Bei Säugetieren gehören fünf Proteine zur NFB-Familie (Abb. 1.4), die alle eine aminoterminale Rel Homologie Domäne (RHD) besitzen, die für DNA-Bindung und Dimerisierung notwendig ist. RelA (p65), RelB und c-Rel besitzen an ihrem Carboxylterminus eine Transaktivierungsdomäne (TAD) und können über diese mit verschiedenen Cofaktoren interagieren und so die Transkription responsiver Gene initiieren. Wichtige Interaktionspartner sind z. B. die Acetyltransferasen p300 und CBP (CREB-binding protein). NF-κB1 (p105/p50) und NF-κB2 (p100/p52) bestehen aus längeren Vorläuferproteinen, die in kürzere, DNA-bindende Proteine prozessiert werden. Da beiden Proteinen eine Transaktivierungsdomäne fehlt, wirken Homo- oder Heterodimere als Repressoren der Transkription [45]. Abb. 1.4: Struktureller Aufbau der Proteine der NFB-Familie. Alle Proteine weisen eine Rel Homologie Domäne (RHD) auf, die sowohl für die DNA-Bindung als auch die Dimerisierung notwendig ist. P65, RelB und c-Rel besitzen zudem eine Transaktivierungsdomäne (TAD) über die sie die Transkription responsiver Gene initiieren können. NF-κB1 und NF-κB2 bestehen aus längeren Vorläuferproteinen, die prozessiert werden. Posttranslationale Modifikationen an verschiedenen Aminosäureresten können die transkriptionelle Aktivität beeinflussen [46]. Die Aktivität von NFB ist durch die Bindung an inhibitorische Proteine, IκBs (inhibitor of kappa B), streng reguliert. Zu diesen Proteinen gehören z. B. IκB, IκBβ oder IκBε, die unterschiedliche Affinitäten für individuelle NFB-Dimere aufweisen [47]. Durch die Interaktion mit den Inhibitoren wird die Kernlokalisierungssequenz (nuclear localization 1. Einleitung 20 signal; NLS), die in der RHD liegt, maskiert und NFB bleibt im Zytoplasma lokalisiert. Die Aktivierung des NFB-Signalwegs kann über sehr viele verschiedene Stimuli, die dem kanonischen oder dem nicht-kanonischen Modus folgen, stattfinden [48;49]. In allen Signalwegen ist eine Kaskade aus Kinasen involviert, die über verschiedene Adaptormoleküle aktiviert und reguliert werden. Jedoch spielen nicht nur Phosphorylierungen, sondern auch Ubiquitinierungen, eine entscheidende Rolle [50]. 1.5.2 Der kanonische Signalweg Der bekannteste Signalweg zur NFB-Aktivierung ist der kanonische, der über die Bindung verschiedener Liganden an ihre responsiven Rezeptoren vermittelt wird (Abb. 1.5). Unter anderem zählen dazu pro-inflammatorische Zytokine wie TNF und IL-1 oder Lipopolysaccharid, das ein Membranbestandteil gramnegativer Bakterien darstellt [48]. Abb. 1.5: Der kanonische und der nicht-kanonische NFB-Signalweg. Beide Signalwege, die aus einer Kaskade von Kinasen bestehen, werden durch Ligandenbindung an responsive Rezeptoren aktiviert. Posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen und Ubiquitinierungen spielen dabei wichtige Rollen. Über den kanonischen Signalweg werden inhibitorische Proteine proteasomal degradiert, der Transkriptionsfaktor NFκB kann in den Nukleus translozieren und die Transkription verschiedener Zielgene steuern. Über den nicht-kanonischen Signalweg erfolgt die Prozessierung von NF-κB2 p100 in p52. Freie p52/RelB Dimere translozieren in den Zellkern und regulieren die Expression unterschiedlicher Zielgene (detaillierte Erläuterungen siehe Abschnitt 1.5.2) [51]. 1. Einleitung 21 Aktivierung des IL-1R (IL-1Rezeptor) führt zur intrazellulären Bindung des Adaptormoleküls MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88), an das dann IRAK (IL-1 receptor-associated kinase), gefolgt von TRAF6 binden [52]. Phosphoryliertes TRAF6 leitet das Signal an den IKK (inhibitor of nuclear factor kappa B kinase)-Komplex weiter, der aus drei Untereinheiten besteht: den beiden Kinasen IKK1/IKKα und IKK2/IKKβ, sowie der regulatorischen Untereinheit IKKγ/NEMO (NFB essential modulator) [53]. Die initiale Aktivierung erfolgt über die Anheftung von aktivierenden K63 (Lysin63)-verknüpften Polyubiquitinketten an NEMO durch die E3-Ligase TRAF6 [54;55]. Ubiquitiniertes NEMO rekrutiert TAK1 (transforming growth factor β-activated protein kinase 1), das IKK2 an Serin 177 und Serin 181 phosphoryliert [48]. IKK2 phosphoryliert im Folgenden IκBα an Serin 32 und Serin 36, was dessen anschließende Ubiquitinierungen und den Abbau im 26S Proteasom zur Folge hat [46;56;57]. Bindung von TNF an den TNFR1 führt hingegen zur Rekrutierung von TRADD an die intrazelluläre Todesdomäne [49]. Im Folgenden binden weitere Proteine wie TRAF2, TRAF5, cIAP (cellular inhibitor of apoptosis) 1, cIAP2 und RIP1 (receptor-interacting protein 1) [26]. Ein weiterer Komplex, der rekrutiert wird, ist LUBAC (linear ubiquitin chain assembly complex), der aus drei Proteinen besteht [58]. TRAF2/TRAF5 katalysieren die K63- verknüpfte Polyubiquitinierung von RIP1 [59], wodurch sowohl der TAK1- als auch der IKK- Komplex rekrutiert wird [60]. Der LUBAC-Komplex ubiquitiniert NEMO linear und aktiviert somit den IKK-Komplex, was letztlich ebenfalls zur proteasomalen Degradierung von IκBα führt [58]. Die frei gewordene NLS führt zur nukleären Translokation von NFB, wo es an Promotor- Konsensussequenzen bindet [44]. Der Aktivitätsstatus von NFB wird zusätzlich durch post- translationale Modifikationen verschiedener Aminosäurereste moduliert. So wird p65 z. B. an Serin 536 phosphoryliert, was die Transkriptionseffizienz responsiver Genen deutlich erhöht [61]. Gene, die NFB-abhängig transkribiert werden, codieren z. B. für Zytokine wie TNF [62] oder IL-1β [63] und anti-apoptotische Proteine, wie XIAP [43], cFLIP (cellular FADD- like interleukin-1 beta-converting enzyme-like inhibitory protein) [64], Bcl-2 [65], cIAP1 oder cIAP2 [66], die entscheidend die physiologische Antwort auf zellulären Stress beeinflussen können. NFB ist somit ein anti-apoptotischer Transkriptionsfaktor, der sich positiv auf das Überleben von Hautkrebszellen auswirken kann und einen wichtigen therapeutischen Angriffspunkt darstellt. Zur Terminierung des NFB-Signalwegs sind mittlerweile sehr viele Proteine identifiziert worden. So wird die Transkription von IκBα durch NFB initiiert, was einen negativen Rückkopplungsmechanismus für NFB darstellt [46]. Die Deubiquitinase A20 entfernt die K63-verknüpften Polyubiquitinketten von RIP1, die für die Signalweiterleitung notwendig sind [67]. Die Phosphatase PP2A (protein phosphatase 2A) dephosphoryliert IKK2 und terminiert an diesem Punkt den NFB-Signalweg [68;69]. 1. Einleitung 22 1.5.3 Pro-apoptotisches NFκB und die Rolle der Phosphatase PP2A NFB kann nicht nur anti-apoptotische Funktionen übernehmen, sondern unter bestimmten Bedingungen zu einem pro-apoptotischen Faktor werden. Obwohl IL-1-aktiviertes NFB Zellen vor TRAIL (tnf related apoptosis inducing ligand)-induzierter Apoptose schützen kann, verstärkt es die über UVB-induzierte Apoptose [70]. P65 fungiert nicht immer als Aktivator von Genen, sondern kann unter gewissen Umständen die gleichen Gene reprimieren [71]. Nach einem DNA-Schaden wird p65 von der Kinase ATR (ataxia telangiectasia and Rad3 related) an Threonin 505 phos-phoryliert [71-73] und kann mit alternativen Kofaktoren interagieren. Dazu zählt die Inter-aktion mit der Histon-Deacetylase 2 [74], wodurch NFB von einem Aktivator in einen Repressor anti-apoptotischer Genexpression umgewandelt wird [69]. Dadurch wird auch die Proteinexpression herunterreguliert. Zu diesen Proteinen gehören cIAP, FLIP (FADD-like interleukin-1 beta-converting enzyme-like inhibitory protein) sowie TRAF1, 2 und 6 [70]. UVB-Strahlung inhibiert die katalytische Untereinheit c der Serin- /Threonin-spezifischen Phosphatase PP2A (Abb. 1.6), die durch die Dephosphorylierung von IKK2 den NFB-Signalweg terminiert. Durch die inhibierte Phosphatase kann der IKK- Komplex IκBα ständig phosphorylieren, welcher letztendlich proteasomal degradiert wird und NFB bleibt lange aktiv [69]. Es kommt zusätzlich zur Repression von anti-apoptotischen Genen, zu einer Bindung an den TNF-Promotor und zur Sezernierung von TNF. Dieses aktiviert autokrin den TNFR1 und verstärkt die über UVB-induzierte Apoptose [70]. Abb. 1.6: Aufbau der Phosphatase PP2A. Der heterotrimere Komplex besteht aus der strukturellen Untereinheit A, der katalytischen Untereinheit C und einer von mehreren verschiedenen regulatorischen Untereinheiten B. In Säugern sind für die Untereinheiten A und C zwei Gene (α und β) bekannt. Von der Untereinheit B sind vier Familien (B, B´, B´´ und B´´´), bei denen mehrere Gene für strukturell ähnliche Isoformen codieren, identifiziert worden (verändert nach [75]). PP2A reguliert nicht nur NFB, sondern auch den Transkriptionsfaktor p53 direkt und indirekt. Der Tumorsuppressor wird normalerweise von PP2A an Threonin 55 dephos- phoryliert und bleibt im Nukleus lokalisiert. Eine Mutation in der regulatorischen Unter- einheiten B führt dazu, dass die beiden Proteine nicht mehr miteinander interagieren können und diese Aminosäure phosphoryliert bleibt. Dadurch kann p21, ein Inhibitor der Zellproli- feration, nicht mehr aufreguliert werden und die Zelle kann ungehindert proliferieren [76-78]. 1. Einleitung 23 1.6 Der Tumorsuppressor p53 1.6.1 Die p53-Familie: p53, p63 und p73 Der Tumorsuppressor p53 nimmt auf sehr viele zellulären Prozesse einen enorm wichtigen Einfluss. Dazu zählen der Zellzyklusarrest, die Apoptose und die Seneszenz. Diese werden vor allem dadurch beeinflusst, dass p53 ein Transkriptionsfaktor ist und Proteine reguliert, die an diesen Prozessen beteiligt sind [79;80]. Zur p53-Familie gehört neben p53 auch p63 und p73, die einen ähnlichen strukturellen Aufbau aufweisen: eine aminoterminale Trans- aktivierungsdomäne, eine zentrale DNA-Bindedomäne und eine carboxylterminale Tetra- merisierungsdomäne. Alle drei Proteine besitzen eine große Homologie in der DNA- Bindedomäne, die sich in der Konservierung von Aminosäureresten zeigt, die mit der DNA interagieren. Somit können auch p63 und p73 den Zellzyklus stoppen und die Apoptose einleiten [81;82]. Trotz der großen Ähnlichkeiten und einer gewissen Redundanz haben p63 und p73 hauptsächlich alternative Funktionen in der Zelle. So ist p63 in Tumoren nur selten mutiert und spielt beim Zellwachstum, bei der Differenzierung von Keratinozyten und bei dem Proliferationspotenzial von Stammzellen im Epithel eine essentielle Rolle [83;84]. P73 hingegen nimmt bei der Neurogenese oder bei sensorischen Signalwegen eine wichtige Rolle ein [85]. 1.6.2 Die Regulierung und die zellulären Aufgaben von p53 Die Aktivität von p53 ist stark durch den Proteinlevel und die Lokalisation kontrolliert [86]. In unstimulierten Zellen wird p53 an verschiedenen Lysinen, die sich im Carboxylterminus des Proteins befinden, ubiquitiniert und durch das 26S Proteasom degradiert [87]. Die wichtigste E3 Ligase, die für diese Modifikation verantwortlich ist, ist Mdm2 (murine double minute2). Dieses Enzym sorgt dafür, dass p53 monoubiquitiniert und aus dem Nukleus exportiert wird. Die für den proteasomalen Abbau notwendigen Polyubiquitinierungen werden durch p300 angefügt [86;88]. Durch diese Regulierungen und den daraus resultierenden Proteinumsatz ist p53 nur in sehr geringen Mengen nachzuweisen [79]. Der Transkriptionsfaktor p53 wird durch verschiedene Stresssignale für die Zelle aktiviert. Dazu zählen die Telomerverkürzung, Aktivierung von Onkogenen, Sauerstoffmangel und vor allem der DNA-Schaden [89]. Als Antwort auf DNA-Schädigungen werden die Sensoren ATM (ataxia telangiectasia-mutated) und ATR aktiviert. ATM phosphoryliert p53 nach Infrarotstrahlung und ATR nach UV-Strahlung [87]. Außerdem werden weitere Serinresten am Aminoterminus von p53 phosphoryliert, die von unterschiedlichen Kinasen katalysiert werden. Insgesamt führen die Modifikationen zur Stabilisierung des Proteins, indem sie die Interaktion mit Mdm2 verhindern [90]. Eine wichtige Phosphorylierung stellt die des Serin 15 dar, die aber alleine nicht dazu ausreicht die Interaktion mit Mdm2 zu blockieren. Jedoch ist sie für die Transaktivierung von p53 wichtig, da sie die Bindung mit der Acetyltransferase p300 erhöht, die mehrere Lysinreste am Carboxylterminus acetyliert. Dieses Enzym kann somit p53 sowohl acetylieren als auch ubiquitinieren [88;90;91]. Nach der Stabilisierung von p53 assoziieren zwei p53-Dimere sowohl über Protein-Protein-Interaktionen als auch 1. Einleitung 24 Interaktionen mit den Basenpaaren der DNA und bilden ein Tetramer. Diese Interaktionen werden über die DNA-Bindedomäne und die Tetramerisierungsdomäne vermittelt [92]. Das Tetramer bindet an spezielle Konsensussequenzen der DNA, welche zwei Wiederholungen von PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy (Pu=Purin; A=Adenin; T=Thymin und Py=Pyrimidin) darstellt [90]. Jedoch konnten mittlerweile viele funktionelle p53-Bindestellen identifiziert werden, bei denen ein oder mehrere Basenpaare nicht mit der Konsensussequenz übereinstimmen. Nach DNA-Bindung müssen verschiedene Modifikationen bei p53 und den Histonen stattfinden, damit die Transkription initiiert werden kann. Die wichtigste Histonmodifikation ist die Acetylierung, die vor allem durch die Acetyltransferasen p300 und CBP katalysiert werden. P300 kann somit p53 positiv und negativ regulieren: negativ durch die Polyubiquitinierungen und positiv durch die Acetylierungen von p53 selbst und den Histonen [93;94]. Durch p53 werden sehr viele Gene transkribiert. Dazu zählt unter anderem Mdm2 (Abb. 1.7), die wichtigste E3-Ligase für die Regulierung von p53. Die Aufregulierung dieses Enzyms stellt somit einen negativen Rückkopplungsmechanismus von p53 dar [87;95;96]. Diese beiden Beispiele, p300 und Mdm2, zeigen wie komplex die Regulierung des Transkriptionsfaktors p53 ist. Abb. 1.7: Der Tumorsuppressor p53 reguliert die Transkription sowohl von pro- und anti- apoptotischen Faktoren, als auch die des eigenen Inhibitors Mdm2. Da p53 als Repressor von anti- apoptotischen Genen, wie dem Bcl-2-Gen, und Aktivator von pro-apoptotischen Genen, die für Bax und Noxa kodieren, fungiert der Transkriptionsfaktor als ein wichtiger Regulator der Apoptose. Durch die Transkription des eigenen Inhibitors Mdm2, reguliert p53 die eigene Proteinmenge in einem negativen Rückkopplungsmechanismus (siehe Abschnitte 1.4.2 und 1.6.2) [97]. 1. Einleitung 25 Nicht nur die Regulierung von p53 selbst ist komplex, sondern auch welche Gene von p53 nach zellulären Schäden reguliert werden. Auf diese Entscheidung haben viele Faktoren einen Einfluss. Posttranslationale Modifikationen, der Proteinlevel von p53, sowie der cross talk mit anderen Signalwegen wie dem NFB-Signalweg spielen hierbei eine Rolle [87;98]. Geringer Stress wie z. B. ein leichter DNA-Schaden führt zunächst zu einem transienten Zellzyklusarrest und die Zelle hat Zeit den entstanden Schaden zu reparieren [79]. P53 vermittelt hierbei die Aufregulierung von p21 [99], einem Inhibitor Cyclin-abhängiger Kinasen, sowie GADD45α (growth arrest and DNA-damage-inducible protein α) [100] und 14-3-3σ [101], die für den Zellzyklusarrest wichtig sind. Ist der Schaden irreparabel, erfolgt die Einleitung der Apoptose. Diese wird zum einen durch die Aufregulierung von pro- apoptotische Faktoren (Abb. 1.7 und Abschnitt 1.4.2), wie CD95, Puma, Noxa und Bax, gesteuert. Zum anderen kommt es zur Repression der Transkription von anti-apoptotischen Faktoren wie Bcl-2 und Survivin [87;95]. Durch die Induktion der Apoptose in geschädigten Zellen kann p53 den Organismus vor entarteten Krebszellen schützen. Der Verlust der p53- Aktivität oder Mutationen stellen kritische Ereignisse bei der Krebsentstehung dar. 1.6.3 Mutationen in p53 und deren Rolle bei der Entstehung von Krebs Der Tumorsuppressor p53 ist in über 50 % der menschlichen Tumore mutiert. 74 % dieser Mutationen sind sinnveränderte Punktmutationen, die das Protein nicht in seiner Länge verändern. Dieser Anteil ist bei p53 viel höher als in anderen Tumorsuppressorgenen [17]. Insgesamt finden 95 % der Mutationen in der zentralen DNA-bindenden Domäne statt, in der auch die sechs Aminosäuren, die am häufigsten (sog. hot spots) mutiert sind, liegen (Abb. 1.8) [102]. Abb. 1.8: Die Häufigkeit von Mutationen in p53. 95 % der Mutationen des Tumorsuppressors p53 finden in der zentralen DNA-bindenden Domäne statt. Die sechs am häufigsten mutierten Aminosäuren sind dargestellt [102]. Mutationen, die in der DNA-Bindedomäne stattfinden, werden generell in zwei Gruppen eingeteilt: in Konformations- und in Kontaktmutationen. In mehreren Modellen konnte 1. Einleitung 26 gezeigt werden, dass die onkogenen Wirkungen der Konformationsmutanten stärker sind als jene der Kontaktmutatanten [103]. Ein Beispiel hierfür ist die Konformationsmutante p53R175H, in der an Position 175 ein Arginin in ein Histidin mutiert ist, und die Kontaktmutante p53R248W, in der an Position 248 ein Arginin in ein Tryptophan mutiert ist. Die p53R175H-Mutante konnte Epithelzellen immortalisieren, während die p53R248W- Mutante nur die Lebensspanne dieser Zellen verlängern konnte [104]. Dieses Beispiel zeigt, dass Mutationen in p53 nicht nur zum Verlust der normalen Funktionen (loss-of-function; LOF), sondern auch einen Zugewinn von neuen Eigenschaften (gain-of-function; GOF), die gegenteilig der ursprünglichen Funktionen sind, zur Folge haben können (Abb. 1.9) [105]. Dies ist dadurch zu erklären, dass GOF-Mutanten einen dominant-negativen Effekt über Wildtyp p53 (wtp53) aufweisen. Dieser wird dadurch ausgeübt, dass GOF-Mutanten mit wtp53 über die Tetramerisierungsdomäne (Abb. 1.8) miteinander interagieren und das Wildtyp-Protein somit nicht mehr seine normalen Funktionen ausüben kann [103]. Durch die Mutationen können des Weiteren Gene transkribiert werden, die für Proteine codieren, die mit einer erhöhten Proliferation einhergehen, die Apoptose inhibieren können oder Chemoresistenz vermitteln. Dazu gehören z. B. MAP2K3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3), Myc, CD95 und NF-κB2. Dies hat die entgegengesetzte Wirkung von wtp53 und hat für den Organismus weit schwerwiegendere Konsequenzen als der reine Verlust des Wildtyp-Proteins [105]. Interessanterweise erkennt mutiertes p53 (mutp53) keine andere Konsensussequenz wie wtp53. Vielmehr ist die Struktur der DNA wichtig, damit sie von den Mutanten erkannt wird [102;103;106]. Abb. 1.9: Einige Mutationen in p53 können zur Regulierung von neuen Gruppen von Zielgenen führen. Normalerweise reguliert p53 die Transkription von Genen, die für die Initiierung der Apoptose und der DNA-Reparatur wichtig sind. Mutationen in dem Tumorsuppressor können einerseits zum Verlust dieser Eigenschaften führen (loss-of-function; LOF), andererseits kann es zum Zugewinn neuer Eigenschaften kommen (gain-of-function; GOF). Diese Mutationen wirken dominant- negativ (DN) über wtp53 und regulieren die Transkription von Genen, die die gegenteiligen zellulären Effekte von wtp53 auslösen. Diese Gene codieren für Proteine, die sich positiv auf die Proliferation, das Überleben und das Metastasieren auswirken (verändert nach [105]). 1. Einleitung 27 Wtp53 und mutp53 unterscheiden sich auch in ihrer Regulierung. In unstimulierten Zellen hat wtp53 eine kurze Halbwertszeit und wird durch die E3-Ligase Mdm2 für den proteasomalen Abbau markiert. Mutp53 wird nicht durch diesen negativen Rückkopplungsmechanismus reguliert und kann so in der Zelle akkumulieren [103]. Über all diese Wege und Regulierungen kann mutp53 die Krebsentstehung fördern [105]. Die durchschnittliche Mutationsrate von p53 liegt zwar bei 50 %, jedoch variiert dieser Prozentsatz sehr stark bei unterschiedlichen Tumorformen. Beim Malignen Melanom, Sarkom oder Hodenkrebs ist der Tumorsuppressor nur zu 5 % mutiert [107]. Mutationen in diesem Protein sind allerdings in über 90 % des weißen Hautkrebses vorzufinden [108]. Für die hohe Mutationsrate in dem Protein ist UV-Strahlung die wichtigste Ursache (siehe Abschnitt 1.2). Allerdings tragen nur etwa 4 % aller Keratinozyten Mutationen in p53 [109]. Dies deutet an, dass das Protein eine große Rolle bei weißem Hautkrebs spielt. Ob diese Mutationen jedoch letztendlich die Ursache für die Entstehung dieser Tumorform sind, konnte bislang nicht eindeutig geklärt werden. 1.7 Vorarbeiten aus der Arbeitsgruppe Aus Vorarbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass sich die beiden Keratinozytenzelllinien HaCaT und SCL-1 in der Empfindlichkeit gegenüber UVB unterscheiden. HaCaT-Zellen sind sensitiv gegenüber UVB-Bestrahlung und induzierten den apoptotischen Zelltod. SCL-1- Zellen sind selbst gegenüber sehr hohen Dosen UVB resistent (Abb. 1.10), was untypisch für Keratinozyten ist, denn die Einleitung der Apoptose stellt einen wichtigen Schutz vor der Entstehung von Hautkrebs dar [110;111]. Abb. 1.10: SCL-1-Zellen sind resistent gegenüber hohen UVB-Dosen. Die Zellen wurden mit den angegebenen UVB-Dosen (20-100 mJ/cm2) bestrahlt und nach 16 h die Apoptose im Cell death detection ELISA zu bestimmt. Die dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten +/- Standardabweichung der jeweiligen Doppelbestimmung [110]. Die beiden Zelllinien unterscheiden sich des Weiteren in der Expression des Tumorsuppressors p53 (Abb. 1.11). HaCaT-Zellen tragen auf beiden Allelen unterschiedliches mutp53 [112]. SCL-1-Zellen besitzen zwar eine genomische Kopie von p53, 1. Einleitung 28 jedoch lässt sich weder die entsprechende mRNA (messenger RNA) noch das Protein nachweisen, was darauf hinweist, dass diese Zellen p53-defiziente Zellen sind, die das Protein endogen nicht exprimieren [111]. Abb. 1.11: SCL-1-Zellen exprimieren kein p53. Oben: In Gesamtzelllysaten wurde die Expression von p53 in Proteinextrakten mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente α- Tubulin. Mitte und unten: Die Zellen wurden für 2 h mit 20 mJ/cm2 UVB bestrahlt. Die genomische DNA und die cDNA dienten als Templates für die PCR-Reaktionen, die mit spezifischen p53-Primern durchgeführt wurden. GAPDH diente als Ladekontrolle [111]. Nach Bestrahlung mit UVB leitet die Epithelzelllinie KB die Apoptose ein. Durch die Zugabe von IL-1, welches den Transkriptionsfaktor NFκB aktiviert, lässt sich die Apoptose signifikant erhöhen (Abb. 1.12 links). In diesem Modell wirkt der normalerweise anti- apoptotische Transkriptionsfaktor NFκB pro-apoptotisch. Es kommt zur Herunterregulierung der anti-apoptotischen Proteine FLIP und TRAF2 und vor allem zu einer starken Sezernierung von TNF (Abb. 1.12 rechts), das für die erhöhte Apoptoserate verantwortlich ist [70]. Abb. 1.12: Kostimulation mit IL-1 erhöht die UVB-induzierte Apoptose in KB-Zellen. KB-Zellen wurden entweder mit 10 ng/ml IL-1, 35 mJ/cm2 UVB oder mit beiden Stimuli für 16 h behandelt. Links: Die Apoptose wurde im Cell death detection ELISA bestimmt. Rechts: Im zellfreien Überstand wurde die Menge an TNF in einem ELISA ermittelt. Die dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten +/- Standardabweichung der jeweiligen Triplikate [70]. 1. Einleitung 29 1.8 Zielsetzung der Arbeit UVB-Strahlung induziert in der DNA spezifische Schäden, die zur Aktivierung von wtp53 und zur Induktion von Apoptose führen. So kann der Organismus vor entarteten Keratinozyten und letztendlich vor Hautkrebs geschützt werden. Gleichzeitig kann UVB die Photokarzinogenese durch Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen begünstigen. Dies geschieht durch UV-typische Mutationen im p53-Gen, die zu einem Zugewinn von neuen Eigenschaften (gain-of-function; GOF) führen, die gegenteilig zu den Wildtypfunktion des Proteins sind. So können andere Gene reguliert werden, die für Proteine kodieren, die anti- apoptotische und pro-proliferative Funktionen ausüben. In diesen GOF-Mutanten werden Krebsentstehung und Proliferation somit aktiv gefördert. Jedoch kann ein Wechsel der ursprünglichen Eigenschaft nicht nur bei p53, sondern auch bei dem Transkriptionsfaktor NFκB stattfinden. Dieser hat hauptsächlich pro-proliferative und anti-apoptotische Aufgaben. Allerdings kann NFκB nach seiner Aktivierung von IL-1 und durch gleichzeitige UVB- Bestrahlung von einem Aktivator zu einem Repressor anti-apoptotischer Gene werden. Auf Grund der gleichzeitig erhöhten TNF-Sezernierung und der autokrinen Aktivierung des TNFR1 wird die UVB-induzierte Apoptose additiv erhöht. Obwohl 4 % aller Keratinozyten Mutationen in p53 aufweisen, erkrankt nicht jeder menschliche Organismus an Hautkrebs. Daher muss es einen zellulären Mechanismus geben, der zur Elimierung genau dieser Zellen beiträgt. Da die Haut das einzige Organ des Menschen ist, das ständiger UV-Bestrahlung ausgesetzt ist, soll an humanen Keratinozyten untersucht werden, welche molekularen Grundlagen zur Eliminierung von Keratinozyten mit mutp53 führen. Keratinozyten sezernieren nach Bestrahlung mit UVB das Zytokin IL-1 und aktivieren somit NFκB. Auch ist bekannt dass zwischen den beiden Transkriptionsfaktoren NFκB und p53 in vielen Zelltypen ein extensiver cross talk besteht. Dieser ist von mehreren Faktoren wie dem p53-Status oder dem Stimulus abhängig. Es soll analysiert werden, ob in der Keratinozytenzelllinie HaCaT ein cross talk zwischen mutp53 und NFκB stattfindet. Da diese Zelllinie trotz der Expression von mutp53 sensitiv gegenüber UVB-Strahlung ist, stellt sie ein gutes Modellsystem dar, womit ein Beitrag zur andauernden Debatte wie UVB sowohl zur Induktion von Mutationen in Tumorsuppressorgenen als auch zur Elimierung genau dieser Zellen führt, beitragen kann. Außerdem soll untersucht werden, ob der initial anti- apoptotische Transkriptionsfaktor NFκB kooperativ mit mutp53 daran beteiligt ist. 2. Material 30 2. Material 2.1 Allgemeine Chemikalien Tab. 2.1: Allgemeine Chemikalien Chemikalie Firma 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure (HEPES) Roth 2-Propanol VWR Agar Roth Agarose Roth Ammoniumperoxodisulfat (APS) Roth Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma Bromphenolblau Sigma Chloroform-Isoamylalkohol Sigma Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) VWR Essigsäure Merck Ethanol VWR Ethidiumbromid (EtBr) Roth Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) Roth Formaldehyd Merck Gelatine Sigma Glycerol VWR Glycin Roth Glykogen Sigma Hefeextrakt Roth Kaliumchlorid (KCl) Roth Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Roth Kristallviolett Roth Lachssperma-DNA Serva Lithiumchlorid (LiCl) Sigma Luminol Sigma Magnesiumchlorid (MgCl2) Roth Maleinsäure Roth Methanol VWR Milchpulver Roth Natrium Deoxycholate Sigma Natriumazid (NaN3) Roth Natriumchlorid (NaCl) VWR Natriumfluorid (NaF) Roth Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Roth Natriumhydroxid (NaOH) Roth Natriumlaurylsulfat (SDS) Roth Nonidet™ P 40 Substitute (NP40) Sigma para-Hydroxycoumarinsäure Sigma Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol Sigma Protein-A-Agarose KPL Roti®-Quant Roth 2. Material 31 Rotiphorese® Gel 30 (Acrylamid) Roth rProtein A Sepharose Fast Flow GE Healthcare Salzsäure Roth Sepharose Sigma Sodium pyrophosphate tetrabasic (Na4P2O7) Sigma Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Roth Triton® X 100 Roth Trypton Roth Tween® 20 Serva Wasserstoffperoxid (H2O2) Roth β-Mercapthoethanol Roth 2.2 Zellen, Puffer, Lösungen und Stimulanzien/Inhibitoren für die Zellkultur 2.2.1 Verwendete Zelllinien SCL-1-Zellen wurden aus der Biopsie eines humanen Plattenepithelkarzinoms gewonnen. Ihnen fehlt sowohl die typische Keratinisierung, als auch die normale epidermale Differen- zierung und sie weisen somit einen kaum differenzierten Phänotyp auf. Die heterogene Morphologie, die atypische Mitose und der Variationen im Karyotyp sind starke Anzeichen, dass diese Zellen transformiert sind. Die geringe Wachstumsrate und der annähernd normale, diploide DNA-Gehalt sind allerdings nicht typisch für maligne Zellen [113]. HaCaT (Human adult low Calcium high Temperature keratinocytes)-Zellen sind eben-falls humane Keratinozyten. Sie stammen aus der Haut eines 62 Jahre alten männlichen Patienten. Die Zellen sind in vitro spontan immortalisiert, aber nicht tumorigen und haben die Kapazität zur vollständigen, epidermalen Differenzierung [114]. 2.2.2 Puffer, Lösungen und Zubehör für die Zellkultur PBS 137 mM NaCl 2.7 mM KCl 10 mm Na2HPO4 1.8 mm KH2PO4 einstellen auf pH 7.4 Lösungen und Zubehör für die Zellkultur Blasticidin, Fetales Kälberserum (fetal calf serum; FCS) und Geneticin (G418); PAA Cryo-Container “Mr. Frosty”; Sigma Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), Penicillin Streptomycin (PenStrep) und Trypsin; Life Technologies Elektroporationsküvetten; PeqLab Trypanblau; Biochrom 2. Material 32 2.2.3 Stimulanzien/Inhibitoren Calyculin A; Cell signaling IL-1β und TNF; R&D Systems TNFR1-Antagonist (Antikörper H398); wurde freundlicherweise von Prof. Dr. Peter Scheurich (Universität Stuttgart) bereitgestellt 2.3 Vektoren/Plasmide Tab. 2.2: Verwendete Vektoren/Plasmide Plasmid Vektorgerüst Resistenz (Transformation) Resistenz (Zellkultur) Leervektor, Mock pcDNA3 Ampicillin G418 IκB DN 32/36 pBK CMV Ampicillin G418 p53i pRetroSuper-blasto Ampicillin Blasticidin p53 WT pCMV-neo-Bam Ampicillin G418 p53 R175H pCMV-neo-Bam Ampicillin G418 p53 R248W pCMV-neo-Bam Ampicillin G418 p53 WT-Mutagenese pCMV-neo-Bam Ampicillin G418 p53 R175H-Mutagenese pCMV-neo-Bam Ampicillin G418 p53 R248W-Mutagenese pCMV-neo-Bam Ampicillin G418 2.4 Reagenzien und siRNAs für die Lipofectamine® 2000-Transfektion 2.4.1 Reagenzien für die Lipofectamine® 2000-Transfektion Lipofectamine® 2000 und Opti-MEM®; Life Technologies siRNAs; MWG Biotech 2.4.2 siRNAs für die Lipofectamine® 2000-Transfektion Tab. 2.3: Verwendete siRNAs für die Lipofectamine® 2000-Transfektion siRNA Sequenz siLacZ Sense 5´- GCG GCU GCC GGA AUU UAC CTT - 3´ Antisense 5´- GGU AAA UUC CGG CAG CCG CTT - 3´ siPP2Ac Sense 5´- GAG GUU CGA UGU CCA GUU ATT - 3´ Antisense 5´- UAA CUG GAC AUC GAA CCU CTT - 3´ siXIAP Sense 5´- AUC CAU CCA UGG CAG AUU ATT - 3´ Antisense 5´- UAA UCU GCC AUG GAU GGA UTT - 3´ 2.5 Färben und Entfärben mit Kristallviolett Kristallviolettlösung 2.45 mM Kristallviolett 20 % Methanol 2. Material 33 Entfärbelösung für Kristallviolett 50 mM KH2PO4 50 % Ethanol 2.6 Kits für den TNF-ELISA und den Cell death detection ELISA Quantikine ELISA SixPak, Human TNF; R&D Systems Cell death detection ELISA Plus ; Roche 2.7 Puffer, Lösungen, Zubehör und Antikörper für die Proteinanalyse 2.7.1 Puffer und Lösungen für die Proteinanalyse 2x Lämmli-Puffer 125 mM Tris, pH 6.8 14 mM SDS 289 µM Bromphenolblau 10 % Glycerol 10 % β-Mercaptoethanol 5x Lämmli-Puffer 312.5 mM Tris, pH 6.8 35 mM SDS 722.5 µM Bromphenolblau 25 % Glycerol 25 % β-Mercaptoethanol 4x Trenngelpuffer 1.5 M Tris, pH 8.8 1.4 mM SDS 4x Sammelgelpuffer 0.5 M Tris, pH 8.8 1.4 mM SDS APS 43.8 µM 1x TBS 0.5 M NaCl 20 mM Tris; pH 7.5 2. Material 34 1x TBST 0.5 M NaCl 20 mM Tris; pH 7.5 0.05 % Tween® 20 SDS-Laufpuffer 25 mM Tris 192 mM Glycin 350 µM SDS Transfer-Puffer 25 mM Tris 192 mM Glycin 20 % Methanol 10x Blockierlösung (BL) 10 % (w/v) Blocking Reagent in 50 mM Maleinsäure 75 mM NaCl; pH 7.5 Milchpulverlösung 5 % (w/v) Milchpulver in 0.5 M NaCl 20 mM Tris; pH 7.5 0.05 % Tween® 20 selbst hergestellte Detektionslösung (Detek.) 1.4 mM Luminol in 0.1 M Tris; pH 8.6 6.7 mM para-Hydroxycoumarinsäure in DMSO 0.45 % H2O2 2.7.2 Zubehör für die Proteinanalyse Tab. 2.4: Verwendetes Zubehör für die Proteinanalyse Produkt Firma Blocking Reagent Roche Fertiggele BioRad Protein-Marker Thermo Scientific Membran (Nitrozellulose) Hartenstein Membran (PVDF) BioRad Röntgenfilme CEA SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific Whatman-Papiere Hartenstein 2. Material 35 2.7.3 Antikörper für die Western Blot-Analyse Tab. 2.5: Verwendete Antikörper für die Western Blot-Analyse Antikörper Firma Artikelnummer β-Aktin Cell signaling 4970 Bax Cell signaling 2772 Bid Cell signaling 2002 Bcl-2 Cell signaling 2872 Caspase 3 Cell signaling 9665 Caspase 8 BD Biosciences 551243 Caspase 9 Cell signaling 9502 Caspase 10 Sigma C8351 cIAP1 Cell signaling 4952 cIAP2 Cell signaling 3130 CREB Cell signaling 9197 Cytochrome c Cell signaling 4280 FLIP BD Biosciences 556567 GAPDH Cell signaling 2118 IBα Cell signaling 4814 Mcl-1 Cell signaling 4572 p50 Santa Cruz sc-8414 p53 BD Biosciences 554293 p63 Santa Cruz sc-8431 p65 Santa Cruz sc-8008 p73 Calbiochem PC385 PARP BD Biosciences 551025 Phospho-CREB Cell signaling 9198 Phospho-p53 Cell signaling 9284 Phospho-p65 Cell signaling 3033 PP2Ac Cell signaling 2038 Smac Cell signaling 2954 XIAP BD Biosciences 610717 Sekundärer AK -mouse GE Healthcare NA931V Sekundärer AK -rabbit GE Healthcare NA934V Sekundärer AK -rabbit Cell signaling 7074P2 2.8 Puffer und Antikörper für die South-Western dot-blot-Analyse 2.8.1 Puffer für die South-Western dot-blot-Analyse Denaturierungspuffer 1.5 M NaCl 0.5 M NaOH Neutralisationspuffer 1 M Tris 2 M NaCl 2. Material 36 2.8.2 Antikörper für die South-Western dot-blot-Analyse Tab. 2.6: Verwendete Antikörper für die South-Western dot-blot-Analyse Antikörper Firma Adenosin Research Plus Inc CPD Klon KTM53 Kamiya Biomedical 2.9. Lysepuffer und Antikörper für die Co-IP 2.9.1 Lysepuffer für IP 50 mM HEPES, pH 7.5 150 mM NaCl 10 % Glycerol 1 % Triton® X 100 1.5 mM MgCl2 1 mM EGTA 100 mM NaF 10 mM Na4P2O7 1.5 mM NaN3 PhosSTOP® Complete® 2.9.2 Antikörper für die Co-IP Tab. 2.7: Verwendete Antikörper für die Co-IP Antikörper Firma Artikelnummer p53 Cell signaling 9282 p65 Santa Cruz sc-372 2.10 Puffer, Zubehör und Kits für ChIP 2.10.1 Puffer für ChIP Zelllyse-Puffer 10 mM Tris, pH 7.5 10 mM NaCl 3 mM MgCl2 2.5 % NP40 10 µM MG-132 PhosSTOP® Complete® 2. Material 37 Verdünngspuffer 10 mM Tris, pH 8.0 1 mM EDTA pH 8.0 0.5 mM EGTA pH 8.0 10 µM MG-132 PhosSTOP® Complete® ChIP-Puffer 16.7 mM Tris, pH 8.0 1.2 mM EDTA pH 8.0 167 mM NaCl 35 µM SDS 1.1 % Triton® X 100 10 µM MG-132 PhosSTOP® Complete® Low-Salt-Puffer 20 mM Tris, pH 8.1 150 mM NaCl 2 mM EDTA 350 µM SDS 1 % Triton® X 100 Complete® High-Salt-Puffer 20 mM Tris, pH 8.1 500 mM NaCl 2 mM EDTA, pH 8.0 350 µM SDS 1 % Triton® X 100 LiCl-Puffer 10 mM Tris, pH 8.0 1 mM EDTA 24.1 mM Natrium Deoxycholate 1 % NP40 0.25 M LiCl 2. Material 38 TE-Puffer 10 mM Tris, pH 8.0 1 mM EDTA, pH 8.0 Elutionspuffer 0.1 M NaHCO3 3.5 mM SDS Proteinase K-Puffer 667 mM Tris, pH 6.5 167 mM EDTA, pH 8.0 2.10.2 Zubehör für ChIP Covaris Röhrchen; LGC Genomics low-DNA-binding-Reaktionsgefäße; Eppendorf MSB® Spin PCRapace; Stratec Proteinase K; Sigma 2.10.3 Antikörper für ChIP Tab. 2.8: Verwendete Antikörper für ChIP Antikörper Firma Artikelnummer Phospho-p53 Cell signaling 9284 p65 Santa Cruz sc-372 2.11 Inhibitoren für die Co-IP und ChIP Complete® und PhosSTOP®; Roche MG-132; Calbiochem 2.12 Primer, Zubehör und Puffer für die PCR 2.12.1 Primer für die Promotor-PCRs Tab. 2.9: Verwendete Primer für die Promotor-PCRs Primer Sequenz IκB-Promotor For 5´- ACA GGA TTA CAG GGT GCA GG - 3´ Rev 5´- GAG AAA CTC CCT GCG ATG AG - 3´ TNF-Promotor (p53) For 5´- CGG GTC AGA ATG AAA GAA GAA G - 3´ Rev 5´- GAG GGA AAA GCT GTG TTG AG - 3´ TNF-Promotor (p65) For 5´- CCA CAG CAA TGG GTA GGA GAA TG - 3´ Rev 5´- TTC ATG AAG CTC TCA CTT CTC AG- 3´ 2. Material 39 2.12.2 Zubehör für die PCR DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit; Thermo Scientific Marker (1 kb und 100 bp); Thermo Scientific Primer; Biomers RedTaq; BioLine 2.12.3 Puffer für die Gelelektrophorese 6x DNA-Probenpuffer 10 mM Tris, pH 7.6 433.5 µM Bromphenolblau 60 % Glycerol 160 mM EDTA 1x TAE pH 8.3 0.1 mM Tris 1 mM EDTA 1.1 % Essigsäure 2.13 Zubehör für Klonierung, Mutagenese, Transformation in E. coli, Mini- /Midi-Präparation und Sequenzierung 2.13.1 Puffer und Platten für die Transformation in E. coli LB-Medium 85.6 mM NaCl 0.5 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) Trypton einstellen auf pH 7.2 LB-Agarplatten mit Ampicillin 171.1 mM NaCl 0.5 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) Trypton 1.5 % (w/v) Agar einstellen auf pH 7.2 100 µg/ml Ampicillin 2. Material 40 2.13.2 Kits für Klonierung, Mutagenese, Transformation in E. coli, Mini-/Midi- Präparation und Sequenzierung NucleoBond Xtra Midi Kit; Macherey Nagel QuikChange Site-directed Mutagenese Kit; Stratagene High Pure PCR Product Purification Kit; Roche RNeasy Mini-Kit; Qiagen First strand cDNA-Synthesis Kit; Thermo Fisher Scientific QIAquick Gel Extraction Kit; Qiagen 2.13.3 Antibiotikum und Bakterienzellen Ampicillin; Roth TOP 10F´; Invitrogen 2.13.4 Reagenzien für die Mutagenese und Klonierung Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs); Thermo Scientific DpnI; Fermentas High Fidelity DNA-Polymerase; Roche KOD Hot Start DNA Polymerase; Novagen EcoRI und XhoI; Thermo Scientific T4-DNA-Ligase; Thermo Scientific 2.13.5 Primer für die Mutagenese und Sequenzierung Tab. 2.10: Verwendete Primer für die Mutagenese und Sequenzierung Primer Sequenz Mutagenese-Primer p53 For 5´- ATC ACA CTG GAA GAT AGC TCC GGC AAC CTT CTA GGA CGG AAC AGC - 3´ Rev 5´- GCT GTT CCG TCC TAG AAG GTT GCC GGA GCT ATC TTC CAG TGT GAT - 3´ Sequenzier-Primer p53 For 5´- CCC GGA CGA TAT TGA ACA ATG G - 3´ Rev 5´- GCC GAA TTC TGT CTG AGT CAG GCC CTT C - 3´ Sequenzier-Primer Caspase 3 For 5´- GCG GAA TTC GAG AAC ACT GAA AAC TC - 3´ Rev 5´- CCG CTC GAG TTA GTG ATA AAA ATA GAG - 3´ 2. Material 41 2.14 Geräte/Zubehör Tab. 2.11: Verwendete Geräte/Zubehör Geräte/Zubehör Firma Covaris S2 Covaris Entwickler Curix 60 AGFA EquiBio Easyject Plus PeqLab ImageQuant LAS 4000 GE Healthcare Infinite® M200 Tecan Mini-PROTEAN® Tetra Cell BioRad Olympus CKX41 Olympus PikoReal24 Thermo Scientific Semi Dry Blotter Phase T3000 Thermocycler Biometra Trans-Blot ® Turbo™ Transfer System BioRad UVB-Lampe TL 20W/12 RS SLV Philips 2.15 Software Tab. 2.12: Verwendete Software Software Firma/Internetseite BLAST (bl2 seq) www.pubmed.com Covaris SonoLite Covaris GraphPad Prism 6 GraphPad i-control 1.10 Tecan ImageQuant LAS 4000 GE Healthcare Magellan 7.1 SP1 Tecan Microsoft Office Microsoft PikoReal Software 2.1 Thermo Scientific 2.16 Wiederholung der Experimente und statistische Analyse Alle dargestellten Experimente wurden dreimal wiederholt. Bei den ELISAs (enzyme linked immunosorbent assay) und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (quantitative Polymerase chain reaction; qPCR)-Ergebnissen wurden technische Duplikate durchgeführt und anschließend die Experimente gepoolt. Die dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten und (+) Standardabweichung. Bei den abgebildeten Western-Blots, semiquantitativen PCRs, dem South Western dot-Blot, dem clonogenic assay, dem Replattierungsassay und der Caspase 3-Sequenzierung wurde ein repräsentatives von drei Experimenten gezeigt. Zur statistischen Analyse wurde der student’s t-test durchgeführt. *p < 0.05; **p < 0.01 3. Methoden 42 3. Methoden 3.1 Auftauen von Zellen Die Zellen wurden aufgetaut und sofort in 5 ml DMEM/10 % FCS überführt. Nach Zentrifugation bei 300 x g für 5 min wurden die pelletierten Zellen in 8 ml DMEM/10 % FCS resuspendiert und in einer Zellkulturflasche (T25) ausgesät. 3.2 Kultivierung der Zelllinien Alle verwendeten Zelllinien wurden in einem Inkubator bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Dreimal wöchentlich wurden die Zellen gesplittet (1:4 bis 1:10). Das verbrauchte Medium wurde abgesaugt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen, in 1x (SCL-1) oder 2x (HaCaT) Trypsin für 13 min im Inkubator abgelöst, das Trypsin in 5 ml DMEM/10 % FCS abgestoppt und die Zellen für 5 min bei 300 x g abzentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden in 21 ml DMEM/10 % FCS unter Zugabe des entsprechenden Antibiotikums (HaCaT und SCL-1: 1 % PenStrep; HaCaT-p53i: 5 µg/ml Blasticidin; HaCaT-IB-SR: 1.67 mg/ml G418; HaCaT- p53i-IB-SR: 2.5 µg/ml Blasticidin + 0.835 mg/ml G418) in eine Zellkulturflasche (T175) überführt. Die Zellen wurden so drei Monate in Kultur gehalten und dann entsorgt, da sich nach dieser Zeit der physiologische Zustand der Zellen veränderte. 3.3 Zellzahlermittlung und Vitalbestimmung mittels Trypanblau-Färbung Trypanblau ist ein nicht-membranpermeabler anionischer Diazofarbstoff und färbt nur tote Zellen ohne intakte Zellmembran an. Zur Bestimmung der Lebendzellzahl wurden die Zellen 1:2 mit 0.5 % Trypanblau versetzt. 10 µl wurden in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert. Unter dem Lichtmikroskop konnten anhand der Blaufärbung tote von lebenden Zellen unterschieden und ausgezählt werden. 3.4 Einfrieren der Zellen Die Zellen müssen sich in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Eine 70 % konfluente Zellkulturflasche (T175) wurde trypsiniert, die Zellen pelletiert, in 4 ml DMEM/ 10 % FCS/10 % DMSO resuspendiert und auf vier Kryoröhrchen verteilt. Die Röhrchen wurden in einen Gefrierbehälter („Mr. Frosty“), der Raumtemperatur hatte und mit 2- Propanol befüllt war, gegeben und über Nacht auf -80°C gestellt, um einen konstanten Temperaturabfall zu gewährleisten. 3. Methoden 43 3.5 Aussaat und Stimulation der verwendeten Zelllinien Am Tag vor der Stimulation wurden die Zellen ausgesät. Die Zellzahl richtete sich nach der Größe der Kulturschale beziehungsweise Kulturflasche und nach der verwendeten Zelllinie (SCL-1-Zellen: 3x10 5 Zellen/ml; HaCaT: 3,5x10 5 Zellen/ml, außer HaCaT-p53i-Zellen: 2,5x10 5 Zellen/ml). Wurde eine siRNA (small interfering RNA) mittels Lipofectamine® 2000 in die Zellen gebracht, erfolgte dies im 12 Well-Format gleichzeitig mit der Zellaussaat. Die Konfluenz der Zelllinien betrug bei fast allen Versuchen 80 %, lediglich bei der Chromatin Immunopräzipitation betrug die Konfluenz 60 % und bei dem clonogenic assay wurden 50 000 Zellen ausgesät. Die Bestrahlung der Zellen mit UVB erfolgte in PBS, da das im DMEM enthalten Phenolrot die UVB-Strahlung absorbiert. Die Zellen wurden ohne Deckel in eine Kammer, die mit sechs UVB-Röhren mit einer Leistung von 0.97 mJ/cm² ausgestattet war, für 30 sec (entspricht etwa 30 mJ/cm²) bestrahlt. Das abgenommene Kulturmedium wurde im Anschluss wieder auf die Zellen gegeben. Wurden die Zellen zusätzlich mit IL-1 (10 ng/ml) oder TNF (100 ng/ml) stimuliert, wurde dieses in das abgenommen Kulturmedium gegeben. Calyculin A, ein PP2A-Inhibitor, wurde 5 nM eingesetzt und 30 min vor der jeweiligen Stimulation appliziert. Der TNFR1 wurde mit einem antagonistischen Antikörper H398 (40 μg/ml) blockiert und 30 min vor der jeweiligen Stimulation appliziert. 3.6 Plasmid-Transfektion mittels Elektroporation Alle Schritte wurden mit gekühlten Reagenzien und auf Eis durchgeführt. Die 60 % konfluenten Zellen wurden geerntet. 6.5 x 10 6 Zellen wurden in 600 µl DMEM/10 % FCS/1.5 % DMSO resuspendiert und in 4 mm-Elektroporations-Küvetten, in denen 25 µg der gewünschten Plasmid-DNA vorgelegt wurde, überführt. Die Zellen wurden mit Hilfe des Easyject Plus bei einer Spannung von 250 V bei unendlichem Widerstand und 1200 µF elektroporiert, anschließend sofort in vorgewärmtes DMEM/10 % FCS überführt und entsprechend der weiteren Verwendung ausplattiert. 3.7 Herstellung stabiler Zelllinien Für die klonale Expansion transfizierter Zellen wurden statistisch je zwei Zellen in eine Vertiefung einer 96 Well-Platte mit flachem Boden gesetzt (3 Platten/Aufteilung) und unter Selektionsdruck kultiviert. Die Zellen wurden so lange expandiert bis eine Vertiefung einer 6 Well-Platte konfluent war. Die Hälfte der Zellen wurde mittels Western Blot-Verfahren auf die Proteinexpression überprüft und positive Klone weiter expandiert. 3. Methoden 44 3.8 siRNA-Transfektion mittels Lipofectamine® 2000 Die siRNA-Transfektion wurde mit der Aussaat der Zellen laut Anleitung des Herstellers durchgeführt. Um Proteine mittels siRNA in HaCaT-Zellen herunter zu regulieren, wurden 120 pmol siRNA (3,5 cm-Schalen), bei SCL-1-Zellen 25 pmol siRNA (12 Well-Platten) verwendet und die Negativregulierung nach 72 h mittels Western Blot-Analyse überprüft. 3.9 Bestimmung der Fähigkeit zur klonalen Expansion mittels des clonogenic assays In eine 10 cm-Schale wurden je 50 000 Zellen ausgesät und am Folgetag stimuliert. Ein Mediumwechsel erfolgte jeden zweiten Tag. Nach einer, zwei und drei Wochen wurden die adhärenten Zellen mit Kristallviolett gefärbt und fotografiert. Im Anschluss wurde das Kristallviolett aus den lebenden Zellen mit einer Kaliumdihydrogenphosphat-Ethanol-Lösung ausgewaschen und dessen Intensität in Triplikaten bei 595 nm im Tecan Reader photometrisch bestimmt. Die Menge an eluiertem Kristallviolett ist dabei proportional zur Menge lebender Zellen. 3.10 Bestimmung der Fähigkeit zum Readhärieren mittels des Replattierungsassays Die 80 % konfluente Zellen wurden stimuliert, nach 24 h deadheriert und identische Zell- zahlen auf 3,5 cm Kulturschalen replattiert. Sowohl vor der Replattierung als auch nach 24, 48 und 72 h wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt. Die Platten wurden fotografiert und anschließend das durch Kaliumdihydrogenphosphat-Ethanol-Lösung ausgewaschene Kristall- violett in Triplikaten bei 595 nm im Tecan Reader photometrisch bestimmt. 3.11 Nachweis von Apoptose mittels des Cell death detection ELISAs Mit Hilfe des Cell death detection ELISAs können nach induziertem Zelltod zytoplasmatische Histon-assoziierte DNA-Fragmente qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden. Der Kit von Roche wurde nach Herstelleranleitung durch-geführt und der Farbumschlag bei 405 nm photometrisch im Tecan Reader bestimmt. 3.12 Bestimmung von TNF im zellfreien Überstand mittels ELISA Die Menge an ins Zellmedium sezerniertem TNF wurde mit Hilfe eines TNF-ELISAs von R&D bestimmt, der nach Herstelleranleitung durchgeführt wurde. Die Absorption bei 450 nm wurde im Tecan Reader bestimmt und die Menge an freigesetztem TNF mit Hilfe der Magellan-Software berechnet. 3. Methoden 45 3.13 Herstellung der Proteinextrakte („hot lysis-Methode“) Nach der Stimulation wurden die nicht adhärenten Zellen im Überstand in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und pelletiert. Die adhärenten Zellen wurden direkt durch Zugabe von heißem 2x Lämmli-Puffer lysiert, wobei sich die Menge nach der Konfluenz der Zellen richtete. Waren die Zellen einer 3,5 cm-Schale 80 % konfluent, wurden 80 µl 2x Lämmli- Puffer verwendet. Die Zellen wurden vereinigt und für 30 min bei 95°C denaturiert. Der Zell- depris wurde durch Zentrifugation für 10 min bei 16 000 x g von den denaturierten löslichen Proteinen getrennt und mittels SDS-PAGE sowie Western Blot-Verfahren analysiert. 3.14 SDS-PAGE, Western Blot-Analyse und Proteindetektion Für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE) wurden entweder Fertiggele verwendet oder verschiedene Trenngele gegossen (Tab. 3.1). Der Vernetzungsgrad des Acrylamids richtete sich jeweils nach der Größe des zu untersuchenden Proteins. Tab. 3.1: Komponenten und Volumina der selbst gegossenen Gele Trenngel [%iges Gel] 7,5 10 12,5 15 Sammelgel Wasser 2,4 ml 2 ml 1,7 ml 1,2 ml Wasser 1,1 ml Acrylamid 1,3 ml 1,7 ml 2 ml 2,5 ml Acrylamid 500 µl 4x Trenngelpuffer 1,3 ml 1,3 ml 1,3 ml 1,3 ml 4x Sammelgelpuffer 330 µl APS 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl APS 10 µl TEMED 3 µl 2 µl 2 µl 2 µl TEMED 2 µl Volumen 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Volumen 2 ml Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei 130 V. Der Transfer auf die Nitrozellulose- Membran mittels Semi-dry-Verfahren erfolgte bei 70 mA pro Gel für 105 min Proteine aus Fertiggelen wurden in 3 min bei 2,5 A und 25 V im Fast blot-Verfahren auf PVDF- Membranen übertragen. Sowohl PDVF- als auch Nitrozellulose-Membranen wurden kurz in 1x TBS gewaschen und durch Zugabe von Milchpulver- oder Blockierlösung (BL) für 1 h blockiert. Danach wurde der primäre Antikörper (Tab. 3.2) über Nacht bei 4°C inkubiert. Tab. 3.2: Konzentrationen, Verdünnungen und Detektion der verwendeten Antikörper (AK) Protein Blockieren der Membran Verdünnung des primären AK Lösen des primären AK Lösen des sekundären AK Detektions- lösung β-Aktin 1:1000 1 % BL 0.5 % BL Detek. Bax 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura Bid 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura Bcl-2 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Detek. Caspase 3 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura Caspase 8 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Detek. Caspase 9 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura Caspase 10 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura 3. Methoden 46 cIAP1 Milchpulver 1:1000 BSA Milchpulver Dura cIAP2 Milchpulver 1:1000 BSA Milchpulver Dura CREB Milchpulver 1:1000 BSA Milchpulver Dura Cytochrome c 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura FLIP 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura GAPDH 1:1000 1 % BL 0.5 % BL Detek. IBα 1 % BL 1:1000 1 % BL 0.5 % BL Detek. Mcl-1 Milchpulver 1:1000 BSA Milchpulver Dura p50 2 % BL 1:500 1 % BL 1 % BL Dura p53 1 % BL 1:500 1 % BL 0.5 % BL Detek. p63 2 % BL 1:250 1 % BL 1 % BL Dura p65 2 % BL 1:500 1 % BL 1 % BL Detek. p73 2 % BL 1:250 1 % BL 2 % BL Dura PARP 1 % BL 1:1000 1 % BL 0.5 % BL Pico Phospho-CREB Milchpulver 1:1000 BSA Milchpulver Dura Phospho-p53 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura Phospho-p65 Milchpulver 1:1000 BSA Milchpulver Dura PP2Ac Milchpulver 1:1000 BSA Milchpulver Dura Smac 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Detek. XIAP 2 % BL 1:1000 1 % BL 1 % BL Dura Nach jeder Antikörperinkubation wurde die Membran dreimal für 5 min mit 1x TBST gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Die sekundären Antikörper wurden 1:3000 (p73 1:10 000) verdünnt und für 1-3 h bei RT inkubiert. Die Detektion der Proteine erfolgte mit unterschiedlichen Lösungen, abhängig von der Stärke des Signals: SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pico); SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate (Dura) oder eine selbst hergestellte Detektionslösung (Detek). Von der Lösung wurden je 600 µl auf die Membran zwischen zwei klaren Folien gegeben. Die Detektion im LAS4000 erfolgte direkt mit der ImageQuant LAS 4000-Software (Einstellung: Chemiluminescence). Für die Detektion mit Hilfe einer Entwicklungsmaschine wurde die Lösung hingegen zunächst für 4 min inkubiert, die abgetupfte Membran in neue Folien gelegt und ein Röntgenfilm exponiert. 3.15 South-Western dot-blot-Analyse Die genomische DNA wurde isoliert und 2 µg in Denaturierungspuffer über ein Vakuum auf eine Nylon + -Membran übertragen mit Neutralisationspuffer behandelt, für 15 min bei 80°C fixiert und danach mit spezifischen Antikörpern inkubiert. 3. Methoden 47 3.16 Co-Immunopräzipitation (Co-IP) Die in 10 cm-Schalen zu 80 % konfluenten Zellen wurden für 2 h stimuliert, trypsiniert und pelletiert. Das Zellpellet wurde in PBS gewaschen und anschließend in 200 µl Lysepuffer für IP für 15 min auf Eis lysiert. Nach Zentrifugation bei 16 000 x g für 15 min bei 4°C wurde die Konzentration der löslichen Proteine mittels Bradford-Bestimmung ermittelt: Die Proben wurden mit einer Standardreihe, die eine definierte Proteinkonzentration von bovinem Serum Albumin (100 µg/µl) aufwies, in seriellen 1:2-Verdünnungen aufgetragen und der Farb- umschlag photometrisch bei 595 nm im Tecan-Reader bestimmt. Die Proteinlösung wurde auf 1 µg/µl eingestellt, 1 ml davon mit 50 µl äquilibrierter Protein-A-Agarose versetzt und 2 h bei 4°C rollend inkubiert. Der durch Zentrifugation bei 16 000 x g für 5 min und 4°C geklärte Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und über Nacht bei 4°C mit dem spezifischen Antikörper (p65-AK: 5 µg; p53-AK: 1:200) rollend inkubiert. Am kommenden Tag wurden 50 µl äquilibrierte Protein-A-Agarose zugegeben und für weitere 2 h bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die gebundenen Proteine mit 30 µl 2x Lämmli Puffer + 10 % β-Mercaptoethanol versetzt und durch starkes Schütteln (1400 rpm) für 10 min bei 95°C mit anschließender Zentrifugation bei 16 000 x g für 5 min von den Präzipitaten gelöst. Parallel wurde ein Aliquot des Ausgangslysats ebenfalls mit 2x Lämmli Puffer versetzt und für 10 min bei 95°C inkubiert um später als „Input-Kontrolle“ zu dienen. 3.17 ChIP und PCR-Analyse Für die die Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurden die Zellen in eine 15 cm- Gewebekulturschale ausgesät, wobei 3 Schalen pro Stimulationspunkt benötigt wurden. Die 60 % konfluenten Zellen wurden, wie in den Versuchen angegeben, stimuliert und 10 ml DMEM/1 % Formaldehyd für 20 min zugegeben. Diese Protein-DNA-Fixierung wurde durch Zugabe von Glycin (Endkonzentration 0.125 M) für 10 min abgestoppt, die fixierten Zellen in PBS gewaschen und mit Hilfe eines Zell-schabers in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt. Nach Zentrifugation für 5 min bei 200 x g und 4°C wurde das Zellpellet in 5 ml Zelllyse- Puffer resuspendiert und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde in 3 ml kaltem Verdünngspuffer aufgenommen und luftblasenfrei in ein Covaris-Röhrchen überführt. Das Scheren der DNA erfolgte im Covaris S2 für 10 min (Programm: 20dc 8i 200cpb fs 600s). Um den Schervorgang zu überprüfen, wurden 50 µl der eingesetzten DNA mit Hilfe des MSB® Spin PCRapace von Stratec aufgereinigt und 1 µg auf ein 2 % (w/v) Agarosegel für 10 min bei 100 V aufgetrennt. Die Proben wurden anschließend bei 13 500 x g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Um unspezifische Wechselwirkungen zu verhindern, wurde der Überstand in 5 ml ChIP-Puffer verdünnt, zu 1 ml gewaschener und verdünnter Sepharose gegeben (400 µl Sepharose pro Probe wurden dreimal in kaltem PBS, einmal in kaltem ChIP-Puffer gewaschen und anschließend in 1 ml ChIP-Puffer auf-genommen) und für 1 h bei 4°C rotierend inkubiert. Nach Zentrifugation für 5 min bei 200 x g und 4°C wurden 90 µl des Überstandes bei -80°C als Input-Kontrollen gelagert und der restliche Überstand in ein 15 ml Falcon überführt, der spezifische Antikörper (p65-AK: 8 µg; Phospho-p53-AK: 1:100) appliziert und über Nacht bei 4°C rotierend inkubiert. 100 µl der rProtein A Sepharose Fast 3. Methoden 48 Flow pro Probe wurden dreimal in kaltem PBS gewaschen und anschließend in 2 ml PBS/2.5 % Gelatine und 0.4 mg Lachssperma-DNA aufgenommen, um unspezifische Interaktionen mit der Sepharose zu unterbinden. Anschließend wurde der Ansatz ebenfalls über Nacht bei 4°C rotierend inkubiert. Am folgenden Tag wurden die rProtein A Sepharose Fast Flow abzentrifugiert, einmal in ChIP-Puffer gewaschen, in je 0.5 ml ChIP-Puffer aufgenommen und zu den ChIP-Proben gegeben. Die Proben wurden für 3 h bei 4°C rotierend inkubiert, in low-DNA-binding-Reaktionsgefäße überführt und diversen Waschritten für je 2 min bei 4°C und Zentrifugation bei 500 x g unterzogen (1x Low-Salt-Puffer, 2x High-Salt-Puffer, 1x LiCl- Puffer und 1x TE-Puffer). Die Antikörper wurden durch zweimalige schüttelnde (1400 rpm) Inkubation mit je 250 µl frisch hergestelltem Elutionspuffer für 15 min bei RT von der rProtein A Sepharose Fast Flow eluiert und in neue low-DNA-binding-Röhrchen überführt. Auf alle Inputproben wurden 500 µl Elutionspuffer gegeben und ab diesem Schritt analog zu den Antikörper-gebundenen Proben behandelt. Um die Quervernetzung der Proteine und der DNA zu lösen, wurde 0.2 M NaCl pro Probe zugegen und über Nacht bei 65°C auf einem Schüttler inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Proteine mittels 40 µg Proteinase K in 30 µl Proteinase K-Puffer für 3 h bei 55°C verdaut. Um die DNA aufzureinigen, wurde eine Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion durchgeführt. Nach Zugabe von 20 µg Glykogen + 500 µl 2-Propanol wurde über Nacht bei -20°C präzipitiert. Die DNA wurde in 24 µl H2O für 15 min bei 40°C resuspendiert und nachfolgend 1:100 verdünnt und stand für die folgende PCR-Analyse zur Verfügung. Bei der quantitativen Analyse kann die Menge an DNA in der Probe mittels SYBR Green-Interkalation quantitativ bestimmt werden. Der Komplex aus DNA und SYBR Green absorbiert blaues Licht bei einer Wellenlänge von 494 nm und emittiert grünes Licht bei 521 nm. Im Anschluss an die PCR wird eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, bei der die DNA über eine kontinuierliche Temperaturerhöhung aufgetrennt wird. Bei diesem Vorgang wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und geht mit der Änderung der Fluoreszenz einher. Die Menge des gebildeten PCR-Produkts kann annähernd über die Höhe des Maximalwertes der Schmelzkurve ermittelt werden. Zu der DNA wurden entweder 2x RedTaq (semi-quantitativen Analyse) oder 2x SYBR Green Mastermix (quantitativen Analyse) und die spezifischen Primer (Endkonzentration je 0,4 µM) gegeben und mit H2O auf ein Volumen von 25 µl aufgefüllt. Die Promotorsequenzen wurden nach folgendem PCR-Protokoll (Tab. 3.3) vervielfältigt: Tab. 3.3: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes nach der Chromatin Immunopräzipitation Vorgang Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklen Initiale Denaturierung 94 10 1 Denaturierung 94 1 44 bei IκBα-Promotor 55 bei TNF-Promotor Primerhybridisierung 57 bei IκBα-Promotor 63 bei TNF-Promotor 1 Elongation 72 1 Finale Elongation 72 10 1 10 µl des PCR-Produkts wurden auf ein 2 % (w/v) Agarosegel, das mit 0,003 % (w/v) Ethidiumbromid versetzt war, aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei 150 V für ungefähr 40 min. 3. Methoden 49 3.18 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA und Plasmid- Präparation Kompetente Escherichia coli (E. coli) TOP 10F´-Zellen wurden mit 100 ng Plasmid für 30 min auf Eis inkubiert, einem Temperaturschock bei 42°C für 2 min ausgesetzt und für 1 min auf Eis abgekühlt. Im Anschluss wurden die transformierten Bakterien bei 37°C in 800 µl LB- Medium (lysogeny broth-Medium) für 1 h bei 300 rpm geschüttelt, auf Ampicillin-haltigen Agarplatten plattiert und über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Einzelne auf den Platten gewachsene Bakterienkolonien wurden gepickt und in 3 ml (Mini-Präparation) oder 100 ml (Midi-Präparation) LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml) über Nacht bei 37°C und 300 rpm schüttelnd inkubiert. Die Plasmidaufreinigung wurde mit dem NucleoBond Xtra Midi Kit der Firma Macherey-Nagel nach Herstelleranleitung durchgeführt. Nach der Aufreinigung im Mini-Format wurde das Pellet in 50 µl H2O, nach Aufreinigung im Midi-Format in 200 µl H2O aufgenommen. 3.19 Klonierung der Caspase 3 Die Ribonukleinsäure (ribonucleic acid; RNA) wurde mit Hilfe des RNeasy Mini-Kits von Qiagen nach Herstelleranleitung isoliert und anschließend mit dem First strand cDNA- Synthesis Kit von Thermo Fisher Scientific nach Herstelleranleitung in cDNA (complementary DNA) umgeschrieben. Bei der folgenden semiquantitativen PCR-Analyse (Tab. 3.4 und 3.5) wurden spezifische Caspase 3-Primer, die zusätzlich die Sequenzen für die Schnittstellen EcoRI und XhoI für die Klonierung beinhalteten, verwendet. Tab. 3.4: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes für die Amplifikation der Caspase 3 und das Anfügen von Restriktionsschnittstellen Substanz Volumen [µl] Endkonzentration 5x Puffer mit MgCl2 cDNA Primer, jeweils dNTP Mix, jeweils High Fidelity DNA-Polymerase H2O 10 10 2 1 1 24 1x 1,5 µg 0,4 µM 0,2 mM 3,5 Unit - Gesamtansatz 50,0 Tab. 3.5: PCR-Programm für die Caspase 3-Amplifikation Vorgang Temperatur [°C] Dauer [sec] Zyklen Initiale Denaturierung 94 120 1 Denaturierung 94 30 35 Primerhybridisierung 56 60 Elongation 68 90 Finale Elongation 68 600 1 Das PCR-Produkts wurde auf ein 1 % (w/v) Agarosegel, das mit 0,003 % (w/v) Ethidium- bromid versetzt war, aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei 150 V für ungefähr 40 min. 3. Methoden 50 Das PCR-Produkt wurde aus dem Gel ausgeschnitten und nach Herstelleranleitung mit dem QIAquick Gel Extraction Kit von Qiagen aufgereinigt. Sowohl das PCR-Produkt (=Insert) als auch der pcDNA3-Vektor wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI für je 2 h bei 37°C gespalten. Nach jeder Spaltung wurde über Nacht gefällt. Die Ligation erfolgte mit der T4-DNA-Ligase über Nacht bei 16°C. Die Hälfte des Ligationsansatzes wurde in E. coli TOP 10F´-Zellen transformiert, diese auf LB-Platten plattiert und im Anschluss die Plasmide aufgereinigt. 3.20 Gerichtete Mutagenese Um gezielt Basenpaare in einem Vektor auszutauschen, wurde der QuikChange Site-directed Mutagenese Kit von Stratagene eingesetzt. In HaCaT-Zellen, die stabil p53 über eine ins Genom integrierte shRNA (small hairpin RNA) herunterregulieren, sollte sowohl wtp53 als auch mutp53 ektopisch exprimiert werden. Um auszuschließen, dass die siRNA nicht die RNA der ektopisch exprimierten p53-Varianten erfasst, wurden über die Mutagenese-Primer stille Mutationen in die p53 Sequenz eingeführt (Tab. 3.6 und 3.7). Tab. 3.6: Zusammensetzung des Mutagenese-Ansatzes zur Einführung von Mutationen in den verwendeten Plasmiden Substanz Volumen [µl] Endkonzentration 10x QuikChange ® Site-directed reaction Buffer dsTemplate-DNA (Plasmid) Mutagenese-Primer, jeweils dNTP Mix, jeweils MgSO4 KOD Hot Start DNA Polymerase H2O 5,0 1,0 2,5 5,0 3,0 1,0 30,0 1x 100 ng 0,5 µM 0,2 mM 1,5 mM 1 Unit - Gesamtansatz 50,0 Tab. 3.7: PCR-Programm für die Mutagenese Vorgang Temperatur [°C] Dauer Zyklen Initiale Denaturierung 95 2 min 1 Denaturierung 95 30 sec 55 Primerhybridisierung 55 1 min Elongation 68 14 min Die PCR-Ansätze wurden anschließend über Säulchen (High Pure PCR Product Purification Kit; Roche) aufgereinigt und der methylierte Parentalstrang selektiv mit DpnI für 2 h bei 37°C verdaut. Nach erneuter Aufreinigung wurden die Plasmide in E. coli TOP 10F´-Zellen amplifiziert. 4. Ergebnisse 51 4. Ergebnisse Die beiden Zelllinien HaCaT und SCL-1 weisen Unterschiede in der Expression des Tumorsuppressors p53 auf. HaCaT-Zellen exprimieren mutp53; SCL-1-Zellen tragen zwar das Wildtyp-Gen (wtp53), das Protein ist jedoch nicht nachzuweisen. Bisher ist bekannt, dass Zellen der spontan transformierten Zelllinie HaCaT sensitiv gegenüber UVB-Bestrahlung sind, während sich SCL-1-Zellen resistent verhalten. Eine Steigerung der UVB-induzierten Apoptose in sensitiven Zelllinien lässt sich durch Kostimulation mit IL-1 erzielen. Der zugrunde liegende Mechanismus konnte in KB-Zellen gezeigt werden: IL-1 aktiviert den Transkriptionsfaktor NFB, der in Kombination mit UVB-Bestrahlung von einem Aktivator in einen Repressor von anti-apoptotischen Genen umgewandelt wird. Zusätzlich bindet er an den TNF-Promotor und ist für die gesteigerte Expression dieses Zytokins verantwortlich. TNF wird sezerniert, aktiviert autokrin den TNFR1 und führt so additiv zu einer Verstärkung des apoptotischen Signals [69;70]. 4.1 Die Wirkung von UVB und UVB+IL-1 auf HaCaT- und SCL-1-Zellen Der direkte Vergleich der Responsivität beider Keratinozytenzelllinien gegenüber UVB und UVB+IL-1 zeigte, dass HaCaT-Zellen bereits 24 h nach der Bestrahlung sensitiv gegenüber UVB-Strahlung waren (Abb. 4.1). Die Apoptose nahm nach 48 und 72 h weiter zu und ließ sich jeweils durch Kostimulation mit IL-1 zusätzlich verstärken, was zeigt, dass der Trans- kriptionsfaktor NFB in diesen Zellen eine pro-apoptotische Rolle einnimmt. SCL-1-Zellen hingegen waren über den beobachteten Zeitraum weitgehend resistent gegenüber UVB- Bestrahlung und es war nicht möglich die Zellen durch Zugabe von IL-1 zu sensitiveren. Abb. 4.1: Die UVB-induzierte Apoptose lässt sich nur in sensitiven HaCaT-Zellen durch Zugabe mit IL-1 steigern. HaCaT- und SCL-1-Zellen wurden entweder mit 30 mJ/cm2 UVB alleine oder kombiniert mit 10 ng/ml IL-1 behandelt. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurde die Apoptose im Cell death detection ELISA bestimmt. 4. Ergebnisse 52 Entsprechend der erzielten Apoptoseraten war auch das Aktivierungsmuster von Caspase 3 (Abb. 4.2). HaCaT-Zellen zeigten bereits nach 24 h eine partielle Spaltung des Enzyms in die p21-Untereinheit. Nach 48 und 72 h war eine vollständige Prozessierung von Caspase 3 in die p21- und p17-Untereinheiten zu detektieren. SCL-1-Zellen zeigten hingegen keine eindeutige, höchstens marginale Prozessierung nach 48 bzw. 72 h. Abb. 4.2: Nur HaCaT-Zellen zeigen nach Bestrahlung mit UVB eine vollständige Prozessierung der Caspase 3. HaCaT- und SCL-1-Zellen wurden mit 30 mJ/cm2 UVB für die angegebenen Zeitpunkte bestrahlt. Der Prozessierungsgrad von Caspase 3 wurde mittels Western-Blot-Analyse an Gesamtzellextrakten nachgewiesen. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. Es wurde deutlich, dass die mutp53-exprimierenden HaCaT-Zellen sensitiv gegenüber UVB- Strahlung waren und die Apoptose durch Zugabe von IL-1 gesteigert werden konnte. SCL-1- Zellen ohne endogenes p53 waren hingegen resistent gegenüber UVB-induzierter Apoptose und ließen sich auch nicht durch Zugabe von IL-1 sensitiveren. Es sollte überprüft werden, ob sich dieser molekulare Unterschied auch langfristig auf das Überleben von UVB-bestrahlten Keratinozyten auswirken kann. 4.2 Langfristig zeigen HaCaT-Zellen keinen verstärkenden apoptotischen Effekt von IL-1 Das Potenzial zur klonalen Expansion der beiden Keratinozytenzelllinien nach Bestrahlung mit UVB alleine oder kombiniert mit IL-1 wurde über insgesamt drei Wochen in einem clonogenic assay beobachtet (Abb. 4.3). HaCaT-Zellen wuchsen nach der Behandlung kaum klonal aus und so waren nur sehr wenige Kolonien auf den Platten erkennbar. Auf Grund der Sensitivität gegenüber UVB induzierte die Mehrzahl der Zellen den apoptotischen Zelltod. Optisch konnte kein Unterschied zwischen der Stimulation mit UVB oder der Kostimulation aus UVB+IL-1 festgestellt werden. Verglichen mit dem Kurzzeitexperiment, scheint die IL-1- vermittelte Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose nur ein temporärer Effekt zu sein, der sich langfristig nicht auf das Überleben der Zellen auswirkt. Der Transkriptionsfaktor NFB übernimmt demzufolge langfristig keine pro-apoptotische Rolle in der Zelle. 4. Ergebnisse 53 Abb. 4.3: HaCaT-Zellen zeigen langfristig keine IL-1-vermittelte Verstärkung der UVB- induzierten Apoptose. HaCaT- und SCL-1-Zellen wurden entweder mit 30 mJ/cm2 UVB alleine oder kombiniert mit 10 ng/ml IL-1 behandelt. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die lebenden, adhärenten Zellen gefärbt und fotografiert. Im Unterschied zu HaCaT-Zellen zeigten SCL-1-Zellen eine starke Expansion und bestätigten damit ihre Resistenz gegenüber UVB-Strahlung. Analog zu den Kurzzeitexperimenten gab es keine verminderte klonale Expansion durch die Kostimulation mit IL-1. Um zu überprüfen, ob es grundsätzlich möglich ist nach UVB-Bestrahlung durch einen zusätzlichen Stressfaktor in SCL-1-Zellen die Apoptose zu induzieren bzw. nachzuweisen, wurde ein Replattierungsassay durchgeführt. 4.3 SCL-1-Zellen sind im Replattierungsassay ebenfalls sensitiv gegenüber UVB-Bestrahlung Einen zusätzlichen Stressfaktor für Zellen stellt die Deadhäsion durch Trypsinierung dar. Nach diesem Vorgang können nur vollständig intakte Zellen readhärieren. Um zu überprüfen, ob SCL-1-Zellen vollkommen schadlos die Behandlung mit UVB oder UVB+IL-1 über- stehen, wurden sie 24 h nach Stimulation trypsiniert, replattiert und die Expansion der Zellen über weitere 72 h im Vergleich zu UVB-sensitiven HaCaT-Zellen dokumentiert (Abb. 4.4). Im untersuchten Zeitraum nach der Replattierung zeigten UVB-behandelte SCL-1-Zellen jedoch ein analoges Expansionsverhalten wie HaCaT-Zellen. Dies belegte eindeutig, dass SCL-1-Zellen ebenfalls auf UVB-Strahlung reagierten, wenn das zelluläre Stresspotenzial eine gewisse Schwelle überschreitet. Im Gegensatz zu HaCaT-Zellen gab es bei SCL-1-Zellen keinen Hinweis auf eine geringere Expansion von UVB+IL-1 stimulierten Zellen, was bestätigte, dass sich SCL-1-Zellen durch Applikation von IL-1 nicht gegenüber UVB- Strahlung sensitivieren ließen. Während die klonale Expansion von HaCaT-Zellen durch 4. Ergebnisse 54 zusätzliche Stimulation mit IL-1 unbeeinflusst blieb, zeigte sich im Replattierungsassay eine deutlich geringere Zelldichte bei UVB+IL-1 behandelten Zellen. Dies lässt sich dadurch erklären, dass 24 h nach Stimulation replattiert wurde, ein Zeitpunkt bei dem durch Ko- stimulation mit IL-1 die UVB-induzierte Apoptose signifikant verstärkt wird (vgl. Abb. 4.1). Abb. 4.4: Im Replattierungsassay zeigen sich auch SCL-1-Zellen sensitiv gegenüber UVB- Bestrahlung. A) HaCaT- und SCL-1-Zellen wurden entweder mit 30 mJ/cm2 UVB oder kombiniert mit 10 ng/ml IL-1 behandelt. Nach 24 h wurden die Zellen durch Trypsinierung deadhäriert und in neuen Zellkulturschalen für 24, 48 und 72 h inkubiert. Sowohl vor dem Replattieren (0 h) als auch danach (24, 48 und 72 h) wurden die adhärenten Zellen gefärbt und fotografiert. B) Die Platten aus (A) wurden entfärbt und der Farbumschlag photometrisch bestimmt. Die präliminären Ergebnisse bestätigen, dass HaCaT-Zellen mit mutp53 sensitiv gegenüber UVB-Bestrahlung sind. Bei SCL-1-Zellen, die kein endogenes p53 exprimieren, muss ein gewisses Stressmaß überschritten werden, um die UVB-induzierte Apoptose zu vermitteln. Da p53 den zentralen Vermittler des apoptotischen Signals in der Zelle darstellt, wäre der Unterschied in der Expression dieses Proteins eine mögliche Ursache für die unterschiedliche Responsivität beider Zelllinien. Neben p53 spielt aber auch das intrazelluläre Gleichgewicht pro- und anti-apoptotischer Proteine eine entscheidende Rolle für die Ausprägung der physiologischen Antwort auf UVB. Aus diesem Grund wurde das basale Expressionsprofil diverser pro- und anti-apoptotischer Proteine in beiden Keratinozytenzelllinien analysiert. 4. Ergebnisse 55 4.4 Die Expression pro- und anti-apoptotischer Schlüsselproteine spricht nicht nur für eine verstärkte UVB-Resistenz von SCL-1-Zellen Ein Vergleich der basalen Expressionsprofile pro- und anti-apoptotischer Schlüsselproteine, sowie der Proteine des kanonischen NFB-Signalwegs von HaCaT- und SCL-1-Zellen zeigte sowohl Resultate, die für eine Resistenz von SCL-1-Zellen sprachen, als auch solche die dagegen sprachen (Abb. 4.5). Für eine verstärkte Resistenz von SCL-1-Zellen gegenüber apoptotischer Stimuli sprachen das Fehlen von p53 und die erhöhte Expression des Caspase- Inhibitors XIAP. Klar gegen eine Apoptoseresistenz sprach hingegen die fehlende Expression des Proto-Onkogens Bcl-2, ein Schüsselprotein für die Instandhaltung mitochondrialer Integrität, sowie die erhöhte Basalexpression der Initiatorcaspasen 8 und 9. Die sehr schwache Expression der Komponenten des kanonischen NFB-Signalweges IB, p50 und p65 könnten ein Grund für die fehlende Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose durch IL-1 sein. Die Basalexpression der anti-apoptotischen Proteine cIAP1, cIAP2, FLIP und Mcl-1, sowie der pro-apoptotischen Proteine Bax, Bid, Cytochrom c, Smac oder der Effektorcaspase 3 war in beiden Zelllinien identisch. Abb. 4.5: Das basale Expressionsmuster pro- und anti-apoptotischer Schlüsselproteine in HaCaT- und SCL-1-Zellen. Von den beiden Zelllinien wurde die Basalexpression pro- und anti- apoptotischer Proteine mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. Die biologisch interessantesten Expressionsunterschiede sind jene der Proteine p53, XIAP und Bcl-2. Eine Revertierung der Expressionsprofile könnte die Responsivität von SCL-1- Zellen gegenüber UVB verändern. Da eine ektopische Expression des anti-apoptotischen Bcl- 2-Proteins die Sensitivität von SCL-1-Zellen nicht verändern würde, wurden lediglich die Profile von p53 und XIAP revertiert, um möglicherweise eine Sensitivierung gegenüber UVB-Bestrahlung zu bewirken und SCL-1-Zellen damit dem Statuts von HaCaT-Zellen anzugleichen. 4. Ergebnisse 56 4.5 P53 und XIAP nehmen keinen Einfluss auf die UVB-Suszeptibilität von SCL-1-Zellen Die transiente Überexpression von wtp53 konnte SCL-1-Zellen nicht gegenüber UVB-Strah- lung sensitivieren (Abb. 4.6). Dies ist ein Hinweis darauf, dass p53 nicht alleine über die Sus- zeptibilität gegenüber UVB bestimmt, sondern andere Faktoren eine wichtige Rolle spielen. Abb. 4.6: Der Tumorsuppressor p53 hat keinen Einfluss auf die UVB-Suszeptibilität von SCL-1- Zellen. A) In SCL-1-Zellen wurde wtp53 transient exprimiert. Nach 24 h wurde die Expression von wtp53 in Proteinextrakten mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente β- Aktin und als Positivkontrolle ein Gesamtzelllysat von HaCaT-Zellen. B) Die Zellen von (A) wurden für 72 h mit 30 mJ/cm2 UVB bestrahlt und die Apoptose mittels des Cell death detection ELISAs bestimmt. Ein guter Kandidat wäre hier der Caspase-Inhibitor XIAP, der die Aktivierung sowohl von Caspase 3 als auch Caspase 9 inhibieren kann. Um die Rolle von XIAP in der Resistenzvermittlung zu untersuchen, wurde XIAP mit einer spezifischen siRNA herunterreguliert und die Responsivität von SCL-1-Zellen gegenüber UVB-Strahlung analysiert. Obwohl die Herunterregulierung von XIAP sehr effizient war, blieben diese Zellen weiterhin resistent gegenüber UVB-induzierter Apoptose (Abb. 4.7). Abb. 4.7: Der Caspase-Inhibitor XIAP nimmt keinen Einfluss auf die UVB-Suszeptibilität in SCL-1-Zellen. A) Das Protein XIAP wurden mit einer spezifischen siRNA in SCL-1-Zellen herunter- reguliert. Als Kontrolle dienten LacZ knock down Zellen. Nach 72 h wurde die Expression von XIAP mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. B) Die Zellen von (A) wurden für 72 h mit 30 mJ/cm2 UVB bestrahlt. Danach wurde die Apoptose mittels des Cell death detection ELISAs bestimmt. 4. Ergebnisse 57 Weder die Veränderung des p53- noch des XIAP-Status konnte eine Sensitivierung von SCL- 1-Zellen gegenüber UVB-Strahlung ermöglichen. Darüber hinaus zeigten sich SCL-1-Zellen auch gegenüber höheren UVB-Dosen und ebenfalls gegenüber rezeptorvermittelter Apoptose resistent [110]. Möglicherweise exprimieren SCL-1-Zellen keine funktionale Effektorcaspase 3 und erweisen sich deshalb so resistent gegenüber diverser apoptotischer Stimuli. 4.6 SCL-1-Zellen exprimieren unveränderte wtCaspase 3 Im Gegensatz zu HaCaT-Zellen wird die Effektorcaspase 3 nach UVB-Strahlung in SCL-1- Zellen nur marginal prozessiert (vgl. Abb. 4.2). Die Sequenzierung ergab jedoch, dass diese Keratinozytenzelllinie funktionale Caspase 3 exprimieren; lediglich eine Base war im Vergleich zur publizierten Sequenz (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004346.3; Stand: 04.12.14) verändert (Abb. 4.8). Beide Triplets, GGA und GGG, kodieren jedoch für die Aminosäure Glycin, sodass es sich hierbei um eine stille Mutation handelt. Die Spaltung von spezifischen Caspase 3-Substraten ist in SCL-1-Zellen also möglich und nicht die Ursache der Resistenz. Abb. 4.8: SCL-1-Zellen weisen eine Veränderung in der Basensequenz der Caspase 3 auf. Die Caspase 3-mRNA von SCL-1-Zellen wurde in cDNA umgeschrieben, in einen Vektor kloniert und sequenziert. Rot: veränderte Base; Grau: Schnittstellen für die Procaspase 3 (hellgrau: ESMD↓S; dunkelgrau: IETD↓S) ([115]; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004346.3; Stand: 04.12.14). Der Mechanismus, der der Resistenz von SCL-1-Zellen gegenüber jeglicher apoptotischer Stimuli zugrunde liegt, könnte sehr zelltypspezifisch sein und nur wenig zur Beantwortung der Frage beitragen, welche Rolle p53 in der Induktion DNA-Schaden vermittelter Apoptose spielt. Aus diesem Grund wurde im Folgenden der umgekehrte Ansatz gewählt, um die Rolle von p53 in der UVB-induzierten Apoptose sowie das Zusammenspiel von p53 und NFκB in der IL-1-vermittelten Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose zu identifizieren. Alle weiteren Untersuchungen wurden daher an modifizierten, UVB-sensitiven HaCaT-Zellen durchgeführt. 4. Ergebnisse 58 4.7 TNF-Sezernierung führt auch in UVB+IL-1 stimulierten HaCaT-Zellen zur Verstärkung der Apoptose Analog zu epithelialen Zellen [69] korrelierte auch in HaCaT-Zellen die Stimulation aus UVB+IL-1 mit einer starken TNF-Freisetzung (Abb. 4.9). Die daraus resultierende Ver- stärkung der Apoptose ließ sich durch eine ausgeprägtere Prozessierung der Effektorcaspase 3, sowie die Spaltung des Caspase 3-Substrates PARP in UVB+IL-1-kostimulierten HaCaT- Zellen nachweisen. Analog konnte eine Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose auch durch exogene Zugabe von rekombinantem TNF erzielt werden. Die Beteiligung des TNFR1 an dem Verstärkungseffekt konnte durch Blockierung des Rezeptors mit einem antagonistischen Antikörper (TNFR1) nachgewiesen werden, dessen Bindung den Effekt inhibierte. Diese Beobachtungen zeigten eindeutig, dass die Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose auch in humanen Keratinozyten einen TNF-abhängigen Prozess darstellt. Abb. 4.9: Die IL-1-vermittelte Verstärkung UVB-induzierter Apoptose geht in HaCaT-Zellen mit vermehrter TNF-Freisetzung einher. A) HaCaT-Zellen wurden für 16 h entweder mit 10 ng/ml IL-1, 100 ng/ml TNF, 30 mJ/cm2 UVB alleine oder einer Kombination aus UVB+IL-1 oder UVB+TNF behandelt oder für 30 Minuten mit einem spezifischen TNFR1-Antagonisten vorbehandelt und die Apoptose im Cell death detection ELISA bestimmt. B) Im Überstand wurde die Menge an sezerniertem TNF im ELISA nachgewiesen. C) Die Prozessierung von Caspase 3 und PARP wurde mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. Auffallend ist, dass die TNF-Sezernierung ausschließlich nach Stimulation mit UVB+IL-1 nachgewiesen werden kann. Der Sezernierung von TNF liegt eine verlängerte und verstärkte Expression der TNF-mRNA zugrunde [111;116]. Ein Faktor, der die Transkription von TNF positiv reguliert, ist NFκB [62], der nach Stimulation mit UVB+IL-1 grundsätzlich eine verlängerte Aufenthaltsdauer im Zellkern und eine verstärkte DNA-Bindung aufweist [116;117]. Bislang konnte jedoch noch nicht gezeigt werden, dass NFκB nach Stimulation mit UVB+IL-1 auch über längere Zeiträume spezifisch an den humanen TNF-Promotor bindet. 4. Ergebnisse 59 4.8 Nach Stimulation mit UVB+IL-1 bindet NFκB verstärkt an den TNF- Promotor Semiquantitative und quantitative PCR-Analysen, die nach einer Chromatin Immunopräzipitation mit einem spezifischen Antikörper gegen p65 durchgeführt wurden, zeigten, dass NFκB nach Stimulation mit UVB+IL-1 verstärkt und für einen längeren Zeitraum an den humanen TNF-Promotor bindet (Abb. 4.10). Abb. 4.10: NFκB bindet nach Stimulation mit UVB+IL-1 verstärkt und verlängert an den TNF- Promotor. HaCaT-Zellen wurden mit 30 mJ/cm2 UVB und 10 ng/ml IL-1 für 30, 60 oder 120 min stimuliert und ChIP mit einem spezifischen -p65-Antikörper durchgeführt. A) Die DNA wurde mittels PCR amplifiziert und semiquantitativ analysiert. B) Die DNA wurde mittels qPCR analysiert. Durch die UVB-Bestrahlung wird NFκB von einem anti- zu einem pro-apoptotischen Faktor und reguliert positiv die TNF-Transkription, wodurch die Apoptose erhöht wird [69]. Um zu untersuchen, ob dieser Effekt ausschließlich NFκB-abhängig ist, wurde dessen Aktivierung in HaCaT-Zellen stabil inhibiert. 4.9 Die TNF-Freisetzung ist nur partiell von NFκB abhängig In HaCaT-Zellen konnte der IκB-Superrepressors (HaCaT-IκB-SR-Zellen) stabil überexprimiert werden (Abb. 4.11). In diesem Superrepressor wurden die beiden Serine 32 und 36 zu Alaninen mutiert. Diese konnten nicht mehr phosphoryliert werden und der Inhibitor nicht mehr proteasomal degradiert werden. Folglich bleibt NFκB inaktiv im Zytoplasma. HaCaT-Zellen ohne intakten NFκB-Signalweg reagierten etwas sensitiver auf UVB-Bestrahlung, weil über diesen Signalweg generell anti-apoptotische Faktoren aufreguliert werden [49;66;118]. HaCaT-IκB-SR-Zellen zeigten einen reduzierten Effekt der IL-1-verstärkten Apoptose, was mit einer verminderten TNF-Sezernierung korrelierte. 4. Ergebnisse 60 Abb. 4.11: NFB wird zur vollständigen Synthese von TNF nach Stimulation mit UVB+IL-1 benötigt. HaCaT-Zellen wurden stabil mit einem IB-Superrepressor (SR) transfiziert. A) Die Expression der IB-Varianten wurde in HaCaT-IB-SR- und HaCaT-mock-Zellen mittels Western- Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. B) Die Zellen aus (A) wurden mit 10 ng/ml IL-1, 30 mJ/cm2 UVB oder mit beiden Stimuli für 16 h behandelt. Die Apoptose wurde im Cell death detection ELISA bestimmt. C) Im Überstand der Zellen aus (B) wurde die Menge an sezerniertem TNF im ELISA nachgewiesen. Die Ergebnisse implizieren, dass NFκB tatsächlich für die Transkription von TNF nach Stimulation von UVB+IL-1 nötig ist. Auffällig ist, dass HaCaT-IκB-SR-Zellen weiterhin, wenn auch reduzierte Mengen, TNF sezernieren und noch eine leichte Erhöhung der Apoptose nach der Kostimulation aufweisen. Dies weist erstmals darauf hin, dass NFκB zwar eine entscheidende Rolle in diesem Prozess spielt, aber dass zusätzlich auch weitere Faktoren beteiligt sein könnten. Da TNF nur nach Kostimulation mit UVB sezerniert wird, soll untersucht werden, ob die UVB-Dosis einen Einfluss auf die sezernierte Menge nimmt. 4.10 Die Menge an sezerniertem TNF korreliert mit dem entstanden DNA- Schaden Der Versuch wurde von PD Dr. Dagmar Kulms durchgeführt und dieser zeigte, dass die Apoptose proportional zur UVB-Dosis und damit zum UVB-induzierten spezifischen DNA- Schaden (CPD-Bildung) ansteigt (Abb. 4.12). Nach Zugabe von IL-1 ließen sich die individuellen, dosisspezifischen apoptotischen Antworten jeweils um einen ähnlichen Betrag erhöhen. Die sezernierte Menge an TNF nahm dabei mit zunehmender UVB-Dosis, aber gleichbleibender IL-1-Konzentration, konstant zu. 4. Ergebnisse 61 Abb. 4.12: Die IL-1-vermittelte Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose und die TNF- Freisetzung korreliert mit dem entstanden DNA-Schaden. A) Die Zellen wurden entweder nur mit unterschiedlichen Dosen UVB (5-40 mJ/cm2) bestrahlt oder kombiniert mit 10 ng/ml IL-1 für 16 h behandelt. Die Apoptose wurde im Cell death detection ELISA und B) die Menge an sezerniertem TNF im ELISA bestimmt. C) Die nach Bestrahlung mit UVB (5-40 mJ/cm 2 ) entstandenen DNA- Schäden, Cyclobutan Pyrimidin-Dimere (CPD), wurden mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers nachgewiesen. Als Ladekontrolle diente Adenosin. Diese Ergebnisse implizieren eine Abhängigkeit der TNF-Freisetzung von der Höhe der UVB-Dosis bzw. des UVB-induzierten DNA-Schadens. Da NFκB nicht allein für die TNF- Sezernierung verantwortlich ist, ist möglicherweise ein Faktor der nach DNA-Schaden aktiviert wird, ebenfalls an diesem Prozess beteiligt. Ein möglicher Kandidat stellt der Tumorsuppressor p53 dar, da dieser Transkriptionsfaktor ebenfalls dosisabhängig nach DNA- Schaden-Induktion aktiviert wird. Neben p53 gehören p63 und p73 zur p53-Familie. Diese wären potenziell in der Lage den Verlust von p53 zu kompensieren [81;82]. Da p53 mit einer shRNA herunterreguliert werden sollte, sollte zunächst überprüft werden, ob die Protein- mengen von p63 oder p73 kompensatorisch steigen, die shRNA spezifisch gegen p53 ist und ob p63 einen Einfluss auf die UVB-induzierte Apoptose nimmt. 4. Ergebnisse 62 4.11 Der p63-Level bleibt durch den p53-Status unbeeinflusst Der p53-Verlust hatte keine Auswirkung auf die Basalexpression von p63 oder p73 (Abb. 4.13). Im Einklang mit publizierten Daten [119] wurde p63 durch UVB-Einfluss herunter- reguliert, sodass es nach 16 h nicht mehr nachweisbar war. Die Kinetik blieb vom p53-Status der HaCaT-Zellen gänzlich unbeeinflusst, was verdeutlicht, dass die eingesetzte shRNA spezifisch gegen p53 ist (HaCaT-p53i-Zellen) und dass der zelluläre p63-Status nach UVB- Bestrahlung nicht p53-abhängig ist. P63 wird also die durch den p53-Verlust zu doku- mentierenden Effekte nicht kompensatorisch beeinflussen, sodass sich HaCaT-p53i-Zellen für die Untersuchung der p53-NFκB-Interaktion hervorragend eignen. Abb. 4.13: Nach UVB-Bestrahlung wird der p63-Level nicht durch den p53-Status beeinflusst. A) In HaCaT-mock- und HaCaT-p53i-Zellen wurde der Expressionsstatus von p53, p63 und p73 mittels Western-Blot-Analyse bestimmt. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. B) HaCaT-mock- und HaCaT-p53i-Zellen wurden mit 30 mJ/cm2 UVB für die angegebenen Zeitpunkte bestrahlt und die Expression von p53 und p63 mittels Western-Blot-Analyse bestimmt. Als Ladekontrolle diente GAPDH. 4.12 P53 unterstützt die Synthese von TNF Um die Rolle des Transkriptionsfaktors p53 sowohl in UVB-induzierter Apoptose, als auch in der Erhöhung der Apoptose durch Stimulation mit UVB+IL-1 und der damit einhergehenden TNF-Sezernierung zu untersuchen, wurden stabile Klone generiert, die über die stabile Expression einer shRNA endogenes mutp53 in HaCaT-Zellen herunterregulierten (HaCaT- p53i). Drei unabhängige HaCaT-p53i-Klone wiesen nach Bestrahlung mit UVB eine deutlich erhöhte Apoptose auf (Abb. 4.14), was bestätigte, dass HaCaT-Zellen mutp53 exprimieren, das einen GOF-ähnlichen Phänotypen aufweist. Für alle weiteren Versuche wurde Klon 2 verwendet. Des Weiteren sezernierten HaCaT-p53i-Zellen signifikant weniger TNF als HaCaT-mock-Zellen, was die Vermutung, dass p53 an der TNF-Synthese beteiligt sein könnte, bestärkte. Bei beiden Zelltypen ließ sich die Apoptose nach Stimulation mit UVB und IL-1 steigern, jedoch war der Effekt bei HaCaT-mock-Zellen größer. 4. Ergebnisse 63 Abb. 4.14: Die Herunterregulierung von p53 sensitiviert HaCaT-Zellen gegenüber UVB- Strahlung. A) Drei stabile HaCaT-p53i-Klone und HaCaT-mock-Zellen wurden für 16 h mit 30 mJ/cm2 UVB bestrahlt und die Apoptose im Cell death detection ELISA bestimmt. B) In Gesamt- zelllysaten der Zellen aus (A) wurde die p53-Expression mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. C) HaCaT-p53i Klon 2- und HaCaT-mock-Zellen wurden mit 10 ng/ml IL-1, 30 mJ/cm2 UVB oder mit beiden Stimuli für 16 h behandelt und die Menge an sezerniertem TNF im ELISA nachgewiesen. D) Analog wurde die Apoptose im Cell death detection ELISA bestimmt. Die bisherigen Ergebnisse implizieren, dass sowohl NFκB als auch p53 an der vollständigen TNF-Produktion beteiligt zu sein scheinen. Sollten beide Faktoren additiv zusammenarbeiten, würde eine kombinierte Inhibition von NFκB und p53 zum vollständigen Stillstand der TNF- Synthese führen. 4.13 NFκB und p53 werden in HaCaT-Zellen zur vollständigen Synthese von TNF benötigt Um zu ergründen welche Zusammenhänge zwischen NFκB und p53 bestehen und ob diese Signalweg beide zur TNF-Synthese benötigt werden, wurden HaCaT-p53i-Zellen zusätzlich stabil mit dem IκBα-SR-Plasmid transfiziert und so die HaCaT-p53i/IκB-SR Doppelmutanten generiert. Der Vergleich von UVB-induzierter Apoptose und der TNF- Freisetzung zwischen den Zellen (HaCaT-mock, HaCaT-p53i, HaCaT-IκB-SR, HaCaT- p53i/IκB-SR) zeigte eindeutig, dass die Höhe der UVB-induzierten Apoptose in erster Linie vom p53-Status der Zelle abhängt, die Verstärkung der Apoptose durch IL-1 aber sowohl von NFκB als auch von p53 gesteuert wird (Abb. 4.15). Nur in der Doppelmutante konnte sowohl die TNF-Freisetzung als auch die gesteigerte Apoptose minimiert werden. 4. Ergebnisse 64 Abb. 4.15: NFB und p53 werden in HaCaT-Zellen zur vollständigen Sezernierung von TNF benötigt. A) In stabilen HaCaT-mock-, HaCaT-p53i-, HaCaT-IB-SR- und HaCaT-p53i/IB-SR- Zellen wurde mittels Western-Blot-Analyse die Expression von p53 und den IB-Varianten determiniert. Als Ladekontrolle diente β-Aktin. B) Die Zellen aus (A) wurden mit 10 ng/ml IL-1, 30 mJ/cm2 UVB oder mit beiden Stimuli für 16 h behandelt. Die Apoptose wurde im Cell death detection ELISA bestimmt. C) Analog wurde im Überstand die Menge an sezerniertem TNF im ELISA bestimmt. HaCaT-Zellen besitzen auf den beiden Allelen zwei unterschiedliche UV-typische C → T Transitionen in p53 [112]. Diese Zelllinie reagierte ohne endogenes mutp53 sensitiver auf UVB-Strahlung (vgl. Abb. 4.14), was darauf schließen lässt, dass sie mutp53 mit einem GOF- ähnlichen Phänotypen exprimiert. Es sollte untersucht werden, ob neben mutp53 auch wtp53 kooperativ mit NFκB auf die TNF-Sezernierung nimmt. Da die beiden GOF-Mutationen in p53, mutp53R175H und mutp53R248W, häufig vorzufinden sind, wurden diese für die Ver- suche gewählt. 4.14 Nur mutp53 verstärkt die NFκB-abhängige TNF-Synthese Sowohl wtp53 als auch mutp53R175H und mutp53R248W wurden transient in HaCaT-p53i- Zellen exprimiert (Abb. 4.16). HaCaT-p53i-wtp53-Zellen zeigten die gleiche Sensitivität gegenüber UVB-Strahlung wie Zellen ohne p53. Auch war der verstärkende apoptotische Effekt von IL-1 in diesen Zellen sehr ähnlich. Der Effekt war zwar vorhanden, jedoch nicht sonderlich stark ausgeprägt, was nahelegt, dass wtp53 keinen Einfluss nimmt. HaCaT-Zellen, die die p53 GOF-Mutanten exprimierten, waren hingegen resistenter gegenüber UVB- induzierter Apoptose. Interessanterweise war der IL-1-Effekt bei diesen Zellen am deutlichsten ausgeprägt. Die sezernierte TNF-Menge korrelierte nahezu perfekt mit den beobachteten IL-1-Effekten: HaCaT-p53i- und HaCaT-p53i-wtp53-Zellen sezernierten die geringsten Mengen TNF. HaCaT-Zellen mit mutp53 sezernierten deutlich mehr TNF. Auf die nachweisbare TNF-Menge nahm folglich wtp53, im Gegensatz zu mutp53, keinen Einfluss. 4. Ergebnisse 65 Abb. 4.16: Nur mutp53 nimmt einen positiven Einfluss auf die Produktion von TNF. A) In HaCaT-p53i-Zellen wurde die Expression von wtp53, mutp53R175H und mutp53R248W mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente GAPDH. B) HaCaT-mock-, -p53i-, -p53i-wtp53-, -p53i-mutp53R175H- und -p53i-mutp53R248W-Zellen wurden mit 10 ng/ml IL-1, 30 mJ/cm2 UVB oder mit beiden Stimuli für 16 h behandelt und die Apoptose im Cell death detection ELISA bestimmt. C) Analog wurde im Überstand die Menge an sezerniertem TNF im ELISA bestimmt. Diese Ergebnisse legten nahe, dass neben NFκB nur mutp53 einen positiven Einfluss auf die TNF-Freisetzung und den verstärkenden apoptotischen Effekt von IL-1 nimmt. Wtp53 nahm auf beide zellulären Prozesse keinen Einfluss. Von NFκB ist bekannt, dass er an mehreren Stellen an den TNF-Promotor binden kann [62] und auch in HaCaT-Zellen nach Behandlung mit UVB+IL-1 an diesen verstärkt bindet (vgl. Abb. 4.10). Eine Bindungsstelle für p53 wurde bisher im TNF-Promotor nicht beschrieben, jedoch ist eine halbe, putative Bindestelle für diesen Transkriptionsfaktor in der Sequenz dieses Promotors zu finden (Abb. 4.17). Abb. 4.17: Im humanen TNF-Promotor ist eine halbe, putative p53-Bindestelle zu finden. Die Sequenz des humanen TNF-Promotors ist dargestellt. In rot hervorgehoben ist eine putative, halbe Bindesequenz für p53: PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy (Pu=Purin; A=Adenin; T=Thymin und Py=Pyrimidin) [90] (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L11698.1; Stand: 15.10.2014). 4. Ergebnisse 66 Um zu untersuchen, ob es zwischen wtp53 und mutp53 verschiedene Bindungsaffinitäten an den TNF-Promotor gibt, wurden ChIP-Analysen mit den unterschiedlichen p53-Varianten durchgeführt. 4.15 Nur mutp53 bindet verstärkt an den TNF-Promotor Nach Stimulation mit UVB+IL-1 konnten alle p53-Varianten am humanen TNF-Promotor nachgewiesen werden (Abb. 4.18). Allerdings band mutp53, sowohl das endogene (GOF- ähnlich), als auch die ektopisch exprimierten mutp53R175H und mutp53R248W Varianten mit einer deutlich höheren Affinität als wtp53. Diese verschiedenen Bindungsaffinitäten korrelieren mit der sezernierten TNF-Menge (vgl. Abb. 4.16), auf die nur mutp53 einen Einfluss nahm. Neben NFκB bindet folglich nur mutp53 verstärkt an den TNF-Promotor und beiden können einen positiven Einfluss auf die TNF-Transkription nehmen. Abb. 4.18: An den TNF-Promotor bindet verstärkt nur mutp53. A) In HaCaT-p53i-Zellen wurde die Expression von wtp53, mutp53R175H und mutp53R248W mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente GAPDH. B) HaCaT-mock-, -p53i-, -p53i-wtp53-, -p53i- mutp53R175H- und -p53i-mutp53R248W-Zellen wurden mit 30 mJ/cm2 UVB und 10 ng/ml IL-1 für die angegeben Zeitpunkte stimuliert und ChIP mit einem spezifischen -p53-Antikörper durchgeführt. B) Die DNA wurde mittels PCR amplifiziert und semiquantitativ analysiert. C) Die DNA wurde mittels qPCR analysiert. Mutp53 kann mit p65, einer Untereinheit von NFκB, an der DNA einen transkriptionellen Komplex bilden [120]. Es sollte untersuchen werden, ob es sich bei der Kooperation von NFκB und p53 am TNF-Promotor um eine indirekte oder direkte Interaktion beider Transkriptionsfaktoren handelte. 4. Ergebnisse 67 4.16 Zwischen p53 und NFκB liegt keine direkte Protein-Protein- Interaktion vor Es war nicht möglich p53 und NFκB gemeinsam aus Lysaten von HaCaT-Zellen zu immunpräzipitieren (Abb. 4.19). Die beiden Transkriptionsfaktoren interagierten weder in unstimulierten noch durch den Einfluss von UVB+IL-1 durch direkte Protein-Protein- Wechselwirkungen miteinander. Dennoch scheinen sie unabhängig voneinander an den TNF- Promotor zu binden und dort additiv auf die erhöhte TNF-Expression und schließlich auch auf die Sekretion zu nehmen. Dabei ist eindeutig mutp53 eindeutig stärker involviert, während wtp53 nahezu effektfrei bleibt (vgl. Abb. 4.16). Abb. 4.19: Die Transkriptionsfaktoren p53 und NFB bilden keine direkte Protein-Protein- Interaktion. A) HaCaT-Zellen wurden für 2 h mit 30 mJ/cm2 UVB und 10 ng/ml IL-1 stimuliert. Eine Co-IP mit einem -p53-Antikörper wurde durchgeführt und die Lysate mittels Western-Blot-Analyse auf p53 und p65 analysiert. B) Analog zu (A), jedoch mit einem -p65-Antikörper, durchgeführt. Ein weiteres Promotorelement, das für die vollständige Transkription von TNF wichtig ist, ist CREB (cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein) [121;122]. Transkriptionsfaktoren werden nach bestimmten, spezifischen Signalen aktiviert, was häufig durch Phosphorylierungen gekennzeichnet ist. Obwohl zwischen NFκB und p53 keine direkte Protein-Protein-Wechselwirkung stattfindet, müssen sie, wie auch CREB, nach der Stimulation in ihrer aktivierten, phosphorylierten Form vorliegen, um die TNF-Transkription positiv zu beeinflussen. 4.17 Die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NFκB, p53 und CREB erfolgt nach unterschiedlichen Stimuli Die Aktivierung der drei Transkriptionsfaktoren NFκB, p53 und CREB wurde anhand aktivierender Phosphorylierungen an spezifischen Serinen überprüft (Abb. 4.20): Die Aktivierung von p65 geht mit einer Phosphorylierung des Serin 536 einher [123], beim Tumorsuppressor p53 mit der an Serin 15 [124] und bei CREB an Serin 133 [125]. Stimulation mit IL-1 führte zu einer transienten Phosphorylierung von p65, die nach 2 h beendet war. Zu diesem Zeitpunkt war auch IκB, der Inhibitor von NFκB wieder nachzuweisen. Die Phosphorylierung von CREB war über den gleichen Zeitraum nachzuweisen, was andeutet, dass die beiden Faktoren für die IL-1-abhängige Transkription benötigt werden. Keine Modifikation war hingegen bei p53 vorhanden. Nach UVB- 4. Ergebnisse 68 Bestrahlung konnte keine Phosphorylierung von p65 nachgewiesen werden, jedoch waren sowohl CREB als auch p53 für mindestens 4 Stunden an den spezifischen Serin phosphoryliert, was darauf schließen lässt, dass CREB auch ein wichtiger Kofaktor für p53 darstellt. Stimulation von UVB+IL-1 führte zu einer langen Phosphorylierung aller drei Komponenten. Bei CREB und p53 konnte kein Unterschied zwischen Bestrahlung mit UVB allein oder in Kombination mit IL-1 festgestellt werden, bei p65 allerdings schon. Dies deutet an, dass nur nach Stimulation mit UVB+IL-1 alle drei Transkriptionsfaktoren lange genug aktiv sind und so für eine vermehrte TNF-Transkription vorhanden sind. Auch die Degra- dierung von IκB war nur bei dieser Stimulation über einen langen Zeitraum gewährleistet. Die Phosphorylierung und somit die Aktivierung von p65 und CREB waren in HaCaT-p53i- Zellen nahezu identisch. Einen leichten Unterschied zu HaCaT-mock-Zellen konnte lediglich in der Degradierung von IκB nach Stimulation mit UVB+IL-1 festgestellt werden. In HaCaT-p53i-Zellen erfolgte die Resynthese nach 2 h und nicht nach 4 h wie bei HaCaT- mock-Zellen. P53 beeinflusst somit nicht die Aktivierung von p65 und die beiden Transkriptionsfaktoren können unabhängig, aber additiv die TNF-Transkription beeinflussen. Die zellulären Mengen der nicht phosphorylierten Proteine waren während den Stimulationen unverändert, was andeutet, dass diese Proteine nach den Stimulationen nicht vermehrt synthetisiert wurden und nur posttranslationale Modifikationen stattfanden. Abb. 4.20: Nur durch Stimulation mit UVB und IL-1 werden NFκB, p53 und CREB über einen langen Zeitraum aktiviert. A) HaCaT-mock-Zellen wurden mit 10 ng/ml IL-1, 30 mJ/cm2 UVB oder mit beiden Stimuli für die angegebenen Zeitpunkte stimuliert. Die Expression von IB, pSer536-p65, p65, pSer15-p53, p53, pSer133-CREB und CREB mittels Western-Blot-Analyse determiniert. Als Ladekontrolle diente GAPDH. B) Analog zu (A), jedoch mit HaCaT-p53i-Zellen durchgeführt. 4. Ergebnisse 69 IL-1 aktiviert die Kinase IKK2, die letztendlich für die proteasomale Degradierung von IκB und der Translokation von NFκB in den Nukleus verantwortlich ist. NFκB initiiert anschließend die Transkription des eigenen Inhibitors und reguliert sich somit selbst in einem negativen Rückkopplungsmechanismus. Die Phosphatase PP2A beeinflusst die Phosphory- lierungsdauer von IKK2 und somit deren Aktivierung. Durch die Dephosphorylierung ist die Kinase nicht mehr aktiv und phosphoryliert nicht weiter IκB. So ist NFκB nach alleiniger Stimulation mit IL-1 nicht lange aktiv und kann nur kurz die Transkription von TNF beeinflussen. Zusätzliche UVB-Strahlung inhibiert die katalytische Untereinheit PP2Ac, sodass IKK2 chronisch aktiviert bleibt [69]. NFκB wird nicht mehr durch den negativen Rückkopplungsmechanismus reguliert, wodurch sich die nukleäre Aufenthaltsdauer signifikant verlängert und so die Voraussetzung für eine verstärkte Transkription von TNF bietet. Nach UVB+IL-1-Behandlung ist p65 deutlich länger phosphoryliert. Möglicherweise kommt dies durch die inhibierte Phosphatase PP2A zustande und sollte untersucht werden. 4.18 Das Phosphorylierungsmuster von p65 und CREB ist PP2A-abhängig PP2A wurde mittels einer spezifischen siRNA und Calyculin A, einem chemischen Inhibitor, inhibiert. Die Serin 15-Phosphorylierung von p53 wurde durch diese Inhibierung nicht beeinflusst (Abb. 4.21). Der Tumorsuppressor stellt in HaCaT-Zellen also kein zelluläres für PP2A dar. Eine kontinuierliche Phosphorylierung von p65 an Serin 536 war bei Zellen mit inhibierter Phosphatase nachzuweisen. Eine ähnliche Veränderung konnte im Phosphorylierungsmuster von CREB an Serin 133 beobachtet werden. Bei beiden Transkriptionsfaktoren konnte dies selbst in unstimulierten Zellen nachgewiesen werden, woraus geschlussfolgert werden kann, dass PP2A sowohl CREB als auch p65 negativ reguliert. Dies geschieht nicht nur nach Stimulation mit UVB+IL-1, sodass die Aktivität der Proteine unter der ständigen Kontrolle dieser Phosphatase steht. Abb. 4.21: CREB und p65 werden von PP2A negativ reguliert. PP2Ac wurden mit einer spezifischen siRNA in HaCaT-Zellen herunterreguliert und nach 72 h wurden 5 µM Calyculin A zu den Zellen gegeben. Nach 30 min wurden die Zellen mit 10 ng/ml IL-1, 30 mJ/cm2 UVB oder beiden Stimuli für 2 h stimuliert. An einem Gesamtzelllysat wurde die Expression von PP2Ac, pSer15-p53, p53, pSer536-p65, p65, pSer133-CREB und CREB mittels Western-Blot-Analyse determiniert. 4. Ergebnisse 70 Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass neben NFκB auch mutp53 nach Stimulation an den humanen TNF-Promotor bindet und für eine gesteigerte TNF-Synthese notwendig ist. Diese beiden initialen anti-apoptotischen Faktoren können also zusammen eine pro- apoptotische Rolle übernehmen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass PP2A neben der Dephosphorylierung von IKK2 eine weitere essentielle Rolle auf die Transkription von TNF nimmt: Die Phosphatase dephosphoryliert sowohl p65 als auch CREB. Durch die Bestrahlung mit UVB und der Inhibierung der Phosphatase bleiben beide Transkriptionsfaktoren länger aktiv und nehmen neben mutp53 einen positiven Einfluss auf die TNF-Synthese. 5. Diskussion 71 5. Diskussion Die Dysregulierung von NFB und p53 spielt bei der Tumorentwicklung und der Vermittlung von Therapieresistenzen eine entscheidende Rolle [126]. Als Wächter des Genoms schützt p53 den Körper vor entarteten Zellen durch die Induktion von Apoptose. NFB ist der zelluläre Gegenspieler und hat vor allem pro-proliferative, pro-inflammatorische und anti- apoptotische Funktionen in der Zelle. Allerdings nimmt NFB bei der Krebsentstehung eine zweischneidige Rolle ein: Einerseits führt die Aktivierung zur Immunabwehr, wodurch transformierte Zellen erkannt und eliminiert werden können. Andererseits ist NFB in sehr vielen Tumorformen, wie z. B. dem Malignen Melanom [127], konstitutiv aktiv und kann viele tumorfördernde Funktionen übernehmen [118;128]. Die Inhibierung des NFB- Signalwegs stellt somit ein attraktives Ziel für eine Tumorbehandlung dar. Diese Behandlungsansätze reichen von Molekülen, die den IKK-Komplex inhibieren [126], Proteasominhibitoren wie Bortezomib [129] oder kombinierten Ansätzen aus Bortezomib und einem chemotherapeutischen Wirkstoff wie Temozolomid [130;131]. Allerdings sind diese Behandlungen alleine nicht ausreichend, um Tumoren selektiv zu behandeln. Auch wurden viele Nebenwirkungen beobachtet und sie stellten sich im Patienten als nicht sehr effektiv heraus. Um den Körper vor Hautkrebs zu schützen, können geschädigte Keratinozyten über unter- schiedliche Signalwege die Apoptose initiieren. Für die Induktion von Apoptose infolge eines erhöhten DNA-Schadens nach UVB-Strahlung stellt die Aktivierung des Tumorsuppressors p53 ein Schlüsselereignis dar, über welches transkriptionsabhängig und –unabhängig der programmierte Zelltod eingeleitet wird [87;95;132]. Gleichzeitig stellt UVB ein Mutagen dar, das in der Lage ist genau diesen Tumorsuppressor genetisch zu verändern. Durch Induktion von C → T Transitionen verändert sich die Wirkungsweise von p53 [9;133]. Wtp53 kann pro- apoptotische Faktoren aufregulieren bzw. aktivieren und die Apoptose einleiten [39]. Viele tumorassozierten mutp53 Proteine verlieren nicht nur die Tumorsuppressor wtp53-Funktion, sondern gewinnen neue, onkogene Funktionen, die gegenteilig zu wtp53 sind. Dazu gehören anti-apoptotische und pro-proliferative Funktionen wie die Metastasierung und Veränderungen im Metabolismus. Solche mutp53 Proteine werden als gain-of-function (GOF) Proteine bezeichnet [107;134]. Entartete Keratinozyten sind somit nicht nur aufgrund konstitutivem NFB, sondern auch durch die Expression von mutp53 effektiv vor Apoptose geschützt. Im Durchschnitt ist p53 in 50 % aller humanen Tumoren mutiert, was seine wichtige Rolle als Tumorsuppressor verdeutlicht [17;107]. Mit 95 % ist die p53-Mutationsrate in Tumoren, die dem weißen Hautkrebs zuzuordnen sind, sogar weitaus höher. Der Grund für die Häufung stellt die mutagene UV-Strahlung dar, der die Haut als einziges Organ ausgesetzt ist [108]. Zu welchem Zeitpunkt der Tumorprogression die p53-Mutationen auftreten, hängt von der jeweiligen Krebsform ab. Beim Dickdarmkrebs finden sie beispielsweise in einem späten Progressionsstadium statt [135]. Im Unterschied dazu scheint der Verlust der wtp53-Funktion eines der initialen Ergebnisse der Photokarzinogenese zu sein. Dabei können häufige p53- Mutationen sowohl in normal erscheinender sonnenexponierter Haut, als auch in prämalignen aktinischen Keratosen beobachtet werden. Wiederholte UV-Exposition kann zur klonalen 5. Diskussion 72 Expansion von Keratinozyten, die mutp53 tragen, führen und so zur Förderung von Hautkrebs beitragen [108;133;136-139]. Letztendlich können die Zellen, die p53-Mutationen tragen, unkontrolliert proliferieren und auch in das umliegende Gewebe invadieren [138;139]. Die Strahlung induziert zusätzlich in den umliegenden Zellen die Apoptose [140] und ist ein Tumorpromotor, der das Zellwachstum durch die Stimulation der Produktion von diversen Wachstumsfaktoren und Zytokinen anregt. Wiederholte Exposition der Haut gegenüber UV- Strahlung regt somit die klonale Expansion von Zellen mit mutp53 über zwei Mechanismen an: ihrer Resistenz gegenüber UV-induzierter Apoptose und der Vorteil hinsichtlich der Proliferation gegenüber normalen Keratinozyten als Reaktion auf UV-Strahlung [141]. Die Frage weshalb UVB-Strahlung in der Haut zwei solch gegensätzliche zelluläre Prozesse wie die Induktion der Apoptose und das Erzeugen von anti-apoptotischen mutp53 induziert, konnte bislang nicht eindeutig geklärt werden. Die spontan transformierten HaCaT-Zellen weisen auf beiden Allelen verschiedene Mutationen im p53-Gen auf. Diese Mutationen sind UV-typisch und führen zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz in Exon 5 und Exon 8 [112]. Ob diese Mutationen die Eigenschaften von p53 beeinflussen, wird kontrovers diskutiert. Dass sie einen Einfluss, zumindest auf einige zelluläre Funktionen nehmen, lässt sich an Hand der Literatur nachweisen. So initiiert normalerweise p53 nach DNA-Schaden die Transkription von p21, das für einen Zellzyklusarrest wichtig ist. HaCaT-Zellen mit mutp53 sind interessanterweise nicht in der Lage p21 aufzuregulieren, was andeutet, dass diese p53-Varianten nicht wie wtp53 agieren [142]. Auch zeigten HaCaT-p53i-Zellen eine Veränderung in der Sensitivität gegenüber UVB-Strahlung. Diese Zellen reagierten sensitiver gegenüber UVB-Bestrahlung als Zellen, die mutp53 exprimieren, das anti-apoptotische Funktionen übernehmen kann. Dies impliziert, dass HaCaT-Zellen einen p53 GOF-ähnlichen Phänotypen aufweisen. Außerdem war p53 in unstimulierten Zellen nachzuweisen, was andeutet, dass der negative Rückkopplungsmechanismus in diesen Zellen reduziert ist und die These, dass diese Zellen p53 mit einem GOF-ähnlichen Phänotypen exprimieren, weiter stützt [107;134]. Die meisten Veränderungen in p53 finden in der DNA-bindenden Domäne statt, wobei sechs Aminosäurereste identifiziert wurden, die am häufigsten mutiert sind. Dazu gehören unter anderem Arginin 175 (R175) und R248 [107;143]. Die Mutationen lassen sich in zwei Gruppen einteilen: die Kontakt- (z. B. R248W) und die Konformationsmutanten (z. B. R175H). Beide Gruppen können eine alternative Reihe von Genen regulieren und so ihre anti- apoptotischen Funktionen ausüben [134]. Unter den drei Formen des Hautkrebses ist nur die Mutation des Arginin an Position 248 weit verbreitet [133]. Die protektiven Funktionen von p53R175H und p53R248W gegenüber UVB-induzierter Apoptose konnte auch in HaCaT- Zellen beobachtet werden. Ein Vergleich der beiden Keratinozytenzelllinien HaCaT und SCL-1, die sich in der p53- Expression unterscheiden, legte deutliche Unterschiede in der Responsivität gegenüber UVB- Strahlung offen. HaCaT-Zellen mit einem p53 GOF-ähnlichen Phänotyp waren sensitiv gegenüber UVB-induzierter Apoptose, während SCL-1-Zellen, die das Protein nicht exprimieren, sich als resistent erwiesen. Diese Eigenschaften ließen sich nicht nur über einige Tage beobachten. Auch nach mehreren Wochen konnte keine Sensitivität der SCL-1-Zellen 5. Diskussion 73 gegenüber UVB nachgewiesen werden. Die Resistenz dieser Zellen rührt nicht durch eine grundsätzlich defekte Apoptosemaschinerie her, da sie zumindest eine funktionale Caspase 3 besitzen, die auch partiell aktiviert werden konnte. Durch ektoptische Expression von wtp53 war es nicht möglich SCL-1-Zellen zu sensitivieren, was zeigt, dass es neben p53 noch andere Sensoren/Mediatoren für die Induktion der UVB-vermittelten Apoptose verantwortlich sein müssen. Dieses Ergebnis steht zunächst in einem Gegensatz zu den Erkenntnissen aus der Literatur, die wtp53 grundsätzlich als den Hauptvermittler UVB-induzierter Apoptose anerkennt [79;80;87]. Jedoch führt auch die Re-Expression von wtp53 in Tumorzellen nicht immer zu einer erhöhten Apoptose. So konnte wtp53 in einer murinen Brustkrebszelllinie die Proliferation reduzieren, nicht aber den malignen Phänotypen oder die Chemoresistenz beeinflussen [144]. Auch in einer humanen Lungenkrebszellline war es nicht möglich die Zellen durch p53 Re-Expression gegenüber ionisierender Strahlung, Cisplatin oder Mitomycin C zu sensitivieren [145]. In diesen beiden Beispielen wurden allerdings Zellen verwendet, die neben dem pro-apoptotischen wtp53 noch endogenes mutp53 exprimierten. Das mutierte Protein übte vermutlich einen dominant negativen Effekt aus. Der genaue Einfluss des mutp53 auf die Funktionen des Wildtyp-Proteins und auf die Höhe der induzierbaren Apoptose blieb in beiden Fällen ungeklärt. Einen geeigneteren Ansatz stellt die Reaktivierung der p53-Funktion durch die Verwendung von niedermolekularen Molekülen oder Peptiden dar. Diese Verbindungen stellen die wtp53-Funktion von mutp53 wieder her [146]. Eines dieser Moleküle ist PRIMA-1 (p53 reactivation and induction of massive apoptosis), das in einer humanen Osteosarkomzelllinie Apoptose induzieren konnte. PRIMA- 1 war in der Lage sowohl die sequenzspezifische DNA-Bindung als auch die aktive Konformation von mutp53 wiederherzustellen [147-149]. Um unerwünschten p53- Wechselwirkungen vorzubeugen, wurde in der vorliegenden Arbeit mit HaCaT-Zellen gearbeitet, die aufgrund eines stabilen shRNA-vermittelten knock downs kein ondogenes mutp53 mehr aufwiesen (HaCaT-p53i). Erstaunlicherweise zeigten diese HaCaT-p53i-Zellen weder vor noch nach ektopischer Expression von wtp53 eine erhöhte Sensitivität gegenüber UVB-Strahlung. Zusammenfassend zeigte die ektopische Expression von wtp53 also weder in resistenten SCL-1-Zellen noch in sensitiven HaCaT-Zellen eine Verstärkung der UVB- induzierten Apoptose. Die Wirkung von p53 zeigte sich ebenfalls unabhängig von der Menge des durch UVB induzierten DNA-Schadens, der in HaCaT- und SCL-1-Zellen grundsätzlich identisch ist [111]. Folglich scheinen weitere Faktoren, neben wtp53-vermittelten Signalwegen, entscheidend für die Induktion der UVB-induzierten Apoptose zu sein. SCL-1- Zellen zeigten im Replattierungsassay ihre grundsätzliche Kapazität Apoptose zu induzieren. Da lediglich eine partielle Caspase 3-Spaltung in diesen Zellen nachzuweisen war, wurde der Einfluss des apoptotischen Schlüsselproteins XIAP, das in diesen Zellen stark exprimiert wird, untersucht. Der Caspase-Inhibitor XIAP kann durch die selektive Bindung die Caspasen 3, 7 sowie 9 inhibieren und die Zelle vor Apoptose schützen [150-152]. Durch die effektive Caspase- inhibierung ist er ein wichtiges Ziel für neuartige therapeutische Wirkstoffe in der Behandlung von Malignomen [153]. Darüber hinaus zeigte sich XIAP als ein essentieller Inhibitor der TRAIL-induzierten Apoptose in Melanomzellen. Allerdings war es möglich 18 Melanomzelllinien gegenüber TRAIL zu sensitivieren, indem gleichzeitig XIAP durch UVB- Strahlung depletiert/dezimiert wurde [154;155]. Der Mechanismus konnte auf die 5. Diskussion 74 Kombinationsstimulation aus TRAIL und Cisplatin erweitert und in einem humanen komplexen tumornahen dreidimensionalen organotypischen Modell verifiziert werden [156]. In diversen humanen Speiseröhrenkrebszelllinien war es möglich die Chemosensitivität der Zellen durch eine Behandlung mit einer spezifischen XIAP-siRNA gegenüber Cisplatin oder Etoposide zu erhöhen [157;158]. Es sind mittlerweile mehrere SMAC-Mimetika, die den zellulären XIAP-Inhibitor Smac nachahmen und somit XIAP eliminieren, entwickelt und bereits therapeutisch eingesetzt. Eines dieser Peptidomimetika ist Compound 1, das an eine spezifische Domäne von XIAP bindet und dieses inhibiert. Compound 1 konnte in einer humanen Brustkrebszelllinie die Caspase 3 aktivieren und den Caspase-abhängigen Zelltod initiieren [159;160]. Die siRNA-vermittelte Herunterregulierung von XIAP in SCL-1-Zellen nahm jedoch keinen Einfluss auf deren Sensitivität gegenüber UVB-Strahlung. Die anti- apoptotische Wirkung von XIAP ist allgemein sehr vom Zelltyp und vom Stimulus abhängig [150;161]. Im Falle der SCL-1-Zellen scheint XIAP nicht einer der Hauptfaktoren der UVB- Resistenz zu sein. Vielmehr scheinen hier sehr zellspezifische Resistenzmechanismen vorzuliegen, die wenig zur grundsätzlichen Beantwortung der Frage zur Beteiligung von p53 in der UVB-induzierten Tumorgenese versus Apoptose beitragen können. Aus diesem Grund wurde sich im Rahmen dieser Arbeit auf die genetisch sehr gut manipulierbaren HaCaT- Zellen konzentriert. In diesen Zellen war es möglich den Proteinstatus von diversen Proteinen zu verändern. Es ist dabei wichtig nicht nur jedes Protein allein zu betrachten, sondern auch den ganzen Signalweg und den cross talk zwischen Signalwegen. Die beiden Transkriptionsfaktoren p53 und NFκB und deren cross talk nehmen signifikante Auswirkungen auf das physiologische Verhalten von Tumorzellen ein. Diese Interaktionen sind wiederum nicht nur stark vom p53-Status der Zelle abhängig, wobei wtp53 und mutp53 unterschiedlich agieren, sondern auch zelltypspezifisch und Stimulus-abhängig. Beispielsweise wurde gezeigt, dass p53 an p65 binden kann und durch diese Interaktion zwar die DNA-Bindung von p65 verstärkt, jedoch die transkriptionelle Aktivität von NFB supprimiert [162]. In einer anderen Studie konnte allerdings gezeigt werden, dass die direkte Interaktion von p53 und NFB zu einer Erhöhung der Transkriptionsaktivität führt, wobei Unterschiede zwischen mutp53 und wtp53 festgestellt wurden. Während wtp53 zunächst aktiviert werden musste, konnte mutp53 ohne zusätzliche Stimulation konstitutiv NFB aktivieren [120]. Umgekehrt kann auch NFB einen Einfluss auf p53 nehmen, indem es z. B. den Mdm2-Status erhöht und die Stabilität von p53 vermindert [163]. In HaCaT-Zellen interagieren NFB und mutp53 auch nach Stimulation mit UVB+IL-1 nicht direkt über Protein-Protein-Wechselwirkungen miteinander, was zeigt, dass sie unabhängig voneinander, aber trotzdem additiv einen Einfluss auf die Zelle nehmen können. Obwohl Zellen mit mutp53 initial vor UVB-induzierter Apoptose geschützt sind, konnte in HaCaT-Zellen durch die gleichzeitige Aktivierung von NFB und mutp53 die Apoptose signifikant gesteigert werden. Die Erhöhung der Apoptose war auch in diesen Zellen von der TNF-Sezernierung und der autokrinen Aktivierung des TNFR1 abhängig. In humanen Lungenkrebszellen konnte mutp53R175H sowohl die Aktivierung von NFB durch TNF als auch die nukleäre Akkumulation von p65 erhöhen. Hier konnte mutp53 die Zellen vor TNF-induziertem Zelltod schützen [164]. Ein cross talk von NFB und mutp53 scheint also nicht in allen Zellen für die Induktion der Apoptose förderlich zu sein. 5. Diskussion 75 Der humane TNF-Promotor stellt lediglich eine degenerierte p53-Bindestelle bereit, die allerdings ausreichend für eine Bindung von mutp53 zu sein scheint. Sowohl NFB als auch mutp53 banden an den TNF-Promotor, wodurch sie additiv zur vermehrten TNF-Synthese beitragen können. Eine verstärkte Promotorbindung von wtp53 konnte unter gleichen Versuchsbedingungen nicht nachgewiesen werden. An die degenerierte p53-Bindestelle kann deshalb selektiv mutp53, nicht jedoch wtp53 binden. Die Transkription kann folglich nur von mutp53 beeinflusst werden. Generell stellt die Bindung von Transkriptionsfaktoren an DNA einen sehr selektiven Prozess dar. Während wtp53 ein sequenzspezifischer Transkriptions- faktor ist, dessen DNA-Bindung vor allem von der Sequenz, aber auch von der DNA- Topologie abhängig ist, ist die DNA-Bindung von mutp53 hingegen nur von der DNA- Topologie abhängig [165-167]. In HaCaT-Zellen ohne intakten p53- und NFB-Signalwegen (HaCaT-p53i-IB-SR-Zellen) konnte folglich keine nennenswerten TNF-Mengen mehr nachgewiesen werden. Diese Daten passen hervorragend zu denen von Bashir et al., die zeigen konnten, dass UVB-Strahlung und das pro-inflammatorische Zytokin IL-1α in humanen Keratinozyten zur Aufregulierung der TNF-mRNA führen. Sie konnten nachweisen, dass durch die Bestrahlung die Stabilität der mRNA nicht erhöht wurde, allerdings die Transkription des TNF-Gens erhöht war [168]. NFB und mutp53 scheinen jedoch auch nötig zu sein, um die maximale Expression eines anderen Zytokins zu erreichen. So ist nach Stimulation mit TNF für die IL-8 mRNA-Expression einer humanen Bauchspeichel- drüsenkrebszelllinie sowohl NFB als auch das endogen mutp53R273H nötig. In diesem Fall band mutp53 an die NFB-Bindestelle im IL-8-Promotor [169]. In HaCaT-Zellen konnte sowohl eine erhöhte Bindungsaffinität von NFB als auch mutp53 am TNF-Promotor nachgewiesen werden. Da beide Proteine nicht miteinander wechselwirken, kann davon ausgegangen werden, dass mutp53 NFB nicht vom Promotor verdrängt. Durch die Induktion von Mutationen im p53-Gen kann UVB-Strahlung p53 über einen längeren Zeitraum von einem pro- zu einem anti-apoptotischen Faktor werden lassen. UVB kann allerdings auch über einen kürzeren Zeitraum zu einer Umkehr des Transkriptions- verhaltens von NFB führen. Durch IL-1 kommt es zur kanonischen NFB-Aktivierung an Serin 536 [170;171] und zur Aufregulierung anti-apoptotischer Proteine. In Kombination mit DNA-schädigenden Agenzien kommt es allerdings zu einer alternativen Phosphorylierung des Threonin 505 und zu einer aktiven Repression dieser anti-apoptotischen Gene [69;72]. Durch die UVB-Bestrahlung wird zusätzlich die katalytische Untereinheit der Phosphatase PP2A inhibiert. Dadurch bleibt die Kinase IKK2 chronisch aktiviert, was zu einer Inhibierung des negativen Rückkopplungsmechanismus für NFB führt, da ständig phosphoryliertes IκBα kontinuierlich proteasomal degradiert wird. Durch diesen Prozess wird es möglich, dass NFB länger an den TNF-Promotor bindet und so die Transkriptionsleistung erhöht (Abb. 5.1). Parallel induziert UVB die aktivierende Phosphorylierung von p53 an Serin 15, die für die Interaktion mit der basalen Transkriptionsmaschinerie notwendig ist [172;173]. Neben NFB bindet auch mutp53 an den TNF-Promotor, das ebenfalls einen positiven Einfluss auf die TNF-Transkription nehmen kann. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass es eine putative p53-Bindestelle im humanen TNF-Promotor gibt, die allerdings ausschließlich von mutp53 und nicht von wtp53 erkannt wird. Das endogen mutp53 der 5. Diskussion 76 HaCaT-Zellen band dabei mit seiner aktivierenden Phosphorylierung des Serin 15 an die Bindestelle, was darauf hinweist, dass das Protein aktiv an der Transkription beteiligt ist. Ein weiterer den TNF-Promotor als Kofaktor bindender Transkriptionsfaktor CREB wird ebenfalls durch UVB-Strahlung an Serin 133 phosphoryliert [122;174] und begünstigt so die maximale TNF-Produktion [121]. In HaCaT-p53i-Zellen änderte sich weder das Expressions- muster noch die Phosphorylierung von CREB und p65, was zeigt, dass sie unabhängig vom initialen p53-Status in humanen Keratinozyten sind. Durch die UVB-Bestrahlung ändert sich somit das Verhalten über einen langen Zeitraum, wobei gleichzeitig aktivierende Signale (Phosphorylierungen), als auch inhibitorische Signale (katalytische Untereinheit von PP2A) vermittelt werden. PP2A wiederum hat einen starken Einfluss auf p65 und CREB. In Zellen ohne funktionale PP2A, was die UVB-Bestrahlung nachahmt, sind diese beiden Faktoren kontinuierlich aktiviert. Somit reguliert die Phosphatase die beiden Transkriptionsfaktoren wohl nicht nur nach UVB-Bestrahlung, sondern auch in unstimulierten Zellen. Diese komplexen Wechselwirkungen zwischen den Signalwegen vermittelt die stark erhöhte TNF-Synthese und sorgt dafür, dass die initial anti-apoptotischen Faktoren NFB und mutp53 gemeinsam pro-apoptotische Signale vermitteln. Obwohl normalerweise sowohl NFB als auch mutp53 die Onkogenese positiv beeinflussen können, legen die generierten Daten nahe, dass eine Inhibierung der beiden Transkriptionsfaktoren nicht immer förderlich für eine mögliche Therapie sind, da beide Signalwege ebenfalls eine entscheidende Rolle in der verstärkten Apoptoseinduktion nach Stimulation mit UVB+IL-1 spielen können. Auch Campbell et al. konnten zeigen, dass NFB nicht immer anti- apoptotisch wirkt. So induziert UVC-Strahlung eine aktive Repression der anti-apoptotischen Faktoren XIAP und Bcl-XL durch p65 [72]. Abb. 5.1: Schematische Darstellung der Regulierung von p65, CREB und p53 am humanen TNF-Promotor. Nach Stimulation mit IL-1 wird der Transkriptionsfaktor NFB aktiviert und die p65-Untereinheit phosphoryliert. UVB-Strahlung induziert die Phosphorylierung und Aktivierung von CREB und p53. Allerdings führt sie durch Inhibierung der Phosphatase PP2A auch zu einer verlängerten Aktivierung von NFB. Alle drei Transkriptionsfaktoren können so über einen längeren Zeitraum an den humanen TNF-Promotor binden und die Transkription von TNF verstärken. 5. Diskussion 77 Auffallend ist, dass 4 % aller Keratinozyten Mutationen in p53 aufweisen, sich jedoch nicht alle Zellen mit mutp53 zum Plattenepithelkarzinom entwickeln [175;176]. Anhand der in dieser Arbeit generierten Daten könnte man vermuten, dass möglicherweise bei geringem onkogenen Stress und gleichzeitiger IL-1-Sezernierung von humanen Keratinozyten in Zellen mit mutp53 die Eliminierung dieser Zellen über die TNF-induzierte Apoptose vollzogen werden kann. Über diesen Mechanismus könnte der Organismus sogar initial vor entarteten Keratinozyten geschützt werden. Zellen, die über diesen Weg nicht eliminiert werden können, da sie eventuell noch weitere molekulare Veränderungen durchlaufen haben, könnten dann durch die Expression von mutp53 klonal expandieren und sich zum Hautkrebs entwickeln. Für diesen Prozess ist vermutlich die Expression von mutp53 vorteilhaft, was sich darin widerspiegelt, dass 90 % solcher Mutationen in allen Tumoren des weißen Hautkrebs vorzufinden sind [108]. So könnten die beiden initial anti-apoptotischen Faktoren NFB und mutp53 zu pro-apoptotischen Faktoren werden und einen Beitrag zum Schutz vor Hautkrebs beitragen. Abbildungsverzeichnis 78 Abbildungsverzeichnis Abb. 1.1: Der Aufbau der humanen Haut…………………………………………...…... -13- Abb. 1.2: UVA- und UVB-Strahlung führen zu zellulären Schäden in der Haut……….. -14- Abb. 1.3: Der extrinsische und intrinsische apoptotische Signalweg…………………… -17- Abb. 1.4: Struktureller Aufbau der Proteine der NFB-Familie………………………... -19- Abb. 1.5: Der kanonische und der nicht-kanonische NFB-Signalweg………………… -20- Abb. 1.6: Aufbau der Phosphatase PP2A……………………………………………….. -22- Abb. 1.7: Der Tumorsuppressor p53 reguliert die Transkription sowohl von pro- und anti-apoptotischen Faktoren, als auch die des eigenen Inhibitors Mdm2…... -24- Abb. 1.8: Die Häufigkeit von Mutationen in p53……………………………………….. -25- Abb. 1.9: Einige Mutationen in p53 können zur Regulierung von neuen Gruppen von Zielgenen führen……………………………………………………………. -26- Abb. 1.10: SCL-1-Zellen sind resistent gegenüber hohen UVB-Dosen………………… -27- Abb. 1.11: SCL-1-Zellen exprimieren kein p53………………………………………… -28- Abb. 1.12: Kostimulation mit IL-1 erhöht die UVB-induzierte Apoptose in KB-Zellen.. -28- Abb. 4.1: Die UVB-induzierte Apoptose lässt sich nur in sensitiven HaCaT-Zellen durch Zugabe mit IL-1 steigern…………………………………………….. -51- Abb. 4.2: Nur HaCaT-Zellen zeigen nach Bestrahlung mit UVB eine vollständige Prozessierung der Caspase 3………………………………………………... -52- Abb. 4.3: HaCaT-Zellen zeigen langfristig keine IL-1-vermittelte Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose………………………………………………… -53- Abb. 4.4: Im Replattierungsassay zeigen sich auch SCL-1-Zellen sensitiv gegenüber UVB-Bestrahlung…………………………………………………………... -54- Abb. 4.5: Das basale Expressionsmuster pro- und anti-apoptotischer Schlüsselproteine in HaCaT- und SCL-1-Zellen………………………………………………. -55- Abb. 4.6: Der Tumorsuppressor p53 hat keinen Einfluss auf die UVB-Suszeptibilität von SCL-1-Zellen…………………………………………………………... -56- Abb. 4.7: Der Caspase-Inhibitor XIAP nimmt keinen Einfluss auf die UVB- Suszeptibilität in SCL-1-Zellen………………………………..………….. -56- Abb. 4.8: SCL-1-Zellen weisen eine Veränderung in der Basensequenz der Caspase 3 auf…………………………………………………………………………... -57- Abb. 4.9: Die IL-1-vermittelte Verstärkung UVB-induzierter Apoptose geht in HaCaT- Zellen mit vermehrter TNF-Freisetzung einher……………………………… -58- Abb. 4.10: NFκB bindet nach Stimulation mit UVB+IL-1 verstärkt und verlängert an den TNF-Promotor………………………………………………………….. -59- Abb. 4.11: NFB wird zur vollständigen Synthese von TNF nach Stimulation mit UVB+IL-1 benötigt……………………………………………………….. -60- Abb. 4.12: Die IL-1-vermittelte Verstärkung der UVB-induzierten Apoptose und die TNF-Freisetzung korreliert mit dem entstanden DNA-Schaden………….. -61- Abb. 4.13: Nach UVB-Bestrahlung wird der p63-Level nicht durch den p53-Status beeinflusst…………………………………………………………………. -62- Abb. 4.14: Die Herunterregulierung von p53 sensitiviert HaCaT-Zellen gegenüber UVB-Strahlung……………………………………………………………. -63- Abb. 4.15: NFB und p53 werden in HaCaT-Zellen zur vollständigen Sezernierung von TNF benötigt………………………………………………………….. -64- Abb. 4.16: Nur mutp53 nimmt einen positiven Einfluss auf die Produktion von TNF…. -65- Abb. 4.17: Im humanen TNF-Promotor ist eine halbe, putative p53-Bindestelle zu finden…………………………………………………………………….... -65- Abb. 4.18: An den TNF-Promotor bindet verstärkt nur mutp53……………...………… -66- Abbildungsverzeichnis 79 Abb. 4.19: Die Transkriptionsfaktoren p53 und NFB bilden keine direkte Protein- Protein-Interaktion…………………..…………………………………….. -67- Abb. 4.20: Nur durch Stimulation mit UVB und IL-1 werden NFκB, p53 und CREB über einen langen Zeitraum aktiviert……………………………………….. -68- Abb. 4.21: CREB und p65 werden von PP2A negativ reguliert………………………… -69- Abb. 5.1: Schematische Darstellung der Regulierung von p65, CREB und p53 am humanen TNF-Promotor……………………………………………………. -76- Tabellenverzeichnis 80 Tabellenverzeichnis Tab. 2.1: Allgemeine Chemikalien……………………………………………………… -30- Tab. 2.2: Verwendete Vektoren/Plasmide………………………………………………. -32- Tab. 2.3: Verwendete siRNAs für die Lipofectamine® 2000-Transfektion……………. -32- Tab. 2.4: Verwendetes Zubehör für die Proteinanalyse…………………………………. -34- Tab. 2.5: Verwendete Antikörper für die Western Blot-Analyse……………………….. -35- Tab. 2.6: Verwendete Antikörper für die South-Western dot-blot-Analyse…………….. -36- Tab. 2.7: Verwendete Antikörper für die Co-IP………………………………………… -36- Tab. 2.8: Verwendete Antikörper für ChIP……………………………………………... -38- Tab. 2.9: Verwendete Primer für die Promotor-PCRs…………………………………... -38- Tab. 2.10: Verwendete Primer für die Mutagenese und Sequenzierung………………... -40- Tab. 2.11: Verwendete Geräte/Zubehör………………………………………………… -41- Tab. 2.12: Verwendete Software………………………………………………………... -41- Tab. 3.1: Komponenten und Volumina der selbst gegossenen Gele……………………. -45- Tab. 3.2: Konzentrationen, Verdünnungen und Detektion der verwendeten Antikörper (AK)………………………………………………………………………….. -45- Tab. 3.3: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes nach der Chromatin Immunopräzi- pitation……………………………………………………………………… -48- Tab. 3.4: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes für die Amplifikation der Caspase 3 und das Anfügen von Restriktionsschnittstellen……………………………... -49- Tab. 3.5: PCR-Programm für die Caspase 3-Amplifikation…………………………….. -49- Tab. 3.6: Zusammensetzung des Mutagenese-Ansatzes zur Einführung von Mutationen in den verwendeten Plasmiden……………………………………………….. -50- Tab. 3.7: PCR-Programm für die Mutagenese………………………………………….. -50- Referenzen 81 Referenzen 1. 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