I Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4: Systematische Analyse der aktiven Tasche Naphthalene Dioxygenase from Pseudomonas sp. NCIB 9816-4: Systematic Analysis of the Active Site Von der Fakultät 4 (Energie-, Verfahrens- und Biotechnik) der Universität Stuttgart zur Erlangung der Würde eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung Vorgelegt von Julia M. Halder aus Laupheim Hauptberichter: Prof. Dr. Bernhard Hauer Mitberichter: Prof. Dr. Karl-Heinrich Engesser Vorsitzender: Prof. Dr. Ralf Takors Tag der mündlichen Prüfung: 26.10.2017 Institut für Biochemie und Technische Biochemie der Universität Stuttgart 2017 II Erklärung über die Eigenständigkeit der Dissertation Hiermit erkläre ich, dass ich diese wissenschaftliche Arbeit mit dem Titel „Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4: Systematische Analyse der aktiven Tasche“ selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle Stellen der Arbeit, die wörtlich oder sinngemäß aus Veröffentlichungen oder aus anderweitigen fremden Äußerungen entnommen wurden, sind als solche einzeln kenntlich gemacht worden. Declaration of Authorship I hereby certify that the dissertation entitled “Naphthalene Dioxygenase from Pseudomonas sp. NCIB 9816-4: Systematic Analysis of the Active Site” is entirely my own work expect where otherwise indicated. Passages and ideas from other sources have been clearly indicated. Stuttgart, den 07.07.2017 Julia M. Halder III Die vorliegende Arbeit entstand unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Bernhard Hauer in der Zeit von Juni 2014 bis Mai 2017 am Institut für Biochemie und Technische Biochemie an der Universität Stuttgart. Die Arbeit wurde durch das Siebte Rahmenprogramm für Forschung und technologische Entwicklung (RP7) der Europäischen Union im Rahmen des EU-Projektes BIOOX mit grant agreement Nummer 613849 finanziert. Publikationsliste Halder, J. M., Nestl, B. M. and Hauer, B. “Semirational Engineering of Naphthalene Dioxygenase from Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 towards Selective Asymmetric Dihydroxylation“ DOI: 10.1002/cctc.201701262. IV Danksagung Für die Vergabe dieses spannenden Themas, die freundliche Aufnahme am Institut, die vielen konstruktiven Gespräche im Laufe der letzten Jahre und die Möglichkeit an internationalen Projekttreffen und Konferenzen teilzunehmen, möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Bernhard Hauer herzlich bedanken. Prof. Dr. Karl-Heinrich Engesser danke ich für die freundliche und unkomplizierte Übernahme der Zweitkorrektur und Prof. Dr. Ralf Takors für die freundliche Übernahme des Vorsitzes des Prüfungsausschusses. Besonders bedanken möchte ich mich bei Frau Dr. Bettina M. (!) Nestl für ihre hervorragende Betreuung, fachkundige Unterstützung und die vielen konstruktiven Diskussionen. Auch Herrn Dr. Bernd Nebel möchte ich an dieser Stelle danken, da er mit seinem nahezu unerschöpflichen Know-How im Bereich der Analytik und mit der tatkräftigen sowie selbstlosen Instandhaltung sämtlicher Analyse-Instrumente eine zentrale Stütze für das Institut darstellt. An beide Gruppenleiter geht ein ganz herzliches Danke für die letzten drei Jahre und „Bleibt so wie ihr seid! Ihr seid einfach klasse-“. Ganz herzlich möchte ich mich auch beim Biokatalyse-Labor 1 bedanken, ohnehin dem besten Labor am ITB. Hier sind ganz besonders Maike Lenz und Sara Hoffmann zu erwähnen, welche nicht selten zu einem vergnüglichen und doch produktiven Arbeitsalltag beigetragen haben. Auch an Nico Kress geht ein ganz herzliches Danke, der so manche, lösungsmittelreiche Extraktionsepisode durch begleitende, amüsante Gespräche nicht zur Qual werden hat lassen. Neben der Finanzierung hat das EU-Projekt BIOOX auch ein tolles Oxidationsteam geschaffen, wobei neben Sara Hoffmann auch Jan Klenk ein toller Projektpartner war, mit welchem man sich durch sämtliche Deliverables und Periodic reports kämpfen konnte. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Biochemie und Technische Biochemie danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre und stetige Hilfsbereitschaft. Dabei bedanke ich mich vor allem bei Herrn M. Sc. Sven Richter für die Unterstützung im Bereich der Fermentation. V Natürlich möchte ich mich auch bei meinen Studenten bedanken, ohne die ich sicherlich noch weniger graue Haare hätte. Da wären die Synthesestudenten Vassiliki Damakoudi und Maximilian Räuchle, beides exzellente Chemiker, und Laura Bendz, sowie mein kompetenter, immer im Bart-streichelnder Bachelorstudent Andreas Dannenberg und meine beiden Masterstudenten Lisa Schweizer, die sehr kompetente und sympathische Biologin, und Julian Ortner, der Mann für die Loops. Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Mann Sebastian, meinem Ein und Alles und meinen Freunden, auf die ich mich immer verlassen kann. Seit ich mich erinnern kann, sind meine Eltern stets für mich da gewesen, deshalb ein ganz großes DANKE auch an sie an dieser Stelle. VI Persönlichkeiten werden nicht durch schöne Reden geformt, sondern durch Arbeit und eigene Leistung. Albert Einstein INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG ...................................................................................................................................................... 1 1.1 POTENTIAL VON VICINALEN CIS-DIOLEN ........................................................................................................................ 2 1.1.1 Chemische Synthese von vicinalen cis-Diolen ......................................................................................... 5 1.1.2 Biologische Synthese von vicinalen cis-Diolen ...................................................................................... 11 1.2 RIESKE NICHT-HÄM DIOXYGENASEN .......................................................................................................................... 15 1.2.1 Ursprung und Aufgabe in der Natur ......................................................................................................... 16 1.2.2 Aufbau und Klassifizierung der Multikomponentensysteme .......................................................... 18 1.2.3 Mechanismus der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen ........................................................................... 21 1.2.4 Protein engineering der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen .............................................................. 23 1.3 MOTIVATION .................................................................................................................................................................... 25 2 MATERIAL UND METHODEN ..................................................................................................................... 27 2.1 VERWENDETE GERÄTE, CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHS-MATERIALEN ............................................................ 27 2.2 VERWENDETE ENZYME, PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE ................................................................................. 27 2.3 VERWENDETE MIKROORGANISMEN ............................................................................................................................. 37 2.4 VERWENDETE MEDIEN .................................................................................................................................................. 37 2.4.1 Medien zur Anzucht von Escherichia coli ............................................................................................... 38 2.4.2 Allgemeine Puffer und Lösungen ............................................................................................................... 39 2.5 MIKROBIOLOGISCHE ARBEITEN .............................................................................................................................. 40 2.5.1 Stammhaltung................................................................................................................................................... 40 2.5.2 Bestimmung der Zelldichte .......................................................................................................................... 41 2.5.3 Kultivierung von Escherichia coli im Schüttelkolben ........................................................................ 41 2.5.4 Kultivierung von Escherichia coli im Fermenter ................................................................................. 42 2.5.5 Reinigung von His-getaggten Proteinen über Affinitätschromatographie ............................... 42 2.5.6 Ganzzell-Biotransformationen mit ruhenden Zellen ......................................................................... 45 2.5.7 Biotransformationen mit aufgereinigten Enzymkomponenten .................................................... 45 2.6 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN .................................................................................................................... 46 2.6.1 Plasmid-Isolierung von Escherichia coli ................................................................................................. 46 2.6.2 Ortsgerichtete Mutagenese .......................................................................................................................... 46 2.6.3 Klonierung via gibson assembly ................................................................................................................. 48 2.6.4 Transformation von Escherichia coli durch Hitzeschock ................................................................. 50 2.6.5 Elektrophoretische Trennung und Gelextraktion von DNA-Fragmenten .................................. 51 2.7 PROTEINCHEMISCHE METHODEN................................................................................................................................. 52 2.7.1 Proteinbestimmung mittels Bicinchoninsäure ..................................................................................... 52 2.7.2 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelektrophorese..................................................................... 52 2.7.3 Proteinanalyse mittels Western Blot und Immundetektion ............................................................ 54 2.8 ANALYTISCHE METHODEN ............................................................................................................................................ 56 2.8.1 Aktivitätsbasierter Agarplattendiffusionstest ...................................................................................... 56 VIII 2.8.2 Gaschromatographie ...................................................................................................................................... 57 2.8.3 Acetylierung von Analytmolekülen ........................................................................................................... 58 2.8.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie .......................................................................................... 59 2.8.5 Kernspinresonanzspektroskopie ................................................................................................................ 60 2.9 BIOINFORMATISCHE METHODEN ................................................................................................................................. 60 2.10 SYNTHESE VON REFERENZMOLEKÜLEN ................................................................................................................ 61 2.10.1 Metallkatalysierte asymmetrische Dihydroxylierung ....................................................................... 61 2.10.2 Reduktion von α-Hydroxysäuren mit Lithiumaluminiumhydrid ................................................... 64 2.10.3 Simmons-Smith-Oxidation ............................................................................................................................ 65 2.10.4 Dioxygenase-katalysierte asymmetrische Dihydroxylierung ......................................................... 65 3 ERGEBNISSE .................................................................................................................................................... 70 3.1 NAPHTHALEN DIOXYGENASE IM IN VITRO SYSTEM ............................................................................................. 71 3.1.1 Expression und Aufreinigung über Affinitätschromatographie .................................................... 71 3.1.2 Optimierung des in vitro Systems .............................................................................................................. 73 3.1.3 Semi-rationales Proteindesign: Alanin-Scan und Konsensus-Varianten ................................... 76 3.1.4 Biotransformation im in vitro System ..................................................................................................... 78 3.2 NAPHTHALEN DIOXYGENASE IM IN VIVO SYSTEM ...................................................................................................... 82 3.2.1 Kultivierung im Schüttelkolben und Immunodetektion ................................................................... 84 3.2.2 Aufarbeitung von Biotransformationen ................................................................................................. 88 3.2.3 Kultivierung im Fermenter und statistische Versuchsplanung (DoE) ........................................ 89 3.2.4 Evolvierbarkeit und semi-rationales Design der Naphthalen Dioxygenase ............................. 91 3.2.5 Phenylring mit Erweiterung der Substituenten-Seitenkette .......................................................... 94 3.2.6 Phenylring mit verzweigter Substituenten-Seitenkette ................................................................. 100 3.2.7 Phenylring mit ungesättigter Seitenkette ........................................................................................... 101 3.2.8 Phenylring mit ungesättigter Seitenkette und p-Methoxy-Gruppe ........................................... 108 3.2.9 Monoterpen R-Limonen .............................................................................................................................. 111 4 DISKUSSION .................................................................................................................................................. 113 4.1 IN VITRO UNTERSUCHUNG DES MULTIKOMPONENTENKOMPLEXES NAPHTHALEN DIOXYGENASE ................. 113 4.2 NAPHTHALEN DIOXYGENASE IM IN VIVO SYSTEM .................................................................................................... 118 4.3 BEWERTUNG DER OSMIUM-KATALYSIERTEN SHARPLESS DIHYDROXYLIERUNG VERSUS DER DIHYDROXYLIERUNG MITTELS RIESKE NICHT-HÄM DIOXYGENASEN ............................................................................. 131 5 RESÜMEE UND AUSBLICK ........................................................................................................................ 134 6 ANHANG ......................................................................................................................................................... 137 6.1 GENSEQUENZ DER BEARBEITETEN ENZYME ............................................................................................................. 137 6.2 PLASMIDE ....................................................................................................................................................................... 137 6.3 KALIBRIERGERADEN ..................................................................................................................................................... 139 6.4 HPLC- UND GC-CHROMATOGRAMME ....................................................................................................................... 143 IX 6.4.1 Chirale NP-HPLC-Analytik ......................................................................................................................... 143 6.4.2 Chirale und achirale GC-FID/MS-Analytik .......................................................................................... 144 6.5 NACHWEISE VIA SDS-PAGE UND WESTERN BLOT ................................................................................................ 146 6.6 UMSETZUNG VON NAPHTHALEN UND METHYLSTYROL MIT NAPHTHALEN DIOXYGENASE WILDTYP ............ 146 6.7 ERWEITERUNG DER IN VIVO BIBLIOTHEK DER NAPHTHALEN DIOXYGENASE ..................................................... 147 7 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................................................ 149 X Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celcius min Minute Å Ångström OD Optische Dichte AD Asymmetrische Dihydroxylierung Os Osmium ADH Alkoholdehydrogenase P. putida Pseudomonas putida BAL Benzaldehyd Lyase BDO Benzol Dioxygenase PCR Polymerasekettenreaktion BFM Biofeuchtmasse PDB engl. protein data bank bp Basenpaar PHAL Pthalazin BPDO Biphenyl Dioxygenase ppm engl. part per million CDO Cumol Dioxygenase PYR Pyrimidin DAD Diodenarray-Detektor RO Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen DCM Dichlormethan s Sekunde de Diastereomerenüberschuss SDS-PAGE engl. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel DHQ Dihydroquinin DHQD Dihydroquinidin TB engl. terrific broth DMSO Dimethylsulfoxid TDO Toluol Dioxygenase DNA Desoxyribonukleinsäure UV Ultraviolett E. coli Escherichia coli v/v Volumen/Volumen ee Enantiomerenüberschuss vvm engl. volume per volume per minute EH Epoxidhydrolase EI Elektronenionisierung wt Wildtyp eV Elektronenvolt g Gramm GC Gaschromatogaphie FID Flammenionisationsdetektor MS Massenspektrometrie h Stunde HPLC Hochleistungsflüssigkeits- chromatographie IND Indolin IPTG Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranosid ISTD Interner Standard LB Luria-Bertani µ mikro m milli M molar nm Nanometer NAD(P)H Nicotinamidadenin- dinukleotid(Phosphat) NaOH Natriumhydroxid NDO Naphthalen Dioxygenase NMO N-Methylmorpholinoxid NMR engl. nuclear magnetic resonance n. d. nicht bestimmt/detektiert XI Zusammenfassung Die gezielte Oxyfunktionalisierung von Olefinen gehört zu den am meist gesuchten Reaktionen in der Chemie. Insbesondere die Dihydroxylierung und die daraus resultierenden chiralen, vicinalen 1,2-Diole spielen hierbei eine wichtige Rolle. So werden 1,2-Diole sowohl als chirale Liganden und Auxiliare und als chirale Synthons für Pharmabausteine sowie Agrochemikalien eingesetzt. Eine schnelle und effiziente Möglichkeit für die stereoselektive, asymmetrische Sharpless Dihydroxylierung (AD) von C=C-Doppelbindungen ergibt sich aus der Metall-katalysierten Oxyfunktionalisierung mittels Osmium oder anderen Übergangsmetallen. Neben der guten Ausbeute und der hohen Selektivität, stellen jedoch vor allem die Toxizität der Katalysatoren, sowie auch die Überoxidation und Spaltung der generierten cis-Diole Herausforderungen in der Anwendung dar. Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) sind eine biologische Alternative zur rein chemischen, asymmetrischen Dihydroxylierung. In der Natur sind diese Multikomponentensysteme, bestehend aus einer hexameren Oxygenase, einem Elektronen-Shuttlemolekül und einer Reduktase, für die Dihydroxylierung von aromatischen Motiven verantwortlich und katalysieren den ersten Schritt im Katabolismus von Aromaten. Mit der Entdeckung dieser effizienten Bio-katalysatoren wurde eine umweltfreundliche Alternative zur chemisch katalysierten Sharpless AD entdeckt. Aufgrund der Verfügbarkeit von Kristallstrukturen wurde die Naphthalen Dioxygenase (NDO) aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 als ein Vertreter der ROs für das semi-rationale Design ausgewählt und Varianten im aktiven Zentrum des Enzyms generiert. Neben der direkten Katalyse am aromatischen Ring, wurde durch Variation der Substituenten auch die allylische Mono- bzw. die cis-Dihydroxylierung von Alkenylresten in aromatischen Molekülen (z. B. α-Methylstyrol, Allylbenzol) und die Katalyse von C=C-Doppelbindungen in nicht-aromatischen, nicht-planaren Molekülen (z. B. R-Limonen) gezeigt. Aufgrund der Vielfältigkeit dieser Enzyme besteht ein gesteigertes Interesse am biotechnologischen Einsatz, um das enorme Potential und die Vielfältigkeit des biokatalytischen Repertoires dieser Katalysatoren ausschöpfen zu können. Des Weiteren erfolgte die nähere Betrachtung der heterologen Herstellung des Biokatalystors in Escherichia coli, wobei sowohl in vitro als auch in vivo Systeme XII betrachtet wurden. Hierbei stand im Fall der in vitro Untersuchungen das Zusammenspiel der unterschiedlichen Komponenten des Systems, das Reaktionssetup und der Einfluss des Cosolvents im Mittelpunkt. Für das optimierte in vitro System wurden schließlich folgende Parameter definiert: (I) Verhältnis der Komponenten mit 1 μM Oxygenase, 20 μM Ferredoxin und 5 μM Reduktase, (II) das Reaktionssetup mit 2 mM Substrat in Ethanol bei 30 °C für 2 h, und (III) der Anteil des Cosolvents Ethanol mit 5 %(v/v). Ein Alanin-Scan der zwölf first shell Aminosäuren lieferte im in vitro System bereits erste Indizien für relevante Mutagenese-Hotspots mit den Positionen A206, H295, L307, G204 und V260. Im Gegensatz zum in vivo System wurde im in vitro System eine deutlich erniedrigte Aktivität gegenüber den untersuchten substituierten Aromaten detektiert, weshalb auf eine mangelnde Stabilität der Komponenten im in vitro System geschlossen wurde. Im in vivo System wurde zunächst die Optimierung der Expression forciert, wobei das entwickelte Expressions- und Biotransformationsprotokoll zu einer guten Reproduzierbarkeit in Ganzzellansätzen mit Standardabweichungen von unter 5 % geführt hat. Hierzu wurden frisch transformierte Zellen zur Anzucht (37 °C) in TB-Medium verwendet und bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,6-0,8 mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid induziert. Nach 20-stündiger Expression bei 25 °C wurden eine Zellsuspension mit 0,1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) und 20 mM Glucose (0,2 gBFM/mL) für Ganzzellumsätze hergestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des in Ethanol gelösten Substrates gestartet und nach 20 h bei 30 °C mit der Zugabe von Lösungsmittel gestoppt. Für die in vivo Untersuchung wurde ein semi-rationaler Mutageneseansatz gewählt, indem alle first shell Aminosäuren mit Alanin, Valin und Isoleucin (36 Varianten) ausgetauscht, sowie 25 Doppelvarianten an den Positionen A206, H295 und V260 generiert wurden. Mit dieser Bibliothek erfolgte die Identifizierung von wichtigen Struktur-Funktionsbeziehungen anhand von unterschiedlich substituierten Styrolderivaten und dem Monoterpen R-Limonen. Mit dem Einbringen einer Punktmutation in der aktiven Tasche konnten deutliche Veränderungen in der Reaktions- und Substratspezifität sowie in der Regio- und Stereoselektivität (≥ 90 %) beobachtet werden, wobei die Restaktivität gegenüber dem natürlichen Substrat Naphthalen (bis > 99 %) erhalten blieb. So stellten sich die Position A206, XIII sowie die gegenüberliegenden Positionen H295, F202, F352, V260 und L307 in der planaren, zylinderförmigen aktiven Tasche als maßgeblich für die Steuerung der Aktivität und Selektivität der NDO dar. Generell konnte eine Abnahme der Aktivität mit steigender Substituentengröße und Verzweigungsgrad (Methyl- bis Pentyl- bzw. tert-Butyl-Reste) detektiert werden. Gleichfalls konnte eine Tendenz für ungesättigte Substituenten am Aromaten beobachtet werden, wobei die Aktivität von mono- über gem-di- und trans-di-substituierte Seitenketten abnahm. Bei der Untersuchung von unterschiedlichen Methoxystyrolderivaten konnte eine gesteigerte Spezifität und Stereoselektivität (≥ 95 %ee) beobachtet werden. Neben Hydroxylierungsreaktionen wurden hierbei auch Dealkylierungsreaktionen beobachtet. Die Dihydroxylierung wurde beim Vorliegen einer zum Aromaten konjugierten C=C-Doppelbindung gegenüber der O-Demethylierung bevorzugt. Lag die C=C-Doppelbindung isoliert zum aromatischen System vor, wurde hingegen eine Präferenz für die O-Demethylierung beobachtet. Grundsätzlich hat sich die NDO als einen guten Startpunkt für die biokatalysierte, asymmetrische Dihydroxylierung erwiesen und durch die systematische Analyse der aktiven Tasche konnten essentielle Stellschrauben für die weitere Verbesserung des Katalysator identifiziert werden. XIV Abstract The oxyfunctionalization of olefins is one of the most sought-after reactions in chemistry. Especially chiral vicinal 1,2-diols, afforded from asymmetric dihydroxylations, are often applied as chiral ligands, auxiliars or chiral synthons for pharmaceuticals and agrochemicals. In chemistry, a very powerful method for the stereoselective, asymmetric dihydroxylation (AD) of C=C double bonds is represented by the metal-catalyzed oxyfunctionalization via osmium (Sharpless AD) or other transition metals. Through extensive research in this field, high yields and excellent stereoselectivities are achieved with these catalysts. But their toxicity as well as the formation of byproducts through oxidative ring fission reactions represent major limitations in their applicability. Rieske non-heme dioxygenases (ROs) are the effective, biological alternative to the Sharpless AD. These multicomponent systems consist of a hexameric oxygenase, an electron shuttle molecule and a reductase. In nature, they dihydroxylate C=C double bonds in aromatic rings and therefore initiate degradation of arenes. Due to the availability of different crystal structures the naphthalene dioxygenase (NDO) from Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 was representatively investigated for the ROs and mutations in the active site were examined. By varying the substitution pattern, the direct catalysis at the aromatic ring as well as the allylic mono- and cis-dihydroxylation of the alkenyl side chain of a wide range of arenes (e. g. α-methylstyrene, allylbenzene) and the catalysis of non-aromatic, non-planar molecules like R-limonene were shown. Due to the broad biocatalytically repertoire of these enzymes the application for biotechnological purposes is of peculiar interest. To have a closer look at this catalyst the heterologous in vivo and in vitro expression in Escherichia coli was examined. Hereby, the in vitro investigation was focused on the interaction of the different components of the NDO, the reaction setup and the influence of the cosolvent. After optimization of the in vitro system the following parameters were defined: (I) ratio between the components with 1 μM oxygenase, 20 μM ferredoxin and 5 μM reductase, (II) the reaction setup with 2 mM substrate in ethanol at 30 °C for 2 h, and (III) the amount of the cosolvent ethanol with 5 %(v/v). XV With an alanine scan of twelve first shell amino acids in the in vitro system the positions A206, H295, L307, G204 and V260 seemed to be promising candidates for mutagenesis, although the allegedly low stability of the components in the in vitro system only led to minor product formation. Through optimization of the in vivo system a protocol for the expression and whole cell biotransformation was developed, which delivered a good reproducibility with standard deviations of less than 5 %. Freshly transformed cells were cultivated in TB-medium (37°C) until an optical density of 0,6-0,8 and then induced with 0,1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. The following heterologous expression was performed for 20 h at 25 °C. For whole cell biotransformations the cells were resuspended in 0,1 mM potassium phosphate buffer (pH 7,2) containing 20 mM glucose (0,2 gcww/mL). Reactions were started by adding the substrate (dissolved in ethanol) and stopped with the addition of solvent after 20 h at 30 °C. By using a semi-rational design approach in the in vivo system all twelve first shell amino acid residues were exchanged with either an alanine, a valine or an isoleucine (36 single variants) and additionally, based on in silico docking of R-limonene, 25 double variants were generated by combination of the positions A206, H295 and V260. By the screening of styrene derivatives as well as the monoterpene R-limonene important structure and function relationships were identified. The introduction of a single point mutation in the active site of the NDO had a clear influence on the reaction and substrate specificity as well as on the regio- and stereoselectivity (≥ 90 %), while the residual activity towards the natural substrate naphthalene (up to > 99 %) was not affected. Determining influences on the activity and selectivity of the NDO were identified at position A206 as well as at opposite positions H295, F202, F352, V260 and L307 of the planar cylindrical active site. In general, the activity dropped with an increasing size of the substituent as well as with increasing degree of branching (methyl- to pentyl- or tert-butyl-substituents). In case of the alkenyl side chains of the arene substrates the activity decreased from mono- to gem-di- to trans-di-substituted alkenes. Further investigation of different methoxystyrene derivates, however, showed an increase in specificity and stereoselectivity (≥ 95 %ee). By converting these para-methoxy substrates not only the allylic mono- and cis-dihydroxylation reactions were observed, but also the O-dealkylation. If the C=C double bond of the side chain was conjugated to the XVI aromatic system a preference for the dihydroxylation was discovered, while with an isolated C=C double bond the O-demethylation was detected as a major product. In terms of selectivity and specificity is the NDO a good starting point for the selective, asymmetric dihydroxylation and the systematic analysis of the active site led to the discovery of crucial set screws for futher optimization of the catalyst. Einleitung 1 1 Einleitung In den 1950ern wurde mit der Nutzung von Mikroorganismen für die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von Steroiden durch Pharmaunternehmen wie Upjohn und Merck ein wichtiger Meilenstein in der Entwicklung von effizienten und selektiven Biokatalysatoren erreicht.1 Seither wächst der Prozentsatz an Bulk- und Feinchemikalien, die unter Einsatz von Biokatalysatoren produziert werden.2,3 Das gesteigerte Interesse an biotechnologischen Prozessen lässt sich unter anderem auf das enorme Potential und die Vielfältigkeit des biokatalytischen Repertoires zurückführen.4 Hierbei ist die Hydroxylierung neben der Epoxidierung als eine weitere synthetisch wertvolle Biotransformation beschrieben.2 Ausgehend von einfachen pro-karyotischen Lebensformen bis hin zu komplex entwickelten eukaryotischen Systemen ist die Hydroxylierung als Schlüsselreaktion im oxidativen Stoffwechsel zur Herstellung einer Vielzahl von organischen Molekülen zu finden.5 Dabei werden Enzyme, die ein oder mehrere Sauerstoffatome auf ihr Substrat übertragen, als Oxygenasen bezeichnet und vor allem dann eingesetzt, wenn keine oder nur eine aufwendigere, chemische Syntheseroute für das gewünschte Produkt (z. B. selektive Oxyfunktionalisierung von Steroiden) besteht oder wenn die Synthese durch den Einsatz signifikant gekürzt werden kann.6–10 Neben der Monohydroxylierung spielt auch die Dihydroxylierung und die damit einhergehende Produktion von chiralen, vicinalen 1,2-Diolen eine wichtige Rolle in der Chemie. 1,2-Diole werden als chirale Liganden, Auxiliare und chirale Synthons verwendet.11 Ihre Relevanz wurde durch die Vergabe des Chemie-Nobelpreises (2001) an Barry Sharpless, der zu bedeutenden Fortschritten im Bereich der stereoselektiven Oxidationsreaktionen (Sharpless Epoxidierung, Sharpless Dihydroxylierung, Sharpless Amino-hydroxylierung) beitrug, verdeutlicht.12 Mit Biokatalysatoren können neben einfachen C-H-Bindung13,14 auch isolierte und sogar aromatische C=C-Doppelbindungen15–18 selektiv adressiert und hydroxyliert werden, wobei vor allem die Natur der unterschiedlichen Bindungen interessant ist. So stellt die selektive Oxidation einer C-H-Bindung in einem linearen Alkan durch ihre hohe Bindungsenergie von 416 kJ/mol eine besondere Herausforderung dar.19 Eine biokatalytische Antwort für die Hydroxylierung von C-H-Bindungen findet sich Einleitung 2 in den Cytochrom P450 Monooxygenasen, welche durch ihre starke katalytische Maschinerie Wasserstoff aus der Bindung abstrahieren und gleichfalls eine hohe Selektivität durch eine spezifische Substratbindung erzeugen können.20 Auch die rein chemisch Methoden zur selektiven Hydroxylierung von C-H-Bindungen wurden im Lauf der Zeit verfeinert, wobei dirigierende und elektronische Effekte von funktionellen Gruppen zur Steuerung der Reaktivität und der Selektivität unvermeidlich sind.21 Die C=C-Doppelbindung weist mit 607 kJ/mol noch eine weitaus höhere Bindungsenergie als die C-H-Bindung auf, jedoch gilt sie aufgrund ihres Elektronenreichtums als reaktiver.19 Die Dihydroxylierung einer C=C-Doppelbindung kann sowohl rein chemisch mit den von Sharpless entwickelten Osmium-Katalysatoren erreicht werden, als auch mit der biologischen Alternative, den Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs). Das wohl stabilste Motiv, in dem C=C-Doppelbindung vorkommen, stellt der Benzolring dar. Dieser ist chemisch betrachtet durch das delokalisierte π-Elektronensystem nahezu inert. Die Stabilität einer aromatischen C=C-Doppelbindung wird eindrucksvoll bei der Bestimmung der Hydrierwärme deutlich. Bei der Hydrierung der einfachen C=C-Bindung (z. B. Cyclohexen) werden 120 kJ/mol Energie freigesetzt. Bestünde ein additiver Effekt der C=C-Doppelbindungen, wäre bei der Hydrierung von Benzol die Freisetzung von 360 kJ/mol zu erwarten, gemessen werden jedoch nur 209 kJ/mol.19 Die Differenz von 151 kJ/mol stellt hierbei die Resonanzenergie dar. Zur selektiven Adressierung eines solch stabilen, aromatischen Systems sind dabei lediglich die ROs in der Lage. 1.1 Potential von vicinalen cis-Diolen Das Einbringen von funktionellen Gruppen in Kohlenwasserstoffverbindungen mittels Oxidation stellt eine sehr nützliche und leistungsstarke Methode dar.22–24 Generell können hierbei Epoxide, Diole und Aminoalkohole gebildet werden, welche wertvolle Grundchemikalien in der Produktion von Arzneimitteln, Agro- und Feinchemikalien darstellen.25 Der Einsatz von isomerenreinen Oxidationsprodukten ist bei den oft mehrstufigen Synthesen unerlässlich, um die unterschiedlichen Stereozentren der komplexen Zielverbindung zu erhalten. Bedingt hierdurch ist die oxidative Funktionalisierung von Olefinen eine der am besten untersuchten Reaktionen der organischen Chemie. Neben der oxidativen Spaltung26, Einleitung 3 Halogenierung27, Halohydrin-Bildung28 und der Wacker-Oxidation29 gehören auch die Übergangsmetall-katalysierte Epoxidierung30, Dihydroxylierung31–34 und Aminohydroxylierung35 zum vielseitigen, chemischen Repertoire.36 Prominente Beispiele für die oxidative Funktionalisierung von Olefinen sind die 1,2-Diole Ethylen- und Propylenglykol, deren Weltproduktion in 2010 bei 25,4 Mio. t/a (Ethylenglykol) und 0,3 Mio. t/a (Propylenglykol) lag.37 Diese Bulkchemikalien finden in der Herstellung von Polyester, PET und Frostschutzmittel ihren Einsatz.38,39 Die industrielle Relevanz dieser Moleküle spiegelt sich unter anderem in der großen Zahl an Patenten wieder.40–45 Ein weiterer wichtiger Abkömmling eines Diol-Vorläufers stellt der blaue Farbstoff Indigo, der hauptsächlich zur Färbung von Jeans verwendet wird, im Bereich der Textilverarbeitung dar. Bereits 1995 ließ sich Genencor die mikrobielle Fermentation von Indigo ausgehend von Glucose patentieren.46 Im Jahr 2003 lag die weltweite Produktion von Indigo bei 30 000 t/a.47 Ein weiterer Anwendungsbereich für vicinale cis-Diole stellt die asymmetrische, chemische Synthese dar. Hierbei werden Diole als chirale Liganden, Auxiliare und chirale Synthons eingesetzt.11,36,48,49 Hydrobenzoin und andere Stilbendiol-Derivate sind dabei interessante chirale Auxiliare für eine ganze Reihe chemischer Reaktionen (s. Abbildung 1.1).50 Abbildung 1.1: Beispiele von Diolen im Bereich der Chemie (Auxiliar), der Pharmaindustrie und der Life Sciences Pharmazeutika Auxiliar Life Sciences Einleitung 4 Bereits 1994 entwickelten Wang und Sharpless eine effiziente Methode zur Herstellung von enantiomerenreinen Hydrobenzoin (> 99 %ee) im Kilogramm-Maßstab.33 Darauf aufbauend sind sowohl asymmetrische Hydrierungen51, Michael-Additionen52, Cyclopropanierungen53, sowie Allyl- und Crotylborierungen48 berichtet. In der Synthese von (-)-Morphin und (+)-Majusculon wird Hydrobenzoin zur Racematspaltung eingesetzt und ermöglicht somit die enantiomerenreine Herstellung dieser komplexen Zielmoleküle.54,55 Auch in der pharmazeutischen Chemie lassen sich Beispiele für potentielle Einsatzgebiete von 1,2-Diole finden (s. Abbildung 1.1). So stellt cis-Aminoindanol ein wichtiges Schlüsselintermediat in der Synthese des HIV-Proteaseinhibitors Indinavir (Crixivan®) dar.56 Die stereoselektive Herstellung kann in diesem Fall durch den enzymatischen Umsatz von Inden zu (-)-cis-(1S,2R)-Indandiol gewährleistet werden und wurde 1995 durch Merck patentiert.57 Für die Synthese der Seitenketten von Diltiazem (Dilzem®, Herzmedikament) und Paclitaxel (Taxol®, Krebsmedikament) werden chemisch katalysierte cis-1,2-Diole als zweite Stufe in der Synthese eingesetzt.58 2012 entwickelten Boyd und Kollegen eine chemoenzymatische Synthese zur Herstellung des Schmerzmittels (-)-Epibatidin ausgehend von einem enzymatisch katalysierten Cyclohexadiendiol.59 Das Potential der Dihydroxylierung erstreckt sich auch auf die Modifikation von sekundären Pflanzenstoffen wie den Flavanoiden.60–62 Ähnlich der Steroidstrukturen handelt es sich bei dieser Molekülgruppe um Mehrringsysteme, deren gezielte Hydroxylierung neue, und im Fall von Dihydroxylierungen, größenteils unerforschte Eigenschaften hervorbringt. Natürlich vorkommende, monohydroxylierte Flavanoide sind beispielsweise für ihre Radikalfängereigenschaften und die anti-oxidative Aktivität bekannt.63,64 Des Weiteren wurden in in vitro Experimenten entzündungshemmende65, antiallergene66, antikanzerogene67 und antivirale Effekte beim Einsatz von Flavanoiden beobachtet.62,63,68 Quercetin, ein Hauptvertreter der Flavonole, ist mit 60 - 75 % eines der am häufigsten vorkommenden Flavanoide, welches vom Menschen durch die Nahrung aufgenommen wird (s. Abbildung 1.1).69 Das Grundgerüst von Flavanoiden enthält keine Hydroxylgruppen im aromatischen System und stellt somit eine interessante Ausgangsverbindung für Dihydroxylierungsreaktionen dar. Des Weiteren stellt Chrysin im Bereich der hydroxylierten Flavone eine potentiell vielversprechende Verbindung mit hoher Einleitung 5 antioxidativer Aktivität (IC50 > 200 µM) dar.68 Naringenin, hervorgehend aus einem Flavanon-Grundgerüst, wird als Antioxidans in Lebensmitteln eingesetzt und bereits auf die Tauglichkeit zur Behandlung von Adipositas und Diabetes untersucht.70 1.1.1 Chemische Synthese von vicinalen cis-Diolen Heutzutage wird die Darstellung von vicinalen Diolen hauptsächlich durch einen Zwei-Schritt Mechanismus realisiert: Epoxidierung des Alkens mit Hydroperoxid, einer Persäure oder Sauerstoff und die anschließende Hydrolyse des Epoxids.71,72 Eine wesentlich effizientere und kürzere Syntheseroute zur Herstellung von 1,2-Diolen stellt die direkte Dihydroxylierung der C=C-Doppelbindung dar. Die oxidative Alken-Funktionalisierung wird hierbei vor allem durch Metalle wie Osmium, Ruthenium, Eisen oder Mangan katalysiert.73,74 Die osmium-katalysierte Dihydroxylierung hat sich dabei in der Forschung als eine zuverlässige und effiziente Methode zur Darstellung von cis-1,2-Diolen erwiesen.11,24,48,75 1.1.1.1 Osmium-katalysierte asymmetrische Dihydroxylierung Die Osmium-katalysierte asymmetrische Dihydroxylierung wurde seit ihrer Entdeckung durch Sharpless und Kollegen intensiv erforscht und stellt aufgrund der hohen Toleranz gegenüber den eingesetzten Edukten, der hohen Selektivität und den guten Ausbeuten eine Schlüsselreaktion in der organischen Synthese dar.76 Zu Beginn wurden durch den stöchiometrischen Einsatz von Osmiumtretroxid (OsO4) olefinische Doppelbindungen über cis-Osmiumester mit hohen Ausbeuten zu vicinalen cis-Diolen oxidiert (s. Abbildung 1.2).77 Aus ökonomischen Gründen wurde sehr schnell daran gearbeitet, den Einsatz von Osmium in katalytischen Mengen zu realisieren. Abbildung 1.2: Osmylierung von Alkenen (mod. nach 48) Die Basis zum Einsatz von OsO4 als katalytisches Reagens wurde 1908 geschaffen, indem die Reduktion von OsO4 durch sekundäre, ungesättigte Verbindungen (Co- Einleitung 6 Oxidantien) gezeigt wurde.78 Die Verwendung von anorganischen Co-Oxidantien wie Wasserstoffperoxid (H2O2) und verschiedenen Chloratverbindungen führte in den meisten Fällen zu Überoxidationen und einer daraus folgenden geringeren Ausbeute.79–81 Mit der Oxidation von Osmium(VI) durch tert-Butylhydroperoxid im Basischen oder mit dem Einsatz anderer N-Oxide wie N-Methylmorpholin-N-oxid (NMO) konnte die Ausbeute erheblich gesteigert werden.82,83 Der auf den sekundären Reaktionszyklus des NMOs zurückzuführende Verlust der Enantio-selektivität wurde mit dem Einsatz von Kaliumhexacyanidoferrat(III) (K3[Fe(CN)6]) elimiert.84,85 Wird K3[Fe(CN)6] als Co-Oxidans verwendet, läuft die Reaktion in einem heterogenen Lösungsmittel ab (s. Abbildung 1.3). Die Osmylierung des Olefins findet dabei in der organischen Phase (meist tert-Butanol) statt, die Reoxidation von wasserlöslichem Os(VI) zu Os(VIII) in der wässrigen Phase.86 OsO4 wird dadurch wieder für die Katalyse in der organischen Phase bereitgestellt. Abbildung 1.3: Reaktionszyklen der asymmetrischen Dihydroxylierung unter Verwendung von Kaliumhexacyanidoferrat(III) als Co-Oxidans (L: Ligand; R: entsprechende Substituenten des Olefins; mod. nach 24) Des Weiteren wird zur asymmetrischen Dihydroxylierung ein Ligand eingesetzt, der die Reaktion beschleunigt und die Steuerung der Stereoselektivität ermöglicht. Bereits in den 1940ern wurde von Criegee die Beschleunigung der Di-hydroxylierungsreaktion unter Verwendung von Pyridin beobachtet.87 Sharpless und Hengtes untersuchten daraufhin den Einsatz chiraler Pyridine unter Verwendung von stöchiometrischen Mengen an Osmium und beobachteten ein stets schnelleres Ablaufen der Reaktion bei erniedrigter Stereoselektivität Einleitung 7 (~ 18 % ee).88,89 Die Bildung von instabilen Pyridin-Osmiumtetroxid-Komplexen wurde als Ursache identifiziert. Da tertiäre Amine wesentlich stabilere Komplexe mit OsO4 bilden können, konnte mit dem Einsatz von Derivaten der natürlich vorkommenden Alkaloide aus Cinchona-Arten eine bedeutende Verbesserung der Stereoselektivität erzielt werden.76,90,91 Seither wurden mehr als 400 Alkaloide untersucht, wobei unter Verwendung der Alkaloidderivate der Cinchona-Arten die besten Stereoselektivitäten erzielt wurden.31,48 In Kombination mit Phthalazin- (PHAL), Diphenylpyrimidin- (PYR) und Anthraquinon-Analoga (AQN) sind Derivate von Dihydroquinin (DHQ) und Dihydroquinidin (DHQD) die wohl am häufigsten eingesetzten Liganden zur katalytischen cis-Dihydroxylierung (s. Abbildung 1.4). Abbildung 1.4: Häufig verwendete Liganden in der asymmetrischen Synthese (Alk = DHQD, DHQ; mod. nach 23) Die Wahl des eingesetzten Liganden ist von zwei Faktoren abhängig: (1) Stereo-selektivität des gewünschten Produktes und (2) Substitutionsmuster des eingesetzten Olefins. Zahlreiche Studien haben sich bereits mit dem Mechanismus der asymmetrischen Dihydroxylierung auseinandergesetzt und den Einfluss des Liganden auf die Stereoselektivität teils kontrovers diskutiert.92,93 So kann die Bildung des Osmiumglykolats über eine [3+2]- oder eine [2+2]-Addition erfolgen. Quantenchemische Berechnungen favorisieren hierbei den Mechanismus der [3+2]-Addition, kinetische Studien gehen von einer [2+2]-Addition aus.93 Beide Theorien basieren jedoch auf der Annahme, dass die Seitendifferenzierung bei der Reaktion des Olefins mit Osmiumtetroxid in der chiralen Bindetasche durch die aromatischen Reste des Liganden erzeugt wird.94 Zwei unterschiedliche Modelle wurden für die Einleitung 8 Orientierung des Substrates in der Bindetasche postuliert (s. Abbildung 1.5 A). Basierend auf kristallographischen Daten vertreten Corey und Kollegen die Theorie der U-förmigen Bindetasche, in der wichtige stabilisierende Effekte zwischen Substrat und Ligand von den Aryl-Aryl-Wechselwirkungen zwischen den aromatischen Resten des Substrats und den parallelen Methoxyquinolingruppen des Liganden stattfinden.95,96 Sharpless hingegen postuliert eine L-förmige Bindetasche basierend auf quantenmechanischen Berechnungen, wobei der aromatische Linker zwischen den beiden Alkaloidmotiven den Boden der Tasche bildet und die Methoxyquinolinreste die senkrechten Wände.48,97 Abbildung 1.5: (A) Seitendifferenzierungs-Modelle von Corey und Sharpless, (B) Mnemonik zur Vorhersage der Stereoselektivität bei Einsatz unterschiedlicher chiraler Aminoalkohole (RS = kleinere Variationen werden toleriert; RM/RL = zahlreiche mittlere und sterisch anspruchsvolle Variationen werden toleriert; AD-Mix bestehend aus K3Fe(CN)6, K2CO3, (DHQD)2-PHAL und K2OsO2(OH)4; mod. nach 24,98) Die Stereoselektivität der hydroxylierten Zielverbindung kann mit einfachen Regeln und unter Zuhilfenahme eines empirischen Modells vorhergesagt werden (s. Abbildung 1.5 B).99–101 Wird ein prochirales Alken mit einem Dihydro-quinidinderivat (DHQD) umgesetzt, erhält man ein β-konfiguriertes cis-Diol, setzt man ein Dihydroquininderivat (DHQ) ein, wird das α-Produkt erhalten. Wie bereits beschrieben ist die Wahl des Liganden auch von dem Substitutionsmuster des Olefins abhängig. Hierbei weisen die unterschiedlichen Liganden verschiedene Stereoselektivitäten auf (s. Tabelle 1.1). DHQD Angriff von oben (β-AD-Mix) DHQ Angriff von oben (α-AD-Mix) A B Einleitung 9 Tabelle 1.1: Bevorzugt zu verwendende Liganden für die unterschiedlichen Substitutionsmuster von Olefinen (mod. nach 48) Olefin mono gem-di cis-di trans-di tri tetra Bevorzugter Ligand PYR PHAL PHAL IND PHAL PHAL PYR PHAL ee [%] 30-97 70-97 20-80 90-99.8 90-99 20-97 PHAL und PYR weisen ein breites Spektrum auf und können fünf der sechs Olefinklassen mit moderater bis exzellenter Stereoselektivität umsetzen. Cis-di-substituierte Olefine sowie elektronenarme C=C-Doppelbindungen stellen hingegen für die Dihydroxylierung mittels Osmiumtetroxid eine Herausforderung dar. Der kommerziell erhältliche AD-Mix (Asymmetrische Dihydroxylierung) enthält neben dem Katalysator K2[OsO2(OH)4], den chiralen Alkaloidliganden (z. B. (DHQD)2PHAL), K3[Fe(CN)6] auch die Base Kaliumcarbonat zur Reoxidation des Osmiums. Diese Zusammensetzung des AD-Mixes wird am Häufigsten für cis-Dihydroxylierungen im kleinen Maßstab verwendet.48 Es gibt jedoch auch industrielle Beispiele für den Einsatz des AD-Mixes. In Abbildung 1.6 sind zwei asymmetrische Dihydroxylierung im Kilogramm-Maßstab dargestellt. Abbildung 1.6: (A) Umsetzung von o-Isopropoxy-m-Methoxystyrol32, (B) Schlüsselintermediat in der Synthese eines Melatonin-Rezeptor-Agonisten102 Bei der Umsetzung von o-Isopropoxy-m-Methoxystyrol wird das entsprechende Diol mit hoher Reinheit (94 %) und hoher Stereoselektivität (90 %ee) erhalten.32 Bei der Synthese eines Melatonin-Akzeptor-Agonisten wurde sogar ein Reinheitsgrad von 98,4 % erhalten, bei einem Enantiomerenüberschuss von 99,4 %ee.102 A B Einleitung 10 In der Synthese von unterschiedlichsten Pharmawirkstoffen stellt die asymmetrische Dihydroxylierung durch Osmiumtetroxid ein wichtiges Werkzeug dar. Im Folgenden werden einige Beispiele von Pharmamolekülsynthesen aufgezeigt, wobei lediglich der AD-katalysierte Schritt grafisch dargestellt ist (s. Tabelle 1.2). Tabelle 1.2: Cis-Dihydroxylierungen als Schlüsselreaktionen in der Synthese von Pharmawirkstoffen Name des Wirkstoffes AD-katalysierte Reaktion Ref. Quinin zur Behandlung von Malaria 103 Cortistatin A verhindert die Blutgefäßbildung bei Tumoren 104 Lomaiviticin-Aglycon weist antibiotische Eigenschaften auf und wird zur Behandlung von Krebs eingesetzt 105 Trioxacarcinose A hemmt das Wachstum von Krebszellen 106,107 (S)-Oxybutynin hemmt die Wirkung von Acetylcholin 108 (-)-Ovalicin stellt einen Antitumorstoff mit antiangiogener Effekt dar 109,110 * Cbz = Benzyloxycarbonyl; TES = Triethylsilylether; MEM = 2-Methoxyethoxymethyl; TBS = tert-Butyldimethylsilyl; TIPS = Triisopropylsilylether; BP = Biphenyl) Einleitung 11 Reduktion Hydrolyse 1.1.1.2 Metall-katalysierte asymmetrische Dihydroxylierung Neben der Verwendung von Osmiumtetroxid zur Metall-katalysierten asymmetrischen Dihydroxylierung sind nur wenige weitere Übergangsmetalle zur selektiven cis-Dihydroxylierung in der Lage. Im Basischen kann mit dem Einsatz von stöchiometrischen Mengen an Kaliumpermanganat ein racemisches Gemisch von cis-Diolen hergestellt werden. Jedoch sind das hohe Oxidationspotential, die daraus resultierende Überoxidation und der in stöchiometrischen Mengen anfallende Braunstein problematisch in der Anwendung.74 Der Einsatz von katalytischen Mengen an Rutheniumoxid kann bei sehr kurzen Reaktionszeiten (> 0,5 min) und niedrigen Temperaturen ebenfalls die Bildung von cis-Diolen beobachtet werden.111–113 Neben Eisen sind weitere Metall-katalysierte Dihydroxylierungen durch Molybdän, Palladium, Cerium und Techneticum beschrieben und von Bataille und Donohoe ausführlich in ihrem Review erläutert.74 1.1.2 Biologische Synthese von vicinalen cis-Diolen Für den biologischen Zugang zu vicinalen Diolen sind drei Hauptwege beschrieben: Hydrolyse von Epoxiden mittels Epoxidhydrolasen oder Halohydrin-Dehalogenasen, die Reduktion von 1,2-Diketonen durch Alkoholdehydrogenasen bzw. Reduktion von α-Hydroxyketonen durch Diacetyl-Reduktasen, sowie die Oxidation von C=C-Doppelbindungen mit Oxygenasen (s. Abbildung 1.7). Abbildung 1.7: Biologischer Zugang zu vicinalen Diolen Epoxidhydrolasen (EHs, EC 3.3.2.X) katalysieren die Ringöffnung von Epoxiden unter Verwendung von Wasser als Nukleophil. Sie werden sowohl zur Hydrolyse von meso-Epoxiden eingesetzt, wodurch eine prochirale Verbindung in eine chirale Oxidation Einleitung 12 überführt wird (hydrolytic desymmetrization), als auch zur biokatalytischen kinetischen Racematspaltung.25,114–116 In den meisten Fällen führt der Einsatz von Epoxidhydrolasen zur Bildung von vicinalen trans-Diolen.23 Die wenigen Beispiele für Epoxidhydrolasen, die cis-1,2-Diole bilden, haben ihren Ursprung in der Forschung von Belucci und Kollegen.117,118 Bei der Umsetzung von cis-Stilben mit einer mikrosomalen EH aus Hasenleber konnten Enantiomerenverhältnisse von bis zu 94:6 (R,R) erreicht werden. Die Palette an mikrobiellen EHs zur Produktion von chiralen cis-1,2-Diolen wurde durch die Untersuchungen von Zhao und Kollegen 2004 erheblich erweitert.25 Von elf neuartigen EHs setzten vier Enzyme1 (BD8877, BD8876, BD9300, BD9883) cis-Stilben mit hervorragenden Selektivitäten von > 96 %ee (R,R) um. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass BD8877 auch eine breite Auswahl an Substituenten am Phenylring in meta- und para-Position toleriert. Halohydrin-Dehalogenasen (HDHHs, EC 4.5.1.X) werden von Mikroorganismen zum Abbau von halogenierten Kohlenwasserstoffen benötigt und gehören zu der Klasse der Lyasen. Diese Enzyme katalysieren die reversible Dehalogenierung von Halohydrinen zu Epoxiden durch einen intramolekularen nukleophilen Austausch des Halogensubstituenten an der benachbarten Hydroxyl-Gruppe. Die Halohydrin-Dehalogenase von Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC) katalysiert die enantio-selektive Umsetzung von aromatischen Halohydrinen zu (R)-Epoxiden und (S)-Halohydrinen. 28,119 2005 zeigten Hasnaoui und Kollegen, dass die Kombination aus HheC und Nitrit ein nützliches Werkzeug zur enantio- und regioselektiven Hydrolyse von Epoxiden darstellt (s. Abbildung 1.8). Abbildung 1.8: Racematspaltung von p-Nitrostyroloxid durch die Halohydrin-Dehalogenase HheC und anschließende Hydrolyse zum vicinalen Diol (mod. nach 28,120) 1 EHs wurden mittels filter lift Hybridisierung identifiziert und generisch mit BD+Nummer bezeichnet. Einleitung 13 Bei der Umsetzung des para-substituierten Nitrostyroloxids mit HheC und Nitrit zu Nitrophenylethan-1,2-diol wurde ein Enantiomerenüberschuss von 91 %ee erhalten. Die Reduktion von α-Hydroxyketonen und α-Diketonen mittels Alkohol-dehydrogenasen (ADHs, EC 1.1.1.X) führt ebenfalls zur Bildung vicinaler cis-Diole.121 Obwohl diese Enzyme bereits Anwendung in der Industrie finden, besteht weiterhin Interesse an ADHs, welche die Reduktion von sterisch anspruchsvollen Substraten wie z. B. 2-Hydroxyketonen katalysieren. Eine Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. DSM6428 (RADH) stellte sich bei der Untersuchung von Ketonen mit zwei sterisch anspruchsvollen Substituenten (bulky-bulky ketones) als ein gut geeigneter Katalysator heraus122 und wurde 2012 in Untersuchungen von Kulig und Kollegen auch als geeignetes Enzym zur Reduktion von sterisch anspruchsvollen 2-Hydroxyketonen identifiziert.123 Arylaliphatische Ketone wie (R)-2-Hydroxyphenyl-propanon ((R)-2-HPP) wurden im substratgekoppelten System mit 2-Propanol mit einer spezifischen Aktivität von 240 U mg-1 sehr viel schneller reduziert als aliphatische oder aromatische Aldehyde (0,5 - 10 U mg-1). Zudem konnten Stereo-selektivitäten von > 99 %de (R) bestimmt werden. Im Weiteren zeigten auch die Alkoholdehydrogenasen (Anti-Prelog ADHs) von Lactobacillus brevis (LBADH), sowie die Dehydrogenasen (Prelog ADHs) aus Rhodococcus ruber (ADH-A) und Thermoanaerobacter sp. (ADH-T) bei der Umsetzung von 2,3-Pentandion aus-gezeichnete Enantioselektivitäten beim resultierenden cis-Diol, (2R,3R)-Pentandiol, mit > 99 %ee, sowie moderate bis exzellente Diastereoselektivitäten von 62-91 %.124 Bei der Umsetzung von aliphatischen Diketonen konnten ebenfalls cis-Diole mit guten Ausbeuten (40 - 80 %) und sehr hohen Stereoselektivitäten von ≥ 95 % erreicht werden.125 Eine Zwei-Schritt Synthese mit C-C-bindungsknüpfenden Enzymen und Oxido-reduktasen führte ebenfalls zur erfolgreichen Herstellung von vicinalen cis-Diolen.126 Durch den Einsatz der thiamindiphosphatabhängigen Benzaldehydlyase (BAL, EC 4.1.2.38) bzw. Benzoylformiatdecarboxylase (BFD, EC 4.1.1.7) und der Alkoholdehydrogenasen LBADH bzw. ADH-M aus Thermoanaerobium sp. (EC 1.1.1.2) konnten erfolgreich alle Stereoisomere des 1-Phenylpropan-1,2-diols hergestellt werden (s. Abbildung 1.9). Bei der präparativen Herstellung des (1S,2S)- cis-Diols konnte eine Ausbeute von 90 % mit 98 %de erreicht werden, die Einleitung 14 Umsetzung zum (1R,2R)-cis-Diols lieferte ebenfalls eine gute Ausbeute (81 %) und einen exzellenten Diastereomerenüberschuss von 98 %. Abbildung 1.9: Zwei-Schritt Synthese zur Herstellung der vier möglichen Stereoisomere von 1-Phenylpropan-1,2-diol (BFD: Benzoylformiatdecarboxylase; BAL: Benzaldehydlyase; ThDP: Thiamindiphosphat; LBADH: Alkoholdehydrogenase von Lactobacillus brevis; ADH-M: Alkoholdehydyrogenase aus Thermoanaerobium spec.; mod. nach 126) Eine weitere Möglichkeit vicinale cis-Diole darzustellen ergibt sich aus der Verwendung von Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs, EC 1.14.12). Diese Multi-enzymkomplexe (s. Kapitel 1.2) katalysieren ausgehend von molekularem Sauerstoff die selektive cis-Dihydroxylierung von C=C-Doppelbindungen in aromatischen und nicht-aromatischen Molekülen mit hohen Enantiomerenüberschüssen. Ihren natürlichen Ursprung finden diese Enzyme im ersten Schritt des Aromatenabbaus, wobei nach erfolgreicher Auflösung der Aromatizität das entstandene Dihydrodiol durch Intra- oder Extradiol-Dioxygenasen gespalten und dem Energiestoffwechsel zugeführt wird.127 Rund 25 % der Biomasse weltweit besteht aus aromatischen Verbindungen, worunter auch viele xenobiotische Substanzen fallen.128 Pharma-zeutika und Agrochemikalien weisen häufig sowohl aromatische als auch nicht-aromatische Heterozyklen bzw. Benzylringe in ihrer molekularen Struktur auf und bieten sich für den Abbau durch Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen an. Des Weiteren kann eine gezielte Modifizierung des aromatischen Motivs durch diese Biokatalysatoren einen möglichen Syntheseweg stark vereinfachen.129 Für eine Vielzahl von pharmakologischen Wirkstoffen wurden bereits Syntheserouten aufgezeigt, die von dem Motiv der cis-Cyclohexadiendiole ausgehen (s. Abbildung 1.10).130 Trotz ihrer vielseitigen Anwendung wurde das Potential der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen im Bereich der Wirkstoffsynthese bis heute noch nicht ausgeschöpft.131 Einleitung 15 Kibdelon269 Prostaglandin16,270 Codein271 Tamiflu®272 Poly(p-phenylen)136,137 Pinitol273,274 R = Br Pancratistin275 Vindolin-Analog276 Epipatidin277 R = Cl/Br (+)-Nangustin278 (+)-Montabuphin279 (+)-Brunsvigin135 R = I, CN, CO2H Pericosin A, B und C280 Abbildung 1.10: Überlick über biokatalytische Synthesen ausgehend von cis-Cyclohexadiendiol-Intermediaten (Reviews für weitere Recherche: 132–135) Neben der Anwendung im Pharmabereich können cis-Diole auch in der Polymerchemie verwendet werden, indem konduktive Polymere wie z. B. Poly(p-phenylen) durch die Polymerisierung von cis-Dihydrocatechol biokatalytisch hergestellt werden.136,137 1.2 Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen Zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen (EC 1) gehören neben einer Reihe von reduzierenden Enzymen auch oxidierende Enzyme, die Sauerstoff als Elektronendonor verwenden. Diese oxidierenden Enzyme kann man wiederum in drei Kategorien einteilen: Oxygenasen, Oxidasen und Peroxidasen. Vor allem Oxygenasen stellen wichtige Schlüsselenzyme im Katabolismus und beim Recycling von organischer Biomasse dar. Des Weiteren übernehmen sie wichtige Aufgaben wie Entgiftung und Abbau von Kohlenwasserstoffen sowie Xenobiotika. Die hohe Anpassungsfähigkeit für diese komplexe und vielfältige Aufgabe wird durch das große Substratspektrum und die breite Produktpalette dieser Enzyme eindrucksvoll gezeigt.138 Des Weiteren können Oxygenasen in Mono- und Dioxygenasen Einleitung 16 differenziert werden und verfügen über unterschiedliche katalytische Zentren, wobei Eisen-, Kupfer- und Flavin-abhängige Enzyme beschrieben sind. Die Häm-Gruppe und auch der verwendete Cofaktor (NADH/NADPH) stellen weitere Hilfsmittel zur Unterteilung dieser vielseitigen Enzymklasse dar. Im Fall der Eisen-abhängigen ROs ist keine Häm-Gruppe vorhanden und als initaler Elektronendonor wird der Cofaktor NADH verwendet. 1.2.1 Ursprung und Aufgabe in der Natur In 1968 entdeckten Gibson und Kollegen erstmals die Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs), welche auch als Ring-hydroxylierende Dioxygenasen bezeichnet werden und konnten nachweisen, dass eine direkte cis-Addition von molekularem Sauerstoff auf das Substrat Benzol erfolgt.139 In der Natur ist diese Reaktion eine Schlüsselreaktion zur Energiegewinnung von Bakterien, da sie den initialen Schritt im Abbau von aromatischen Molekülen darstellt (s. Abbildung 1.11). Abbildung 1.11: Mikrobieller Abbau von einfach substituierten aromatischen Substraten. Der erste Schritt im Abbau erfolgt durch ROs und resultiert in der Bildung eines Dihydrodiols (A Æ B: Dearomatisierung durch Rieske Nicht-Häm Dioxygenase (RO); B Æ C: Rearomatisierung durch cis-Diol Dehydrogenase (DD); C Æ D/E: Intra-/Extradiolringspaltung durch Extradiol- (ECDO) oder Intradiol- (ICDO) Dioxygenase; mod. nach 140) Die Bildung des Dihydrodiols B oder F erfolgt durch die cis-Dihydroxylierung einer C=C-Doppelbindung durch Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen. Im Weiteren wird durch eine cis-Diol Dehydrogenase (DD) die Rearomatisierung zu C herbeigeführt, wobei B durch Eliminierung von Wasser im Sauren ebenfalls rearomatisiert werden kann (H). Durch eine weitere Katalyse von C durch Intra- oder Extradiol-Catechol Dioxygenasen (ICDO/ECDO) findet die Ringöffnung zur cis,cis-Muconsäure (D, R = H) bzw. zum Semialdehyd (E, R = H) statt. Bei der Umsetzung von Nitrobenzol (A, R = Einleitung 17 NO2) mit einer Nitrobenzol Dioxygenase aus Comamonas sp. Stamm JS765 wurde ebenfalls die Bildung des Catechols G sowie die spontane Eliminierung von Nitrit beobachtet.141 Als Gegenstand zahlreicher Untersuchungen konnte bereits eine breite Palette an aromatischen Substraten (> 300) mit ROs zu chiralen cis-Dihydrodiolen umgesetzt werden.130,142,143 In den meisten Fällen wurde dabei eine hoher Enantioselektivität (> 98 %ee) beobachtet.144–146 Neben der cis-Dihydroxylierung katalysieren diese Enzyme noch eine Reihe weiterer Reaktionen und zeigen somit eindrucksvoll ihr hohe Flexibilität im Bereich der Chemo- und Regioselektivität. Bei Umsetzungen mit ROs konnten sowohl allylische Monohydroxylierungen147,18, Dihydroxylierungen148,149, Desaturierungen150, O- und N-Dealkylierungen150, Sulfxidierungen150, oxidative Zyklisierungen151 und Epoxidierungen152 beobachtet werden (s. Tabelle 1.3). Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen werden deshalb häufig als das Nicht-Häm Analogon zu den bereits gut erforschten Cytochrom P450 Monooxygenasen bezeichnet.138,144,153–156 Tabelle 1.3: Demonstration des Reaktionsraums der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (RO) anhand von ausgewählten Beispielen Reaktion RO-katalysierte Reaktion Relative Ausbeute Ref. Dihydroxylierung > 99 % 148,149 Allylische Monohydroxylierung 54-67 % 147,18 Desaturierung 42 % 150 N-/O-Dealkylierung > 99 % 150 Sulfoxidation > 99 % 150 Epoxidierung 1-3 % 152 Einleitung 18 Außerdem konnten mit der Carbazol 1,9a-Dioxyenase (CARDO) aus Pseudomonas sp. CA10 auch die Umsetzung von Heterozyklen wie Carbazol zu 2-Aminobiphenyl-2,3-diol und Dibenzofuran zu 2,2‘,3-Trihydroxyphenylbenzol gezeigt werden.157,281 Zusätzlich zu über 300 aromatischen Substraten wurden in jüngeren Unter-suchungen auch Umsetzungen von nicht-aromatischen Substraten beobachtet.146 So konnten von Seo und Kollegen die Bildung von Dihydrodiolen aus Flavonen und Isoflavonen mittels NDO zeigen.61,158 Grundsätzlich handelt es sich bei den Flavanoiden um interessante Moleküle, deren positiver Effekt auf die Gesundheit durch ihre antioxidative Wirkung bereits mehrfach gezeigt wurde.68,159,160 Weiterhin wird durch die selektive, biokatalytische Modifikation dieser ubiquitären Moleküle mittels eines bestimmten Hydroxylierungsmusters die Attraktivität dieser Substanzen für den Einsatz als Lebensmittelzusatzstoff erhöht. 1.2.2 Aufbau und Klassifizierung der Multikomponentensysteme Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen sind Multikomponentensysteme161, welche aus bis zu drei Komponenten aufgebaut sein können: (1) einer Reduktase, welche die Elektronen durch Oxidation des natürlichen Cofaktors NAD(P)H erhält, (2) einem Ferredoxin, das die Elektronen von der Reduktase sequenziell an die Oxygenase weiterleitet und (3) einer Oxygenase, bestehend aus α- und β-Untereinheit, welche die Sauerstoffaktivierung und Hydroxylierung des Substrates durchführt (s. Abbildung 1.12). Abbildung 1.12: Elektronentransfer im Multikomponentensystem Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen am Beispiel der cis-Dihydroxylierung von Naphthalen zu (+)-1R,2S-Naphthalendihydrodiol (mod. nach 144,162) Eine erste Klassifizierung der ROs basierend auf der Anzahl der Redoxpartner (Reduktase/Ferredoxin) und deren prosthetische Gruppen (FAD/FMN/[2Fe-2S]) wurde durch Batie und Kollegen vorgenommen.163 Bei dieser Einteilung hatte jedoch Einleitung 19 der Aufbau der katalytisch aktiven Dioxygenase keine Bedeutung. Im Rahmen von phylogenetischen Untersuchungen wurde deshalb eine weitere Verfeinerung der Klassifizierung basierend auf der Oxygenaseeinheit in Naphthalen-, Toluol/Biphenyl-, Benzoat- und Phthalat-Dioxygenasefamilien eingeführt.142,164 Im Fall der Naphthalen-, Toluol/Biphenyl-, Benzoat-Familie besteht die Quartärstruktur der Dioxygenase aus drei Heterodimeren, welche ihrerseits aus der katalytisch aktiven α-Untereinheit und der stabilisierenden β-Untereinheit bestehen.165 Die Phthalat-Familie hingegen weist in der Quartärstruktur lediglich αn-Untereinheiten auf.165 Da die Anzahl an neu endeckten Sequenzen durch die Metagenomik stetig steigt und die Einordnung in bestehende Klassifizierungen immer schwieriger wird, wurde von Chakraborty und Kollegen 2012 die Einordnung der ROs überarbeitet (s. Tabelle 1.4).166 Hierbei wurde die dynamische Einteilung von Kweon et al.167 als Grundlage verwendet und zusätzlich zur Sequenzhomologie der unterschiedlichen α-Untereinheiten und der Art der Redoxpartner auch der evolutionäre Ursprung der Dioxygenase zur Klassifizierung herangezogen. Tabelle 1.4: Klassifizierungsschema für Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (mod. nach 166,167) Klasse Struktur Beispiel Oxygenase Ferredoxin Reduktase Iα [2Fe-2S]Rsk* [Fe+2] - - FNRc+ [FAD/FMN] [NAD][2Fe-2S]Pl Phthalat Dioxygenase (P. cepacoa DB01) Iαβ β - Anilin Dioxygenase (Actinetobacter sp. YAA) IIα - - FNRn++ [2Fe-2S]Pl [FAD/FMN][NAD] - IIαβ β Benzoat 1,2-Dioxygenase (Acinetobacter sp. ADP1) IIIα - Rsk [2Fe-2S]Rsk FNRn [2Fe-2S]Pl [FAD/FMN][NAD] Carbazol 1,9a-Dioxygenase (P. resinovorans CA10) IIIαβ β Naphthalen Dioxygenase (Pseudomonas sp. NCIB 9816-4) IVα - Rsk [2Fe-2S]Rsk GR+++ [FAD-NAD] - IVαβ β Toluol Dioxygenase (Pseudomonas putida F1) Vαβ β 3F4S [3Fe-4S] GR [FAD-NAD] Phenanthren Dioxygenase (Nocardioides sp. KP7) VIαβ β Rub [Fe]Rub*** n. d. - VIIαβ - Pl [2Fe-2S]Pl** GR [FAD-NAD] - * [2Fe-2S]Rsk = Cys2His2-Koordination des Eisen-Schwefelclusters (Rieske type); * [2Fe-2S]Pl = Cys4-Koordination des Eisen-Schwefelclusters (Plant type); *** [Fe]Rub = Cys4-Koordination des Eisens (Rubredoxin); + FNRc = Ferredoxin-NAD Reduktase mit [2Fe-2S]Pl am C-Terminus; ++ FNRn = Ferredoxin-NAD Reduktase mit [2Fe-2S]Pl am N-Terminus; +++ GR = Glutathion Reduktase; n. d.: unbekannte Redoxpartner. α β F R Einleitung 20 Wie bereits aus der Klassifizierung der ROs hervorgeht, spielen Eisen-Schwefelcluster in der Familie der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen eine entscheidende Rolle beim Transport der Elektronen zum mononuklearen, katalytischen Eisen. Neben [3Fe-4S] Clustern sind bei den Dioxygenasen hauptsächlich [2Fe-2S] Eisen-Schwefelcluster vertreten.168 Diese können aufgrund ihrer Koordination in zwei unterschiedliche Gruppen eingeteilt werden: [2Fe-2S] aus Pflanzen werden über vier Cystein-Reste koordiniert, Rieske Eisen-Schwefelcluster hingegen über je zwei Histidine bzw. Cysteine. Ein konserviertes Sequenzmotiv CXHX17CX2H macht die Lokalisierung des Clusters möglich.169 Im Fall der Rieske [2Fe-2S] wird jeweils ein Eisen über zwei Histidine bzw. zwei Cysteine koordiniert. Hierbei verbleibt das Cystein-gebundene Eisen, unabhängig vom Redoxzustand des restlichen Clusters, als Fe3+ vorliegen, das Histidin-gebundene Eisen hingegen wird bei der Reduktion des Clusters zu Fe2+ reduziert (s. Abbildung 1.13 A).170,171 Abbildung 1.13: A Rieske Eisen-Schwefelcluster [2Fe-2S]Rsk mit der Koordination durch Cys2 und His2 (oben) und pflanzliches Eisenschwefelcluster [2Fe-2S]Pl mit der Koordination durch Cys4 (unten); B Katalytische Triade der Naphthalen Dioxygenase (PDB: 1O7N) mit His208 und His213, sowie Asp362 (Linien) und mononukleares Eisen (rot); mod. nach 172,173 Die Reduktionspotentiale der Rieske Cluster reichen von -150 bis - 50 mV und zählen zu den pH-unabhängigen, niedrigen Redoxpotentialen.174 Das katalytische Eisen wird in der α-Untereinheit der Oxygenase mittels einer His-His-Asp-Triade koordiniert. Diese Form der Koordination ist weit verbreitet und erstreckt sich von Extradiol-Catechol Dioxygenasen, α-Ketoglutarat-abhängigen Enzymen175 und Pterin-abhängigen Hydroxylasen bis hin zu den Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen. In Abbildung 1.13 B ist das katalytische Eisen der Naphthalen His208 His213 Asp362 B A Einleitung 21 Dioxygenase mit den koordinierenden Aminosäuren His208, His213 und Asp362 dargestellt.172 Der Abstand zwischen Eisen-Schwefelcluster und mononuklearem Eisen beträgt in der monomeren α-Untereinheit ~ 44 Å, bildet sich hingegen die Quartärstruktur aus, besteht zwischen dem [2Fe-2S] Cluster der benachbarten α-Untereinheit und dem katalytischen Eisen lediglich eine Distanz von ~ 12 Å. Dies legt die Vermutung nahe, dass der Elektronentransfer hauptsächlich über ein Zusammenspiel zweier α-Untereinheiten verläuft.169 Ein konservierter Aspartat-Rest fungiert hierbei sehr wahrscheinlich als Mediator für den Elektronentransport, indem Wasserstoffbrücken zwischen dem Histidin-Rest im Eisen-Schwefelcluster und einem Histidin-Rest in der Triade ausgebildet werden.176 Ein oder zwei Wassermoleküle vervollständigen die Koordinationssphäre des Eisen-Atoms.155,177 1.2.3 Mechanismus der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen Obwohl bereits diverse strukturelle und spektroskopische Untersuchungen178, sowie Experimente mit Substratanaloga durchgeführt wurden, ist der Mechanismus der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen immer noch nicht vollständig aufgeklärt (s. Abbildung 1.14).169 Abbildung 1.14: Möglicher Mechanismus der Dihydroxylierung durch Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (mod. nach 169) I II IIIa IIIb IV Einleitung 22 Die Herausforderungen liegen hierbei im sauerstoffsensitiven [2Fe-2S] Cluster und in der Abwesenheit eines eindeutig identifizierbaren Chromophors, wie es z. B. die Häm-Gruppe bei den P450-Monooxygenasen darstellt.169 Anhand der bereits publizierten Daten und weiteren mechanistischen Hypothesen154,179,180 ist ein möglicher Mechanismus für die Dihydroxylierung im Folgenden diskutiert. Als ersten Schritt im Mechanismus erfolgt die Bindung des Substrates Naphthalen, wodurch Wasser aus dem oktaedrisch koordinierten Eisen(II)-Komplex eliminiert wird (I). Durch die Bindung des Sauerstoffs und dem vom Rieske Cluster übertragenen Elektron auf das mononukleare Eisen entsteht ein Eisen(III)peroxid-Komplex (II), welcher nach Deprotonierung und Abspaltung von Wasser mittels röntgenkristallographischen Untersuchungen151 bereits beobachtet werden konnte. Ausgehend von diesem Komplex gibt es zwei mögliche Reaktionswege: (1) Die Spaltung der O-O-Bindung mit gleichzeitiger Substratoxidation führt zur Bildung eines Fe(IV)=O-Komplexes (IIIa), welcher als Analogon zum Komplex II in P450 Monooxygenasen beschrieben ist151 oder (2) die O-O-Spaltung findet vor der Oxidation des Substrates statt und führt zur Bildung eines Fe(V)=O(OH)-Komplexes (IIIb), welcher als Analogon zum Komplex I beschrieben ist.151 In beiden Fällen wird aus dem zunächst radikalischen Hydroxynaphthalen-Intermediat ein Eisen(III)-Alkoxyhydroxynaphthalen-Komplex (IV).154,179,180 Die Übertragung des zweiten Elektrons durch das Eisen-Schwefelcluster führt zur Reduktion des Eisens und zur Protonierung des Alkoxids, wodurch Naphthalen-Dihydrodiol als Produkt entlassen und der Ruhezustand des Enzyms wiederhergestellt wird. Ob die Bildung des Fe(IV)- bzw. Fe(V)-Komplexes im Fall der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen für die Katalyse überhaupt notwendig ist, bleibt jedoch eine offene Frage. In 2013 haben Liu und Kollegen mit der Synthese von Fe(III)-OOH-Komplexen gezeigt, dass diese Spezies ausreichend elektrophil ist, um direkt mit Naphthalen zu reagieren.181 Im Zusammenspiel mit der Proteinumgebung ist im aktiven Zentrum der ROs neben der vorliegenden Eisenspezies auch das [2Fe-2S] Cluster von zentraler Bedeutung. So ist die Sauerstoffaktivierung und Substrat-umsetzung nur dann möglich, wenn sowohl das Rieske Cluster auch als das mononukleare Eisen reduziert vorliegen und sich Substrat in der aktiven Tasche Einleitung 23 befindet.182 Durch weitere Untersuchungen mittels NIR-MCD2 konnten Konformationsänderungen des Eisen-Schwefelclusters durch unterschiedliche Redoxzustände beobachtet werden.178 Liegt das Rieske Cluster oxidiert vor, ist das Eisen(II) oktaedrisch mit einem schwachen, axialen Liganden koordiniert. Wird das Eisen-Schwefelcluster reduziert, wird der axiale Ligand stabilisiert, woraus eine stabilere Gesamtkoordination resultiert. Bei der Bindung des Substrates wird der oktaedrische Koordinationszustand in eine quadratisch pyramidale Geometrie mit der Koordinationszahl 5 überführt und Wasser wird eliminiert. Wird nun das Rieske Cluster reduziert, tritt eine Mischung unterschiedlicher Ligandenanordnung (1:2 Mischung aus trigonal bipyramidal und quadratisch pyramidal) um das Eisen auf. Dieses Konformationsänderungen führen dazu, dass vor der Bindung und Aktivierung des Sauerstoffs sowohl zwei Elektronen als auch das Substrat anwesend sein müssen. Dieser Mechanismus stellt somit sicher, dass keine reaktiven Sauerstoffspezies gebildet oder entlassen werden können. Obwohl der Mechanismus noch nicht vollständig aufgeklärt ist, konnte anhand einer Reihe von kristallografischen Untersuchungen die absolute Selektivität für die Bildung von cis-Diolen festgestellt werden. Neben zahlreichen anderen Kristallstrukturen wurde die Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 ebenfalls mit side-on bound Sauerstoff cokristallisiert (PDB: 1O7N), weshalb auf einen Angriff des Sauerstoffs von lediglich eine Seite der Doppelbindung geschlossen werden kann.183 1.2.4 Protein engineering der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen Protein engineering beschreibt die Veränderung einer existierenden Proteinstruktur, um eine Verbesserung hinsichtlich der Zielanwendung zu erreichen.184 Hierbei sind das rationale Proteindesign und die gerichtete Evolution zwei weit verbreitete Strategien. Auch im Bereich der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) gibt es zahlreiche Beispiele für erfolgreiches Protein-Engineering. Mittels der Naphtalen Dioxygenase (NDO) von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 konnten unter Zuhilfenahme der 19 vorhandenen Kristallstrukturen wichtige Positionen wie z. B. die Reste His208, His213 und Asp362 identifziert werden, welche für die Koordination des mononuklearen Eisens verantwortlich sind.172 Des 2 engl. für Nahinfrarotspektroskopie (NIR) gekoppelt mit magnetischem Röntgendichroismus (MCD) Einleitung 24 Weiteren wurde durch ortsgerichtete Mutagenese der essentielle Einfluss der Position 205 auf den Elektronentransfer durch Parales et al. (1999) beschrieben.176 Auch die Steuerung der Stereoselektivität für die Hydroxylierung von aromatischen Systemen durch die Position F352 wurde durch die Generierung von Punktvarianten ermittelt.185 Neben hydrophoben Aminosäuren (Ala, Gly, Val, Ile, Leu) wurde auch Threonin gegen Phenylalanin ausgetauscht und eine dem Wildtyp gegenläufige Regioselektivität beobachtet. Zusätzlich wurde von Seo und Kollegen die Position F224 als Schlüsselposition für die Erweiterung des Substratraumes hinsichtlich der Hydroxylierung von Flavonoiden über kristallographische Daten entdeckt.158 Mit einer Sättigungsmutagenese an dieser Position konnte ein Umsatz von 24 % des eingesetzten Flavanons zu 8-OH-(2S)-Flavanon mit der Variante F224Y beobachtet werden. Der teils starke Einfluss von einzelnen Positionen auf das Substratspektrum wird darüber hinaus am Beispiel der Biphenyl Dioxygenase (BPDO) von Burkholderia xenoverans LB400 deutlich.186 Als Ergebnis der gerichteter Evolution wurde eine Doppelvariante T335A/F336M generiert, welche ein wesentlich breiteres Panel an chlorierten Aromaten umsetzen konnte als der Wildtyp der BPDO. Auch bei der gerichteten Evolution der Toluol Dioxygenase (TDO) von Pseudomonas putida ML2 konnte hinsichtlich der Umsetzung von 4-Picolin zu 3-Hydroxy-4-Picolin eine 6-fache Steigerung zum Wildtyp-Enzym beobachtet werden.187 Mittels eines DNA Shuffling Ansatzes wurde außerdem die Aktivität der BPDO bezüglich einer Reihe von polyzyklischen Aromaten um bis zu 200-fach gegenüber dem Ursprungsenzym gesteigert.188 Des Weiteren zeigten Gally et al. (2015) mit der Untersuchung eines vielfältigen Substratpanels die hohe Flexibilität der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen bezüglich unterschiedlicher Terpengeometrien.189 Mit der Punktvariante M232A der Cumol Dioxygenase (CDO) aus Pseudomonas fluorescens IP01 konnte der Substratraum der ROs auf nicht-planare, nicht-aromatische Moleküle ausgeweitet werden. Hierbei wurden neben der regio- und stereoselektiven Hydroxylierung des Monoterpenes R-Limonen zu 1R,5S-Carveol (> 98 %ee) auch die Dihydroxylierung des sphärischen Monoterpens (+)-α-Pinen mit einer Produktbildung von 33 ± 7 % beobachtet. Der deutliche Einfluss der Geometrie der aktiven Tasche der RO konnte auch bei der Untersuchung des linearen Olefins Myrcen gezeigt werden. Hierbei wies die Punktvariante CDO_M232A das monohydroxylierte 2-Methyl-6- Einleitung 25 methylenocta-2,7-dien-1-ol als Hauptprodukt auf, wohingegen bei der Umsetzung von Myrcen mit dem NDO Wildtyp eine Mischung aus 1,2- und 3,10-Dihydroxymyrcen beobachtet wurde. Neben unterschiedlichen Mutageneseansätzen, konnte für nah verwandte Dioxygenasen wie NDO und 2-Nitrotoluol Dioxygenase bzw. 2,4-Dinitrotoluol Dioxygenase weiterhin gezeigt werden, dass Hybride zwischen α- und β-Untereinheiten der unterschiedlichen Enzyme eine veränderte Substratspezifität aufweisen.190,191 Auch mit dem Austausch der β-Untereinheit der Toluol Dioxygenase durch die β-Untereinheit der Toluat Dioxygenase bzw. anderen Biphenyl Dioxygenasen wurde eine Veränderung des Substratspezifität beobachtet.192–195 Daher stellen auch die Kombination der einzelnen Teile der Multikomponentensysteme wichtige Stellschrauben für das protein engineering dar.196 1.3 Motivation Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) sind in mehrfacher Hinsicht interessante Biokatalysatoren mit einem breiten Anwendungsbereich. Diese effizienten Multienzymkomplexe katalysieren in Bakterien den ersten Schritt im Abbau von Aromaten und stellen somit wichtige Schlüsselenzyme für die Energiegewinnung und die Erschließung von C-Quellen dar. Grundsätzlich ist die gezielte Oxy-funktionalisierung von Kohlenwasserstoffen eine sehr interessante und nützliche Reaktion in der Chemie. Als Biokatalysatoren mit breitem Substratspektrum und vielseitigem Reaktionsraum sind ROs deshalb eine potentielle Alternative zur klassischen Chemie (Sharpless AD). Ziel dieser Arbeit war ein besseres Verständnis der Steuerung der Reaktions- und Substratspezifität, sowie der Regio- und Stereoselektivität der Naphthalen Dioxygenase (NDO) aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 zu generieren. Als Vertreter für die große Familie der ROs wurde die NDO ausgewählt, da bereits zahlreiche Kristallstrukturen dieses Enzyms vorliegen, welche für einen semi-rationalen Designansatz notwendig sind. Durch die systematische Analyse der aktiven Tasche sollten wichtige Struktur-/Funktionszusammenhänge identifiziert werden. Des Weiteren sollte eine Erweiterung des Substratraumes hinsichtlich der Umsetzung von nicht-planaren, nicht-aromatischen Substraten erreicht werden. Zum Erreichen Einleitung 26 dieses Ziels sollte zunächst die heterologe Expression des Biokatalystors in Escherichia coli sowohl in vitro als auch in vivo optimiert und im Weiteren der Einfluss von Enzymvarianten auf ein geeignetes Substratpanel untersucht werden. Material und Methoden 27 2 Material und Methoden 2.1 Verwendete Geräte, Chemikalien und Verbrauchs- materialen In dieser Arbeit verwendete Chemikalien wurden in mindestens analysenreiner Qualität von den Firmen Sigma Aldrich (Steinheim, DE), Carl Roth (Karlsruhe, DE), Merck sowie VWR (Darmstadt, DE), Alfa Aesar (Karlsruhe, DE) und Serva (Heidelberg, DE) bezogen. In Tabelle 2.1 sind gesondert verwendete Chemikalien aufgelistet. Tabelle 2.1: Verzeichnis der verwendeten Chemikalien Verwendung Chemikalie Herkunft Detektion von DNA peqGREEN Fluoreszenzfarbstoff VWR, Erlangen, DE Ladepuffer für Agarosegelelektrophorese 6x DNA-Ladepuffer Thermo Fisher Scientific, Waltham, US Größenstandard für Agarosegelelektrophorese GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, DE Größenstandard für SDS-PAGE PageRulerTM Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, DE Sekundärer Antikörper Pierce® Goat Anti-Rabbit lgG, Peroxidase conjugated Thermo Fisher Scientific, Waltham, US In Tabelle 2.2 sind die in der Arbeit verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien aufgelistet. Tabelle 2.2: Verzeichnis der verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien Verwendung Gerät Herkunft Expression Inkubationsschüttler Multitron/Pro Infors AG, Bottmingen, CH Multifors 2 Parallelbioreaktoren Infors AG, Bottmingen, CH Proteinreinigung His GraviTrapTM Talon®-Säulen GE Healthcare, Chicago, US Dialyse Vivaspin® Zentrifugalkonzentratoren Sartorius, Göttingen, DE Zentrifugation Eppendorf Zentrifuge 5416 Eppendorf AG, Hamburg, DE Inkubation von Reaktionsansätzen Eppendorf Thermomixer comfort Eppendorf AG, Hamburg, DE Detektion von Chemilumineszenz Fusion-SL-Dokumentationssystem Vilber Lourmat, Eberhardzell, DE 2.2 Verwendete Enzyme, Plasmide und Oligonukleotide In Tabelle 2.3 sind die in der Arbeit verwendeten Enzyme und Kits aufgeführt. Material und Methoden 28 Tabelle 2.3: Verzeichnis der verwendeten Enzyme und Kits Verwendung Enzym/Kit Herkunft Ortsgerichtete Mutagenese KOD HotStart-Polymerase Novagen®, Darmstadt, DE Restriktion DpnI, NcoI, HindIII, NdeI, XmaJI Thermo Fisher Scientific, Waltham, US Isolierung von Plasmid-DNA ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit Zymo Research, Irvine, US Aufreinigung von Plasmid-DNA DNA Clean and ConcentratorTM Zymo Research, Irvine, US Bestimmung der Proteinkonzentration PierceTM BCATM Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, US Gelextraktion von DNA ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit Zymo Research, Irvine, US In der vorliegenden Arbeit wurde mit den in Tabelle 2.4 beschriebenen Plasmiden gearbeitet. Tabelle 2.4: Verzeichnis der verwendeten Plasmide Plasmid Größe [bp] Charakteristik Herkunft pDTG141 6192 AmpR Gencluster aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 nahAaAbAcAd (nahAa: Reduktase; nahAb: Ferredoxin; nahAc: α-Untereinheit der Oxygenase; nahAd: β-Unter-einheit der Oxygenase) T7-Promotor; Plasmidrückgrat von pT7-5 197 pT7-7 2481 AmpR T7-Promotor; Replikationsursprung ColE1 198 pIP107D 7670 AmpR Gencluster aus Pseudomonas fluorescens IP01 cumA1A2A3A4 (cumA1: α-Untereinheit der Oxygenase, cumA2: β-Untereinheit der Oxygenase, cumA3: Ferredoxin, cumA4: Reduktase) lac-Promotor; Plasmidrückgrat von pUC118 199 pJRM501 8276 AmpR, TetR Gencluster der Benzol Dioxygenase aus Pseudomonas putida ML2 bedC1C2BA (bedC1: α-Untereinheit der Oxygenase, bedC2: β-Untereinheit der Oxygenase, bedB: Ferredoxin, bedA: Reduktase) tac-Promotor; Plasmidrückgrat von pKK223-3 199 Material und Methoden 29 pT7_BPDO 6576 AmpR Gencluster der Biphenyl Dioxygenase aus Burkholderia xenoverans LB400 bphA1A2A3A4 (bphA1: α-Untereinheit der Oxygenase, bphA2: β-Untereinheit der Oxygenase, bphA3: Ferredoxin, bphA4: Reduktase) T7-Promotor; Plasmidrückgrat von pT7-5 GeneArt®, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US pDTG601 AmpR Gencluster der Toluol Dioxygenase aus Pseudomonas putida todC1C2BA (todC1: α-Untereinheit der Oxygenase, todC2: β-Untereinheit der Oxygenase, todA: Ferredoxin, todB: Reduktase) T7-Promotor; Plasmidrückgrat von pT7-5 200 pQE31_ NahAcAd 5386 Amp R pQE31_NahAcAd mit N-terminalem His-Tag an der α-Untereinheit der NDO T5-Promotor; Plasmidrückgrat von pQE31 Vorarbeiten am ITB pQE31_NahAb 3752 AmpR pQE31_NahAb mit N-terminalem His-Tag am Ferredoxin der NDO T5-Promotor; Plasmidrückgrat von pQE31 Vorarbeiten am ITB pQE31_NahAa 4424 AmpR pQE31_NahAa mit N-terminalem His-Tag an der Reduktase der NDO T5-Promotor; Plasmidrückgrat von pQE31 Vorarbeiten am ITB pETDuetTM-1 5420 AmpR 2x T7-Promotor; Replikationsursprung ColE1 Novagen®, Darmstadt, DE pCOLADuetTM-1 3719 KanR 2x T7-Promotor; Replikationsursprung ColA Novagen®, Darmstadt, DE pETDuet_ NahAaAb 6516 Amp R Reduktase und Ferredoxin der NDO T7-Promotor; Plasmidrückgrat von pETDuetTM-1 Diese Arbeit pETDuet_ NahAa 6334 s. pETDuet_NahAaAb ohne Ferredoxin Diese Arbeit pCOLADuet_ NahAcAd 5453 Kan R α- und β-Untereinheit der NDO T7-Promotor; Plasmidrückgrat von pCOLADuetTM-1 Diese Arbeit pCOLADuet_NahAc 5001 s. pCOLADuet_NahAcAD ohne β-Untereinheit Diese Arbeit Im nachfolgenden Abschnitt sind die Plasmidkarten der in der Arbeit verwendeten Konstrukte dargestellt (s. Abbildung 2.1-6). Die Gensequenzen befinden sich im Anhang unter Kapitel 6.1. Material und Methoden 30 Abbildung 2.1: Plasmidkarte von pT7-7 (Leervektor mit 2481 bp; T7-Promotor: 2318-2337 bp, RBS: 2384-2389 bp, MCS: 2397-2455 bp, AmpR: 42-902 bp, ColE1 ori: 1207-1826 bp)198 und pDTG141 mit dem Gencluster der Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 (6192 bp; T7-Promotor: 6151-6170 bp, nahAa: 317-1303 bp, nahab: 1447-1761 bp, nahAc: 1832-3181 bp, nahAd: 3196-3780 bp, AmpR: 3930-4790 bp)197 Abbildung 2.2: Plasmidkarte von pIP107D mit dem Gencluster der Cumol Dioxygenase aus Pseudomonas fluorescens IP01 (7670 bp; lac-Promotor: 143-172 bp, cumA1: 284-1663 bp, cumA2: 1878-2483 bp, cumA3: 3231-3560 bp, cumA4: 3557-4792 bp, AmpR: 5870-6730 bp)199 und pJRM501 mit dem Gencluster der Benzen Dioxygenase aus Pseudomonas putida ML2 (8276 bp; tac-Promotor: 43-71 bp, bedA: 4646-5878 bp, bedB: 5878-6201 bp, bedC1: 6904-8256 bp, bedC2: 6210-6773 bp, TetR: 267-1157 bp, AmpR: 3177-4037 bp)199 Material und Methoden 31 Abbildung 2.3: Plasmidkarte von pT7_BPDO mit dem Gencluster der Biphenyl Dioxygenase aus Burkholderia xenoverans LB400 (6576 bp; T7-Promotor: 2318-2337 bp, RBS: 2384-2388 bp, bphA1: 2398-3777 bp, bphA2: 3815-4455 bp, bphA3: 4994-5323 bp, bphA4: 5320-6546 bp, AmpR: 45-902 bp) von GeneArt® und pQE31_NahAcAd mit der His-getaggten α- und β-Untereinheit der Naphthalen Dioxygenase (5386 bp; T5-Promotor: 7-87 bp, NahAcHis: 115-1512 bp, NahAb: 1527-2111 bp, AmpR: 4321-5181 bp) Abbildung 2.4: Plasmidkarte von pQE31_NahAb mit dem N-terminal His-getaggten Ferredoxin der Naphthalen Dioxygenase (3752 bp; T5-Promotor: 7-87 bp, NahAbHis: 115-1512 bp, AmpR: 2687-3547 bp) und pQE31_NahAa mit der N-terminal His-getaggten Reduktase der Naphthalen Dioxygenase (4424 bp; T5-Promotor: 7-87 bp, NahAaHis: 115-1149 bp, AmpR: 3359-4219 bp) Material und Methoden 32 Abbildung 2.5: Plasmidkarte von pETDuetTM-1 (Leervektor mit 5420 bp; T7-Promotor-1: 5404-5420 bp, MCS-1: 69-168 bp, T7-Promotor-2: 214-230 bp, MCS-2: 297-438 bp, ColE1 ori: 547-994 bp, AmpR: 1119-1976 bp) und pETDuet_NahAaAb mit der Reduktase und Ferredoxin der Naphthalen Dioxygenase (6516 bp; T7-Promotor-1: 6500-2 bp, NahAa: 71-1057 bp, T7-Promotor-2: 1128-1146 bp, NahAb: 1214-1528 bp, AmpR: 2212-3072 bp) Abbildung 2.6: Plasmidkarte von pCOLADuetTM-1 (Leervektor mit 3719 bp; T7-Promotor-1: 3730-3719 bp, MCS-1: 68-168 bp, T7-Promotor-2: 214-230 bp, MCS-2: 297-438 bp, ColA ori: 1664-2299 bp, KanR: 739-1554 bp) und pETDuet_NahAcAd mit α- und β-Untereinheit der Naphthalen Dioxygenase (5453 bp; T7-Promotor-1: 5437-2 bp, NahAc: 75-1424 bp, T7-Promotor-2: 1496-1514 bp, NahAd: 1582-2166 bp, KanR: 2473-3288 bp) Material und Methoden 33 Oligonukleotide Sämtliche in der Arbeit beschriebenen Oligonukleotide wurden von Metabion International AG (Planegg, DE) synthetisiert. In Tabelle 2.5 sind die für die ortspezifische Mutagenese verwendeten Oligonukleotide basierend auf der Templat-DNA pDTG141 dargestellt. Tabelle 2.5: Verzeichnis der für die ortspezifische Mutagenese verwendeten Oligonukleotide (basierend auf Distanz zum cokristallisierten Substrat Inden in PDB 1O7N (4 - 6 Å), Hydrophobizität der ausgetauschten Aminosäuren (G/A/V/I) und sterischen Effekten; Austausch in fett dargestellt) Pos. Name Sequenz in 5’ Æ 3’ (Primer forward/Primer reverse) 1 JDE_NDO_F202G CCC GCG GAA AAC GGT GTG GGA GAT GCA TAC/ GTA TGC ATC TCC CAC ACC GTT TTC CGC GGG 2 JDE_NDO_F202A CCC GCG GAA AAC GCT GTG GGA GAT GCA TAC/ GTA TGC ATC TCC CAC AGC GTT TTC CGC GGG 3 JDE_NDO_F202V CCC GCG GAA AAC GTT GTG GGA GAT GCA TAC/ GTA TGC ATC TCC CAC AAC GTT TTC CGC GGG 4 JDE_NDO_F202I CCC GCG GAA AAC ATT GTG GGA GAT GCA TAC/ GTA TGC ATC TCC CAC AAT GTT TTC CGC GGG 5 JDE_NDO_H295A GGA TTT ATC GCA GCG CCC TCA ACT GCA CCG/ CGG TGC AGT TGA GGG CGC TGC GAT AAA TCC 6 JDE_NDO_H295V GGA TTT ATC GCA GCG TCC TCA ACT GCA CCG/ CGG TGC AGT TGA GGA CGC TGC GAT AAA TCC 7 JDE_NDO_H295I GGA TTT ATC GCA GCA TCC TCA ACT GCA CCG/ CGG TGC AGT TGA GGA TGC TGC GAT AAA TCC 8 JDE_NDO_N297A C AGC CAC CTC GCC TGC ACC GTT TTC CCG AAC/ GTT CGG GAA AAC GGT GCA GGC GAG GTG GCT G 9 JDE_NDO_N297V C AGC CAC CTC GTC TGC ACC GTT TTC CCG AAC/ GTT CGG GAA AAC GGT GCA GAC GAG GTG GCT G 10 JDE_NDO_N297I C AGC CAC CTC ATC TGC ACC GTT TTC/ GAA AAC GGT GCA GAT GAG GTG GCT G 11 JDE_NDO_F352A CTG TTC AGC GAA CGG CAG GGC CTG CTG/ CAG CAG GCC CTG CCG TTC GCT GAA CAG 12 JDE_NDO_F352V GTT CAG CGA ACG GTG GGG CCT GCT GGC TTC/ GAA GCC AGC AGG CCC CAC CGT TCG CTG AAC 13 JDE_NDO_F352I GTT CAG CGA ACG ATT GGG CCT GCT GGC TTC/ GAA GCC AGC AGG CCC AAT CGT TCG CTG AAC 14 JDE_NDO_A206G CTT TGT GGG AGA TGG ATA CCA CGT GGG TTG/ CAA CCC ACG TGG TAT CCA TCT CCC ACA AAG 15 JDE_NDO_A206V CTT TGT GGG AGA TGT ATA CCA CGT GGG TTG/ CAA CCC ACG TGG TAT ACA TCT CCC ACA AAG 16 JDE_NDO_A206I CTT TGT GGG AGA TAT ATA CCA CGT GGG TTG/ CAA CCC ACG TGG TAT ATA TCT CCC ACA AAG 17 JDE_NDO_V209A GAG ATG CAT ACC ACG AGG GTT GGA C/ G TCC AAC CCT CGT GGT ATG CAT CTC 18 JDE_NDO_V209G GAG ATG CAT ACC ACG GCG GTT GGA CGC/ GCG TCC AAC CGC CGT GGT ATG CAT CTC 19 JDE_NDO_V209I GAG ATG CAT ACC ACA TTG GTT GGA CGC ACG/ CGT GCG TCC AAC CAA TGT GGT ATG CAT CTC Material und Methoden 34 20 JDE_NDO_L253A GGC ATG GGT GTG GCG TGG GAC GGA TAT TCA GG/ CC TGA ATA TCC GTC CCA CGC CAC ACC CAT GCC 21 JDE_NDO_L253V GGC ATG GGT GTG GTG TGG GAC GGA TAT TCA GG / CC TGA ATA TCC GTC CCA CAC CAC ACC CAT GCC 22 JDE_NDO_L253I GGC ATG GGT GTG ATC TGG GAC GGA TAT TCA GG/ CC TGA ATA TCC GTC CCA GAT CAC ACC CAT GCC 23 JDE_NDO_L307A CAA CAG CAT GGT GAC CTG CTC GGG TG/ CA CCC GAG CAG GTC ACC ATG CTG TTG 24 JDE_NDO_L307V CAA CAG CAT GGT CAC CTG CTC GGG TG/ CA CCC GAG CAG GTG ACC ATG CTG TTG 25 JDE_NDO_L307I CAA CAG CAT GAT TAC CTG CTC GGG TG/ CA CCC GAG CAG GTA ATC ATG CTG TTG 26 JDE_NDO_G204A GAA AAC TTT GTG GCT GAT GCA TAC CAC GTG/ CAC GTG GTA TGC ATC AGC CAC AAA GTT TTC 27 JDE_NDO_G204V GAA AAC TTT GTG GTG GAT GCA TAC CAC/ GTG GTA TGC ATC CAC CAC AAA GTT TTC 28 JDE_NDO_G204I GAA AAC TTT GTG ATT GAT GCA TAC CAC GTG/ GAA AAC TTT GTG ATT GAT GCA TAC CAC GTG 29 JDE_NDO_F224A TCG GGG GAG TCT ATC GCC TCG TCG CTC GCT GGC/ GCC AGC GAG CGA CGA GGC GAT AGA CTC CCC CGA 30 JDE_NDO_F224V TCG GGG GAG TCT ATC GTC TCG TCG CTC GCT GGC/ GCC AGC GAG CGA CGA GAC GAT AGA CTC CCC CGA 31 JDE_NDO_F224I TCG GGG GAG TCT ATC ATC TCG TCG CTC GCT GGC/ GCC AGC GAG CGA CGA GAT GAT AGA CTC CCC CGA 32 JDE_NDO_V260A GGA TAT TCA GGT GCG CAT AGC GCA GAC TTG/ CAA GTC TGC GCT ATG CGC ACC TGA ATA TCC 33 JDE_NDO_V260G GGA TAT TCA GGT GGG CAT AGC GCA GAC TTG/ CAA GTC TGC GCT ATG CCC ACC TGA ATA TCC 34 JDE_NDO_V260I GGA TAT TCA GGT ATC CAT AGC GCA GAC TTG/ CAA GTC TGC GCT ATG GAT ACC TGA ATA TCC 35 JDE_NDO_W358A CTG CTG GCT TCG CGG AAA GCG ACG ACA ATG/ CAT TGT CGT CGC TTT CCG CGA AGC CAG CAG 36 JDE_NDO_W358V CTG CTG GCT TCG TGG AAA GCG ACG ACA ATG/ CAT TGT CGT CGC TTT CCA CGA AGC CAG CAG 37 JDE_NDO_W358I CTG CTG GCT TCA TTG AAA GCG ACG ACA ATG/ CAT TGT CGT CGC TTT CAA TGA AGC CAG CAG In Tabelle 2.6 sind die für die ortspezifische Mutagenese verwendeten Oligonukleotide basierend auf der Templat-DNA pQE31_NahAcAd dargestellt. Tabelle 2.6: Verzeichnis der für die ortspezifische Mutagenese verwendeten Oligonukleotide (basierend auf der Konsensussequenz der „Iron sulfur proteins - Bet v1-like“-3DM-Datenbank von BioProdict) Pos. Name Sequenz in 5’ Æ 3’ (Primer forward/Primer reverse) 1 JDE_NDO_A197F C AAC TGG AAG TTT CCC GCG GAA AAC/ GTT TTC CGC GGG AAA CTT CCA GTT G 2 JDE_NDO_P198A C TGG AAG GCA GCC GCG GAA AAC TTT G/ CAA AGT TTT CCG CGG CTG CCT TCC AG 3 JDE_NDO_V203C CG GAA AAC TTT TGC GGA GAT GCA TAC C/ G GTA TGC ATC TCC GCA AAA GTT TTC CG 4 JDE_NDO_V203A CG GAA AAC TTT GCG GGA GAT GCA TAC C/ G GTA TGC ATC TCC CGC AAA GTT TTC CG Material und Methoden 35 5 JDE_NDO_G204S G GAA AAC TTT GTG AGC GAT GCA TAC CAC/ GTG GTA TGC ATC GCT CAC AAA GTT TTC C 6 JDE_NDO_L217I C GCG TCT TCG ATT CGC TCG GGG GAG/ CTC CCC CGA GCG AAT CGA AGA CGC G 7 JDE_NDO_R218L CG TCT TCG CTT CTC TCG GGG GAG TC/ GA CTC CCC CGA GAG AAG CGA AGA CG 8 JDE_NDO_S219A CT TCG CTT CGC GCG GGG GAG TCT ATC/ GAT AGA CTC CCC CGC GCG AAG CGA AG 9 JDE_NDO_M242F CA GGC TTG CAA TTC ACC TCC AAA TAC GGC/ GCC GTA TTT GGA GGT GAA TTG CAA GCC TG 10 JDE_NDO_T243R GC TTG CAA ATG CGC TCC AAA TAC GGC/ GCC GTA TTT GGA GCG CAT TTG CAA GC 11 JDE_NDO_S244A C TTG CAA ATG ACC GCC AAA TAC GGC AGC/ GCT GCC GTA TTT GGC GGT CAT TTG CAA G 12 JDE_NDO_S248H C TCC AAA TAC GGC CAC GGC ATG GGT GTG/ CAC ACC CAT GCC GTG GCC GTA TTT GGA G 13 JDE_NDO_M250S GGC AGC GGC AGC GGT GTG TTG TG/ CA CAA CAC ACC GCT GCC GCT GCC 14 JDE_NDO_L253F GG CAT GGG TGT GTT TTG GGA CGG ATA TTC/ GAA TAT CCG TCC CAA AAC ACA CCC ATG CC 15 JDE_NDO_W254F C ATG GGT GTG TTG TTT GAC GGA TAT TCA G/ C TGA ATA TCC GTC AAA CAA CAC ACC CAT G 16 JDE_NDO_N297H CGC AGC CAC CTC CAC TGC ACC GTT TTC CCG/ CGG GAA AAC GGT GCA GTG GAG GTG GCT GCG 17 JDE_NDO_V300I CTC AAC TGC ACC ATT TTC CCG AAC AAC/ GTT GTT CGG GAA AAT GGT GCA GTT GAG 18 JDE_NDO_C309G GC ATG CTG ACC GGC TCG GGT GTT TTC/ GAA AAC ACC CGA GCC GGT CAG CAT GC 19 JDE_NDO_S310T G CTG ACC TGC ACC GGT GTT TTC AAA G/ C TTT GAA AAC ACC GGT GCA GGT CAG C 20 JDE_NDO_K314R CG GGT GTT TTC CGT GTA TGG AAC CCG/ CGG GTT CCA TAC ACG GAA AAC ACC CG 21 JDE_NDO_N317H C AAA GTA TGG CAC CCG ATC GAC GC/ GC GTC GAT CGG GTG CCA TAC TTT G 22 JDE_NDO_S360Q GC TTC TGG GAA CAG GAC GAC AAT GAC/ GTC ATT GTC GTC CTG TTC CCA GAA GC 23 JDE_NDO_N363G GAA AGC GAC GAC GGT GAC AAT ATG G/ C CAT ATT GTC ACC GTC GTC GCT TTC 24 JDE_NDO_D364E GC GAC GAC AAT GAA AAT ATG GAA ACA G/ C TGT TTC CAT ATT TTC ATT GTC GTC GC 25 JDE_NDO_M366W C AAT GAC AAT TGG GAA ACA GCT TCG/ CGA AGC TGT TTC CCA ATT GTC ATT G In Tabelle 2.7 sind die für die Klonierungsarbeiten via gibson assembly benötigten Oligonukleotide aufgelistet. Material und Methoden 36 Tabelle 2.7: Verzeichnis der die für die Klonierungsarbeiten via gibson assembly (ga) benötigten Oligonukleotide (fw: Primer forward; rv: Primer reverse) Pos. Name Sequenz in 5’ Æ 3’ Verwendung 1 JDE_pCOLA_Ac_fw ACTTTAATAAGGAGATATACCATGGATG AATTACAATAATAAAATCTTGGTAAG Amplifizierung von NahAc für ga in pCOLADuet 2 JDE_pCOLA_Ac_rv TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTA GCGATCAGTAGTCTTC 3 JDE_pCOLA_Ad_fw GTATAAGAAGGAGATATACATATG ATGATCAATATTCAAGAAGAC Amplifizierung von NahAd für ga in pCOLADuet 4 JDE_pCOLA_Ad_rv TGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCTAGGTCA CAGAAAGACCATCAG 5 JDE_pETDuet_Aa_fw ACTTTAAGAAGGAGATATACCATGG AACTCCTCATACAACC Amplifizierung von NahAa für ga in pETDuet 6 JDE_pETDuet_Aa_rv TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTCA GATCCCACCGGGATAG 7 JDE_pETDuet_Ab_fw GTATAAGAAGGAGATATACATATG ACAGTAAAGTGGATTGAAG Amplifizierung von NahAb für ga in pETDuet 8 JDE_pETDuet_Ab_rv TGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCTAGGTTA GCTCAAATCAATCATTACG In Tabelle 2.8 sind die für die Sequenzierung der hergestellten Plasmide benötigten Oligonukleotide aufgelistet. Tabelle 2.8: Verzeichnis der für die Sequenzierung der hergestellten Plasmide benötigten Oligonukleotide (Sequenzierung durchgeführt durch GATC Biotech, Konstanz, DE) Pos. Name Sequenz in 5’ Æ 3’ Verwendung 1 CGA_pDTG141_1 GCCGACGAAATTGTCACTCAC Sequenzierung von pDTG141 2 CGA_pDTG141_2 GCGATGGTTGAAGCGTTG 3 CGA_pDTG141_3 GGTAAGTGAATCTGGTCTGAGC 4 CGA_pDTG141_4 GCAAATGACCTCCAAATACGG 5 CGA_pDTG141_5 CTCCAACTGGGCTGAGTTC 6 CGA_pDTG141_6 AAGCATTGGTAACTGTCAGACC 7 JDE_pETDuet_seq1 CGATCTTCCCCATCGGTGATG Sequenzierung von Duetvektoren 8 JDE_pETDuetA4A3_seq2 GTGAGCATCGGTGCAGAAC 9 JDE_pCOLA_seq1 CATTCGATGGTGTCCGGGATC 10 JDE_pCOLAA1A2_seq2 GGTGTATTGTCCAGCCTCC 11 JDE_pCOLAA1A2_seq3 GGCAGATCTATGAGCCGAG 12 JDE_pETDuetAaAb_seq2 GCGATTGCACAAACTCGCC 13 JDE_pCOLAAcAd_seq2 CAGGCTTGCAAATGACCTCC 14 JDE_pCOLAAcAd_seq3 CCACGACTCTGCTTTGCAAC 15 JDE_pETDuetAaAb_seq3 GTTCCGATTTAGTGCTTTACGGC 16 JDE_pETDuetAaAb_seq4 GGCAGCACTGCATAATTCTCTTAC Weitere Sequenzierprimer sind der Doktorarbeit von Christine Gally (2016) zu entnehmen.201 Die generierten, mutagenen Plasmide sind im Anhang in Kapitel 6.2 beschrieben. Material und Methoden 37 2.3 Verwendete Mikroorganismen In Tabelle 2.9 sind die in der Arbeit verwendeten Escherichia coli - Wildtypstämme aufgeführt. Tabelle 2.9: Verzeichnis der verwendeten Escherichia coli - Wildtypstämme Bezeichnung Genotyp Herkunft E. coli XL-1 blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F ́ proAB lacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr)] Agilent Technologies Deutschland GmbH & Co. KG, Waldbronn, DE E. coli DH5α F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1 Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA E. coli JM109(DE3) endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk–, mk+), relA1, supE44, λ–, Δ(lac-proAB), [F´, traD36, proAB, lacIqZΔM15], lDE3 Promega GmbH Mannheim, DE E. coli M15(pREP4) F-, Φ80ΔlacM15, thi, lac-, mtl-, recA+ , KmR Qiagen, Hilden, DE E. coli TunerTM(DE3)pLysS F– ompT hsdSB (rB– mB–) gal dcm lacY1(DE3) pLysS (CamR) Novagen®, Darmstadt, DE E. coli XL-1 blue und E. coli DH5α wurden für die Propagierung von Plasmiden während der molekularbiologischen Arbeiten verwendet. E. coli JM109(DE3) wurde zur Expression der in vivo Plasmide eingesetzt und E. coli M15(pREP4) zur Expression der His-getaggten Einzelkomponenten des Dioxygenasesystems. pREP4 führt hierbei zur Expression des lac-Repressor Proteins, wodurch eine genaue Steuerung des T5-Promotors ermöglicht wird. Um den Selektionsdruck für pREP4 aufrechtzuerhalten, wurde während der Kultivierung Kanamycin (cEnd: 25 μg/mLH2O) hinzugegeben. E. coli TunerTM(DE3)pLysS wurde zur Expression der auf Duetvektoren klonierten Naphthalen Dioxygenase verwendet. Dieser Stamm ermöglicht ein regulierbares Expressionslevel der Zielproteine durch die Variation der Induktorkonzentration (IPTG). Zusätzlich wird durch die Co-Expression von pLysS T7-Lysozym exprimiert, welches die basale Expression der T7-RNA Polymerase verhindert. 2.4 Verwendete Medien Alle Nährmedien wurden für 20 min bei 121 °C und 1 bar Überdruck autoklaviert. Zur Herstellung von festen Nährböden wurden dem Medium 15 g/L Agar hinzugefügt. Hitzeempfindliche Medienzusätze wie Antibiotika wurden mit einem Material und Methoden 38 0,2 µm Filter sterilfiltriert und nach Abkühlen des Nährmediums auf ~ 50 °C hinzugegeben. 2.4.1 Medien zur Anzucht von Escherichia coli Im Folgenden ist die Zusammensetzung der Komplexmedien zur Anzucht von Escherichia coli aufgeführt (s. Tabelle 2.10). Tabelle 2.10: Zusammensetzung der Komplexmedien zur Anzucht von Escherichia coli und die verwendeten Medienzusätze Bezeichnung Bestandteile Konzentration Luria Bertani-Medium (LB) Trypton 10 g/L Hefeextrakt 5 g/L Natriumchlorid 5 g/L Ampicillin 100 µg/mL Terrific Broth-Medium (TB) Trypton 12 g/L Hefeextrakt 24 g/L Glycerin 5 g/L Kaliumphosphatpuffer (10x)* 89 mM (1x) Ampicillin 100 µg/mL Kaliumphosphatpuffer (10x) KH2PO4 (0,17 M) 23,1 g/L K2HPO4 (0,72 M) 125,4 g/L *Die Stammlösung des Kaliumphosphatpuffers wurde separat autoklaviert und dem sterilen Medium hinzugefügt. In Tabelle 2.11 ist die Zusammensetzung des Minimalmediums zur Anzucht von rekombinanten E. coli-Zellen beschrieben.202 Das vollständige Medium besteht aus vier separat hergestellten Lösungen. Tabelle 2.11: Zusammensetzung des Minimalmediums (MSB) zur Anzucht von rekombinanten Escherichia coli-Zellen Bezeichnung Bestandteile Konzentration Lösung A KH2PO4 136,1 g/L Na2HPO4 . 2 H2O 177,99 g/L Lösung B Nitrilotriessigsäure 10 g/L Kaliumhydroxid 7,5 g/L MgSO4 . 7 H2O* 29,6 g/L CaCl2 . 2 H2O* 3,3 g/L (NH4)6Mo7O24 . 4 H2O 9,3 mg/L FeSO4 . 7 H2O 99 mg/L Metal solution 44 50 mL/L Material und Methoden 39 mit 10 M Natronlauge auf pH 6,8 einstellen Lösung C (NH4)2SO4 200 g/L Metal solution 44 EDTA 250 mg (100 mL) ZnSO4 . 7 H2O* 1095 mg FeSO4 . 7 H2O* 500 mg MnSO4 . H2O* 154 mg CuSO4 . 5 H2O* 39,2 mg Co(NO3)2 . 6 H2O* 24,8 mg Na2B4O7 . 10 H2O* 17,7 mg mit 3-4 Tropfen 1 M Schwefelsäure versetzen *Salze separat in destilliertem Wasser lösen Zur Fertigstellung des Mediums wurden die folgende Anteile der Lösungen zu sterilem, bistdestillierten Wasser hinzugegeben: 5,16 % A, 2,58 % B und 1,94 % C. 2.4.2 Allgemeine Puffer und Lösungen In Tabelle 2.11 sind die in der Arbeit verwendeten, allgemeinen Puffer und Lösungen aufgelistet. Tabelle 2.12: Verzeichnis der in der Arbeit verwendeten, allgemeinen Puffer und Lösungen Bezeichnung Bestandteile Konzentration Assaypufferin vitro KH2PO4 50 mM K2HPO4 50 mM mittels pH-Elektrode auf pH 7 einstellen Glycerin 10 %(v/v) Dithiothreitol 10 mM Assaypufferin vivo (pH 7,2) KH2PO4 100 mM K2HPO4 100 mM mittels pH-Elektrode auf pH 7,2 einstellen Glucose-Monohydrat 20 mM Ampicillin 100 µg/mL TFBI-Puffer (pH 5,8) Rubidiumchlorid 100 mM Mangan(II)-chlorid 50 mM Kaliumacetat 30 mM Calciumchlorid 10 mM Glycerin 15 %(v/v) mit Essigsäure auf pH 5,8 einstellen TFBII-Puffer (pH 8) MOPS 10 mM Rubidiumchlorid 10 mM Calciumchlorid 75 mM Glycerin 15 %(v/v) Material und Methoden 40 mit Kaliumhydroxid auf pH 8 einstellen TAE-Puffer Tris-Acetat (pH 8) 40 mM EDTA 1 mM 6x SDS-Ladepuffer Tris-HCl (pH 8) 350 mM Dithiothreitol 600 mM Glycerin 30 %(v/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) 10 %(w/v) Bromphenolblau 0,12 %(w/v) 10x SDS-Laufpuffer (pH 8,3) Tris 0,25 M Glycin 1,92 M Natriumdodecylsulfat (SDS) 1 %(w/v) Coomassie-Färbelösung Ethanol 30 %(v/v) Essigsäure 10 %(v/v) Coomassie Brilliantblue R-250 2,5 g/L Coomassie-Entfärbelösung Essigsäure 10 %(v/v) 10x Transferpuffer Tris 0,25 M Glycin 1,92 M 1x Transferpuffer 10x Transferpuffer 10 %(v/v) Methanol 20 %(v/v) 10x TBS-Puffer (7,4) Natriumchlorid 1,5 M Kaliumchlorid 0,03 M Tris 0,5 M mit HCl auf pH 7,4 einstellen 1x TBS-T 10x TBS 10 %(v/v) Tween 20 0,1 %(v/v) 2.5 Mikrobiologische Arbeiten 2.5.1 Stammhaltung Für die Herstellung von Glycerinkulturen wurden 500 µL einer ü/N-Kultur in ein steriles Kryoröhrchen gegeben, mit 500 µL einer sterilen Glycerin/Wasserdest.-Lösung (60 %(v/v)) versetzt und bei - 80 °C gelagert. Da für eine erfolgreiche Expression neu transformierte Zellen notwendig sind, wurde im experimentellen Ablauf auf isolierten Plasmide zurückgegriffen. Diese wurden in Wasserbidest. bei - 20 °C gelagert. Material und Methoden 41 2.5.2 Bestimmung der Zelldichte Die Bestimmung der optischen Dichte (OD) erfolgte durch photometrische Detektion bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Messung wurde in Küvetten durchgeführt, wobei als Referenz und zum Erstellen von Verdünnungen das jeweilig zur Kultivierung eingesetzte Medium verwendet wurde. 2.5.3 Kultivierung von Escherichia coli im Schüttelkolben Für die Expression der Dioxygenasen in Escherichia coli JM109(DE3) wurden verschiedene Varianten getestet (s. Kapitel 3.2.1). Neben dem Kulturmedium wurden auch die Expressionstemperatur und -zeit variiert. Im Folgenden ist der als Standardprotokoll verwendete Expressionsablauf für in vivo Versuche beschrieben. Kompetente E. coli JM109(DE3)-Zellen wurde zunächst mit dem gewünschten Plasmid transformiert (s. Kapitel 2.6.4) und über Nacht bei 37 °C auf selektiven LB-Agarplatten inkubiert. Am selben Tag wurden 2 L Schikanekolben mit 450 mL TB-Medium vorbereitet und autoklaviert. Vor Inokulation des Kulturmediums mit einer Einzelkolonie von der Platte wurden 50 mL Kaliumphosphatpuffer (10x, s. Tabelle 2.10) und 500 µL Ampicillin-Stocklösung (cStock = 100 mg/mLH2O) zur Fertigstellung des Nährmediums hinzugegeben. Die Kultivierung erfolgte bis zu einer OD600nm ~ 0,7 bei 37 °C und 100 min-1 im Inkubationsschüttler (s. Tabelle 2.2). Daraufhin wurde mit 50 µL einer wässrigen IPTG-Lösung (cStock = 1 M) induziert und bei 25 °C für 20 h exprimiert. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation bei 6000 x g für 20 min bei 4 °C. Für die heterologe Expression von His-getaggten Enzymkomponenten kam E. coli M15(pREP4) zum Einsatz. Auch hier wurden kompetente E. coli M15(pREP4)-Zellen zunächst mit dem gewünschten Plasmid transformiert. Für die Aufrechterhaltung des Selektionsdrucks des pREP4-Plasmids wurden LB-Agarplatten verwendet, die sowohl 100 µg/mL Ampicillin (cStock = 100 mg/mLH2O) als auch 30 µg/mL Kanamycin (cStock = 300 mg/mLH2O) enthielten. Die restliche Vorgehensweise entspricht dem für in vivo Versuche beschriebenen Protokoll. Material und Methoden 42 2.5.4 Kultivierung von Escherichia coli im Fermenter Im Rahmen der Expressionsoptimierung der Naphthalen Dioxygenase wurde E. coli JM109(DE3)_pDTG141 im 1 L - Maßstab in Multifors-2 Parallelbioreaktoren (Infors AG, Bottmingen, CH) kultiviert. Als Vorkultur wurden 50 mL LB-Übernachtkultur inklusive 50 µL Ampicillin (cStock = 100 mg/mLH2O) mit einer Kolonie frisch transformierter Zellen (E. coli JM109(DE3)_pDTG141, s. Kapitel 2.6.4) inokuliert und über Nacht bei 37 °C und 180 rpm inkubiert. Die Batch-Fermentation erfolgte in 800 mL LB-Medium, wobei nach Zugabe von 100 µg/mL Ampicillin mit einer Start-OD600nm von ~ 0,03 angeimpft und bei 37 °C bis zu einer OD600nm von ~ 1 kultiviert wurde. Nach Induktion mit 80 µL einer wässrigen IPTG-Lösung (cStock = 1 M) wurden die mittels eines teilfaktoriellen Versuchsplans (DoE) bestimmten Parameterkombinationen zur Optimierung der Expression untersucht (s. Tabelle 2.13). Tabelle 2.13: Untersuchte Faktoren zur Expressionsoptimierung der Naphthalen Dioxygenase mittels statistischer Versuchsplanung Faktor Grenzen Kombinationen Temperatur 18 - 30 °C 30 °C/0,4 vvm/1000 rpm 30 °C/1,6 vvm/300 rpm 4 h 18 °C/0,4 vvm/300 rpm 18 °C/1,6 vvm/1000 rpm Zeit 4 - 20 h 24 °C/1,0 vvm/650 rpm* 24 °C/1,0 vvm/650 rpm* 12 h Belüftung 0,4 - 1,6 vvm 18 °C/0,4 vvm/300 rpm 18 °C/1,6 vvm/1000 rpm Rührerdrehzahl 300 - 1000 rpm 30 °C/0,4 vvm/300 rpm 30 °C/1,6 vvm/1000 rpm 20 h 18 °C/0,4 vvm/1000 rpm 18 °C/1,6 vvm/300 rpm * Zentrumspunkt als biologisches Duplikat Nach der jeweiligen Expressionsdauer wurden die Zellen durch einen Zentrifugationsschritt (6000 x g/20 min/4 °C) geerntet und in Biotransformationen als ruhende Zellen (s. Kapitel 2.5.6) auf ihre Aktivität hin untersucht. 2.5.5 Reinigung von His-getaggten Proteinen über Affinitätschromatographie Zur Aufreinigung der einzelnen Enzymkomponenten wurde ein Sonderfall der Affinitätschromatographie, die Metallchelatchromatographie (IMAC3), verwendet. Für diese Methode wird die chemische Affinität zwischen immobilisierten Metallionen und den sich in der Umgebung befindlichen gelösten Molekülen 3 engl. Immobilized Metal ion Affinity Chromatography Material und Methoden 43 genutzt.199 Um die Affinität der gelösten Moleküle zu den entsprechenden Metallionen wie z. B. Kobalt und Nickel zu steigern, werden diese mit Protein-Tags versehen. Kurze Histidin-reiche Abschnitte im Proteinen oder definierte, N- oder C-terminal fusionierte His-Tags (5-15 Histidine) ermöglichen eine effiziente und schnelle Aufreinigung von Proteinen aus aufgeschlossenen Zellextrakten.203–205 His- Tags sind die am häufigsten verwendeten Markierungen in der Metallchelat-chromatographie.205,206 Die Imidazol-Seitenkette des Histidins weist eine hohe Affinität für zweiwertige Kobalt- oder Nickelionen auf und bildet Metallchelatkomplexe aus.207 Zur Immobilisierung der Metallionen wird häufig Nitriloessigsäure-Agarose (NTA) verwendet. Die Reinigung erfolgt dann nach dem Verdrängerprinzip, indem der Gehalt an Imidazol im Elutionspuffer ständig erhöht wird, bis sogar gut gebundene, getaggte Proteine von der Säule eluieren. Das mittels des Expressionsprotokolls für in vitro Versuche erhaltene Zellpellet (s. 2.5.3) wurden im doppelten Volumen mit dem jeweiligen Aufschlusspuffer (s. Tabelle 2.14) resuspendiert. Alle verwendeten Puffer wurden im Kühlraum gelagert und sämtliche Schritte wurden auf Eis oder im Kühlraum durchgeführt. Tabelle 2.14: Verwendete Pufferlösungen für die Affinitätschromatographie (mod. nach 208) Enzymkomponente Komponente Konzentration Oxygenase (TGE-Puffer) Tris-HCl (pH 7,5) 50 mM Glycerin 5 % (v/v) Ethanol 5 % (v/v) Natriumchlorid 500 mM β-Mercaptoethanol 2 mM Ferredoxin (PG-Puffer) Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) 50 mM Glycerin 10 % (v/v) Natriumchlorid 500 mM β-Mercaptoethanol 2 mM Reduktase (TG-Puffer) Tris-HCl (pH 8) 50 mM Glycerin 10 % (v/v) Natriumchlorid 500 mM Danach erfolgte der Aufschluss mittels Ultraschall (5 min/40 % Intensität) auf Eis und die Abtrennung von Zelltrümmern und unlöslichen Proteinen über zwei Zentrifugationsschritte (4 °C/75 000 x g/45 min). Der erhaltene Überstand wurde vor dem Aufbringen auf die Säule durch Filtration (0,45 µm) weiter gereinigt. Als Material und Methoden 44 Chomatographie-Säulen wurden His GraviTrapTM Talon®-Säulen (GE Healthcare, Chicago, US) verwendet. Diese wurden zunächst mit 4 Säulenvolumen (CV) bidestilliertem Wasser gewaschen und mit 8 CV des entsprechenden Aufschluss-puffers inklusive 5 mM Imidazol äquilibriert. Danach wurde die Säule mit filtriertem Zelllysat beladen. Die Elution der Zielproteine erfolgte nach dem in Tabelle 2.15 beschriebenen Schema. Tabelle 2.15: Ablauf der Reinigung mittels His GraviTrapTM Talon®-Säulen Enzymkomponente Reinigungsschritte Oxygenase (TGE-Puffer) 1. 2 CV TGE mit 2. 2 CV TGE mit 3. 4 CV TGE mit 4. 4 CV TGE mit 5. 5 CV TGE mit 5 mM Imidazol 10 mM Imidazol 50 mM Imidazol 150 mM Imidazol 300 mM Imidazol Ferredoxin (PG-Puffer) 1. 2 CV PG mit 2. 2 CV PG mit 3. 2 CV PG mit 4. 3 CV PG mit 5. 4 CV PG mit 5 mM Imidazol 10 mM Imidazol 50 mM Imidazol 150 mM Imidazol 300 mM Imidazol Reduktase (TG-Puffer) 1. 2 CV TG mit 2. 2 CV TG mit 3. 6 CV TG mit 4. 4 CV TG mit 5 mM Imidazol 10 mM Imidazol 50 mM Imidazol 300 mM Imidazol Die His GraviTrapTM Talon®-Säulen wurden im Weiteren mit 2 CV bidestilliertem Wasser sowie 2 CV wässrigem 20 %(v/v)-Ethanol gewaschen und bei 6 °C im Kühlraum gelagert. Die gesammelten Proteinfraktionen wurden nach erfolgter Reinigung mittels Vivaspin® Zentrifugalkonzentratoren dialysiert, um restliches Imidazol zu entfernen und um die Proteine in den für die Biotransformation verwendeten Assaypufferin vitro (s. Tabelle 2.12) zu überführen. Hierzu wurden die Proteinfraktionen im Verhältnis 1:2 mit Assaypufferin vitro verdünnt und bei 7000 x g und 4 °C für 20 min zentrifugiert (Füllstand < 2 mL). Der Durchfluss wurde verworfen und das verbliebene Lysat mit 15 mL Assaypufferin vitro verdünnt. Danach erfolgte ein weiterer Zentrifugations-schritt (4 °C/7000 x g/20 min). Dieser Vorgang wurde zwei Mal wiederholt, wobei im letzten Konzentrationsschritt die Proteine bis auf ein Volumen von 1 mL auf-konzentriert wurden. Da die Lagerung, insbesondere Einfrier- und Auftauvorgänge, sammeln sammeln sammeln Material und Methoden 45 die Stabilität der Proteine nachteilig beeinflussen, wurden die erhaltenen Proteinfraktionen vor der Lagerung bei - 20 °C aliquotiert. Hierzu wurde die Proteinkonzentration der Fraktionen bestimmt (s. Kapitel 2.7.1) und wie folgt aliquotiert: 25 µM Oxygenase, 250 µM Reduktase und 500 µM Ferredoxin. 2.5.6 Ganzzell-Biotransformationen mit ruhenden Zellen Das mittels des Expressionsprotokolls für in vivo Versuche erhaltene Zellpellet (s. 2.5.3) wurde zunächst im Assaypufferin vivo (s. Tabelle 2.12) resuspendiert. Je nach Versuchsaufbau wurden Biofeuchtmassekonzentrationen von 0,05 bis 0,2 gBFM/mL eingestellt und in 20 mL Headspace-Vials mit 980 µL vorgelegt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 µL Substrat (50x Stammlösung in Ethanol) gestartet. Die Standardsubstratkonzentration betrug 10 mM Substrat (cStock = 500 mM in Ethanol). Die Reaktionszeit wurde in Screeningversuchen auf 20 h gesetzt, wobei die Reaktionsansätze bei 30 °C und 180 rpm horizontal geschüttelt wurden. Nach 20 h wurde der Reaktionsansatz in ein 2 mL Eppendorf-Tube überführt und mit 2x 500 µL MTBE mit 1 mM internem Standard (1-Octanol/3-Phenylphenol in MTBE) extrahiert. Hierzu wurden 500 µL des Lösungsmittels auf den Reaktionsansatz gegeben, 1 min gevortext und für 10 min bei 20 °C und 20 000 x g zentrifugiert. Danach wurden 350 µL der organischen Phase abgenommen und in ein GC-Vial überführt. Dieser Schritt wurde wiederholt, wobei beim zweiten Extraktionsschritt 400 µL der organischen Phase abgenommen wurden. Bis zur chromatographischen Analyse wurden die Proben bei - 20 °C gelagert. 2.5.7 Biotransformationen mit aufgereinigten Enzymkomponenten Die unter 2.5.5 beschriebenen Proteinfraktionen wurden zunächst auf Eis aufgetaut und mit entsprechendem Volumen an Assaypufferin vitro versetzt. In Tabelle 2.16 ist das Pipettierschema für die in vitro Reaktionsansätze dargestellt. Tabelle 2.16: Pipettierschema für in vitro Reaktionsansätze (Vgesamt = 500 µL) Komponente Konzentration der Stammlösung [mM] Volumen im Reaktionsansatz [µL] Assaypufferin vitro* s. Tabelle 2.12 395 NADH in Assaypufferin vitro 100 mM 25 (NH4)2Fe(SO4)2 in H2Obidest.** 5 mM 5 Material und Methoden 46 Oxgenase in Assaypufferin vitro 25 µM 20 Ferredoxin in Assaypufferin vitro 500 µM 20 Reduktase in Assaypufferin vitro 250 µM 10 Substrat in Ethanol 40 mM 25 * Aufgrund des enthaltenen Dithiothreitols sollte der Puffer bzw. der Pufferzusatz immer frisch hergestellt werden. **Die Eisenlösung sollte ebenfalls frisch zubereitet werden, da Fe2+ mit Luftsauerstoff zu Fe3+ oxidiert. Die Reaktionen wurden in 2 mL Glas-Vials angesetzt und bei 500 rpm und 30 °C im Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, DE) für 2 h inkubiert. Abgestoppt wurden die Reaktionen durch Zugabe von 350 µL MTBE mit internem Standard (1-Octanol/3-Phenylphenol in MTBE). Daraufhin wurden die Ansätze für 1 min gevortext und für 5 min bei 20 °C und 7000 min-1 zentrifugiert. Anschließend wurden 300 µL des Lösungsmittels abgenommen und in ein GC-Vial überführt. Im zweiten Extraktionsschritt erfolgte die erneute Zugabe von 350 µL MTBE. Nach Durchmischung und Zentrifugation wurden 350 µL MTBE abgenommen und mit dem ersten Reaktionsschritt vereint. Bis zur chromatographischen Analyse wurden die Proben bei - 20 °C gelagert. 2.6 Molekularbiologische Arbeiten 2.6.1 Plasmid-Isolierung von Escherichia coli Die Plasmid-DNA wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isoliert.199 Gefällte Proteine und Zelltrümmer werden abzentrifugiert und die verbleibende Nukleinsäuremischung wird chromatographisch über eine Silikasäule von genomischer DNA und RNA abgetrennt. Die Elution der Plasmid-DNA von der Säule erfolgte mit sterilem Wasser (60 °C/bidest.). Die erhaltene Plasmid-DNA wurde bei - 20 °C gelagert. Die Isolierung der Plasmid-DNA aus E. coli wurde mit dem ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit nach Herstellerangaben isoliert (s. Tabelle 2.3). 2.6.2 Ortsgerichtete Mutagenese Im Zuge des Proteindesigns stellt die ortsgerichtete Mutagenese eine wichtige PCR-basierte Methode dar, um die gezielte Änderung der DNA-Sequenz eines Gens zu erreichen.209–211 Mit diesem Verfahren können sowohl Aminosäureaustausche, -deletionen als auch –insertionen in zirkuläre Plasmide eingeführt werden. Im ersten Material und Methoden 47 Schritt wird eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Die eingesetzten Primerpaare sind hierbei komplementär zueinander und unterscheiden sich von der zirkulären Templat-DNA lediglich in der zu erzeugenden Mutation. Im Laufe der PCR werden diese Oligonukleotide eingebaut und in der Elongationsphase von der DNA-Polymerase erweitert. Als Ergebnis der in vitro Reaktion liegen sowohl methylierte, parentale DNA-Plasmide (Templat) und nicht methylierte, mutagene DNA-Plasmide mit Einzelstrangbrüchen vor. Bevor die Plasmide in den Klonierungsorganismus (E. coli DH5α/XL-1 blue) transformiert werden, erfolgt deshalb der Verdau der Plasmide mittels der Endonuklease DpnI aus Diplococcus pneumoniae G41. Dieses Restriktionsenzym schneidet spezifisch methylierte DNA und führt somit zum Abbau der eingesetzten Plasmid-DNA. Als finaler Schritt erfolgt die Transformation des Restriktionsansatzes in den Klonierungsorganismus, welcher die vorhandenen Einzelstrangbrüche ligiert und das transformierte Plasmid weiter vervielfältigt. Die Mutagenese-PCR (auch QuikChange™) wurde mit der KOD-HotStart-Polymerase von Novagen® (Merck, Darmstadt, DE) durchgeführt. Das Design der Primer und die Bedingungen der PCR wurden gemäß dem Anwenderprotokoll (Nr.: TB341) von Novagen® gewählt. Der PCR-Ansatz ist in Tabelle 2.17 beschrieben und wurde der Auflistung entsprechend pipettiert. Tabelle 2.17: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes für die ortsgerichtete Mutagenese Bestandteile Volumen [µL] Endkonzentration PCR-Puffer für KOD-HS-Polymerase (10x) 5 1x MgSO4 (25 mM) 3 1,5 mM dNTPs (à 2 mM) 5 0,2 mM (à dNTP) H2Obidest. 32 Primer forward (10 µM) 1,5 0,3 µM Primer reverse (10 µM) 1,5 0,3 µM Templat-DNA* 1 100 pg - 50 ng KOD-HotStart-Polymerase (1 U/µL) 1 0,02 U * Templat-DNA: pDTG141 In Tabelle 2.18 ist das verwendete Standardprotokoll für die ortsgerichtete Mutagenese dargestellt. Die Wahl der Annealing-Temperatur wurde hierbei von den eingesetzten Oligonukleotiden (s. Kapitel 2.2) bestimmt. Material und Methoden 48 Tabelle 2.18: PCR-Programm für die ortsgerichtete Mutagenese (*: variiert je nach Primerpaar) PCR-Schritt Dauer Temperatur [°C] Anzahl der Zyklen 1. Denaturierung 2 min 95 1 2. Denaturierung 20 s 95 20 Annealing 30 s 50/55/60* Elongation 3 min 70 Finale Elongation 7 70 1 Kühlung ∞ 8 Nach Ablauf der Mutagenese-PCR wurden dem PCR-Ansatz laut Standardprotokoll 1 µL der Restriktionsendonuklease DpnI (Stock: 10 U/µL; Thermo Scientific, Waltham, US) hinzugefügt und für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Je nach Bedarf wurden sowohl die Menge des Restriktionsenzyms (bis zu 3 µL) als auch die Inkubationszeit (bis zu 16 h) variiert. 2.6.3 Klonierung via gibson assembly Das gibson assembly stellt eine effiziente und schnelle Klonierungsmethode dar, um mehrere DNA-Fragmente mit zueinander überlappenden Enden in einer isothermen Reaktion zu verbinden.212,213 Für diese Klonierungstechnik werden drei unterschiedliche Enzymaktivitäten benötigt: (1) Eine Exonuklease, welche Einzelstrangüberhänge am 3´-Ende generiert und damit das Annealing der unterschiedlichen Fragmente durch komplementäre Enden ermöglicht, (2) eine DNA-Polymerase, die die Lücken zwischen den angelagerten Fragmenten auffüllt und (3) eine DNA-Ligase, welche die verbleibenden Einzelstrangbrüche4 ligiert. Das Ergebnis des gibson assemblys ist ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Das Duet-Vektorsystem pETDuet/pCOLADuet wurde auf seine Eignung zur Expression der Naphthalen Dioxygenase hin getestet. In den low copy-Vektor pCOLADuet wurden die α- und β-Untereinheiten kloniert, pETDuet (high copy) wurde als Grundgerüst für die Redoxpartner gewählt. Zunächst wurden die Leervektoren in E. coli XL-1 blue transformiert, vermehrt und isoliert (s. 2.6.4/2.6.1). Danach erfolgte die Linearisierung der Plasmide durch einen präparativen Restriktionsverdau (s. Tabelle 2.24). 4 engl. nicks Material und Methoden 49 Tabelle 2.19: Linearisierung von zirkulären Plasmiden mittels Restriktionsendonukleasen Komponente Volumen [µL] Konzentration Plasmid Miniprep 20 10-15 µg Puffer 2,5 1x Restriktionsenzym A/B 2 µL* 10 U H2Obidest. 0,5 * Das Verhältnis der Restriktionsenzyme wurde mit dem DoubleDigest Calculator von Thermo Fisher Scientifc ermittelt. Für die Linearisierung der Leervektoren pETDuet und pCOLADuet wurden NcoI und HindIII verwendet, der Restriktionsverdau von pETDuet_nahAa und pCOLADuet_nahAc erfolgte mit den Endonukleasen NdeI und XmaJI. Die Linearisierungsansätze wurden bei 37 °C für 16 h inkubiert. Die Gene nahAc, nahAd, nahAa und nahAb wurden mit den Oligonukleotiden aus Tabelle 2.7 in einer Amplifizierungs-PCR vermehrt. Der PCR-Ansatz entspricht der Zusammensetzung für die ortsgerichtete Mutagenese (s. Tabelle 2.17). Abhängig vom gewünschten Zielprodukt wurde das Temperaturprogramm wie folgt angepasst. Tabelle 2.20: PCR-Programm für die Amplifizierung-PCR PCR-Schritt Dauer Temperatur [°C] Anzahl der Zyklen 1. Denaturierung 2 min 95 1 2. Denaturierung 20 s 95 25 Annealing 30 s 50/58/60* Elongation 28 s (nahAc); 10 s (nahAd) 21 s (nahAa);04 s (nahAb) 70 Finale Elongation 7 min 70 1 Kühlung ∞ 8 * variiert je nach Primerpaar Die Linearisierungs- und PCR-Ansätze wurden mittels DNA-Gelelektrophorese aufgetrennt und aus dem Gel extrahiert (s. Kapitel 2.6.5). Danach wurde die DNA-Konzentration (NanoDrop ND-1000-Spektrometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US) bestimmt. Für das gibson assembly wurden die generierten Fragmente im Verhältnis 1:3 (Vektor:Insert) eingesetzt, wobei die Mindestmenge bei 100 ng pro Fragment lag. Die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes ist in Tabelle 2.21 beschrieben. Material und Methoden 50 Tabelle 2.21: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für das gibson assembly Komponente Stammlösung Volumen [µL] 5x ISO Reaktionspuffer s. Tabelle 2.22 320 T5 Exonuklease 10 U/µL 0,64 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase 2 U/µL 20 Taq DNA Ligase 40 U/µL 160 H2Obidest. 699,36 Der fertige Mastermix aliquotiert (à 15 µL) bei - 20 °C gelagert. Die Zusammen-setzung des ISO Reaktionspuffers ist in Tabelle 2.22 beschrieben. Tabelle 2.22: Zusammensetzung des 5x ISO Reaktionspuffers für das gibson assembly Komponente Stammlösung Menge 25 %(w/v) PEG-8000 PEG-8000 1,5 g 500 mM Tris/HCl (pH 7,5) 1 M Tris/HCl (pH 7,5) 3000 µL 50 mM MgCl2 2 M MgCl2 150 µL 50 mM DTT 1 M DTT 300 µL 1 mM dATP/dCTP/dGTP/dTTP 100 mM dATP/dCTP/dGTP/dTTP 60 µL 5 mM NAD 100 mM NAD 300 µL Der konzentrierte Reaktionspuffer wurde sterilfiltiert, zu à 100 µL aliquotiert und bei - 20 °C gelagert. Für das gibson assembly wurden je 15 µL des Reaktionsansatzes auf Eis aufgetaut und zügig mit 5 µL der zu ligierenden DNA vermischt, für 1 h bei 50 °C inkubiert und in E. coli XL-1 blue transformiert. Im Weiteren wurden die korrekte Amplifizierung der Fragmente und die anschließende Ligation mittels Sequenzierung einzelner Klone verifiziert. 2.6.4 Transformation von Escherichia coli durch Hitzeschock Für die Hitzeschocktransformation wurden zunächst chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen der verwendeten Stämme E. coli DH5α, E. coli XL1 blue, E. coli JM109(DE3) und E. coli TunerTM(DE3)pLysS hergestellt. Dazu wurden 100 mL LB-Medium mit 1 % (v/v) ü/N-Kultur (37 °C/180 min-1/16 h) angeimpft und bei 37 °C bis zu einer OD600 nm von 0,5-0,6 kultiviert. Danach erfolgte die Zellernte (4 °C/8000 x g/15 min) und das erhaltene Pellet wurde mit TFBI - Puffer (s. Tabelle 2.12/0 °C/40 mL) versetzt. Nach einer 20-minütigen Inkubation Material und Methoden 51 auf Eis und einem weiteren Zentrifugationsschritt (4 °C/8000 g/10 min) wurden die Zellen vorsichtig in TFBII - Puffer (s. Tabelle 2.12/0 °C/2 mL) resuspendiert und für 15 min auf Eis gelagert. Daraufhin wurden die Zellen schnellstmöglich in vorgekühlte Eppendorf-Tubes à 50 µL aliquotiert und bei – 80 °C gelagert. Vor der Hitzeschocktransformation wurden die Zellen auf Eis aufgetaut und mit Plasmid-DNA5 für weitere zehn Minuten auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgte im Wasserbad bei 42 °C für 90 s. Im Anschluss wurden die Zellen zwei Minuten auf Eis abgekühlt und mit 500 µL LB-Medium versetzt. Die Regeneration der Zellen erfolgte für eine Stunde bei 37 °C und 500 rpm im Thermomixer. Bei der Trans-formation von zirkulären Plasmiden wurden 50 µL der Zellsuspension auf selektiven Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C bebrütet. Bei der Transformation von mutagenen Plasmiden mit Einzelstrangbruch wurden hingegen 100 µL der regenerierten Zellen auf selektiven Agarplatten ausplattiert und inkubiert. 2.6.5 Elektrophoretische Trennung und Gelextraktion von DNA-Fragmenten Die Agarose-Gelelektrophorese ermöglicht die Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe. Durch den Vergleich mit DNA-Strängen bekannter Größe, sogenannte Marker, kann die Größe der untersuchten DNA-Fragmente bestimmt werden. Die Auftrennung basiert hierbei auf zwei Faktoren: (1) Die ausgebildete Agarosegelmatrix erlaubt die Unterscheidung von Fragmenten aufgrund ihrer Mobilität, wobei kleinere DNA-Stränge mobiler sind als große und (2) die negative Ladung der DNA, welche bei Anlegen einer Spannung die gerichtete Wanderung der Fragmente durch das Gel ermöglicht. Es wurden ausschließlich 1 %(w/v)ige Agarosegele zur Analyse von DNA-Fragmenten verwendet. Die Agarose wurde eingewogen und mit dem entsprechenden Volumen an TAE-Puffer (s. Tabelle 2.12) versetzt. Zur vollständigen Lösung der Agarose wurde die Gelmischung für 2-3 min bei 900 Watt in der Mikrowelle gekocht. Nach Abkühlen der Lösung auf ~ 40 °C wurde der DNA-interkalierende Fluoreszenzfarbstoff peqGREEN (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, DE) im Verhältnis 1:10 000 hinzugegeben und die Gellösung zum Auspolymerisieren in die Gelapparatur gegossen. Nach 30 min bei Raumtemperatur 5 Gehalt an eingesetzter Plasmid-DNA: 1 µL für die Transformation von zirkulären Plasmiden; 10 µL für die Transformation von Mutagenese-Plasmiden mit Einzelstrangbruch Material und Methoden 52 war das Gel auspolymerisiert und konnte mit dem Laufpuffer (1x TAE) überschichtet werden. Die DNA-Proben wurden mit 6x DNA-Ladepuffer (Thermo Scientific, Waltham, US) versetzt und zusammen mit einem Größenstandard (s. Tabelle 2.1) auf das Gel aufgetragen. Die angelegte Spannung betrug 100-120 V. Nach einer Stunde Laufzeit wurden die Gele unter UV-Licht visualisiert und dokumentiert. Bei der Durchführung von präparativen Agarosegelen wurde die DNA nach erfolgreicher Auftrennung mit dem ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit der Firma Zymo Research wiedergewonnen. Das Kit wurde dazu nach Herstellerangaben eingesetzt. 2.7 Proteinchemische Methoden 2.7.1 Proteinbestimmung mittels Bicinchoninsäure Die Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bicinchoninsäure (BCA) beruht auf der Interaktion von Proteinen mit zweiwertigen Kupferionen.214 Im Alkalischen werden bei Anwesenheit von Proteinen zweiwertige Kupferionen quantitativ zu Cu+-Ionen reduziert. Jeweils zwei dieser Cu+-Ionen bilden mit einem Molekül Bicinchoninsäure einen violetten Komplex aus, welcher bei 562 nm detektiert werden kann. Der Assay wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (s. Tabelle 2.3). Als Proteinstandard für die Kalibriergerade im Bereich 0 - 2 mg/mL (s. Abbildung 6.1) diente in Wasser gelöstes Rinderserumalbumin. 2.7.2 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelektrophorese Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelektrophorese (SDS-PAGE)6 wird zur Auftrennung und molekularen Größenbestimmung von Proteingemischen verwendet.215,216 Die zu analysierenden Proteine werden unter anderem mit dem anionische Tensid Natriumdodecylsulfat (SDS) versetzt, wodurch es zur Denaturierung der Proteine kommt. Des Weiteren führt das im Probenpuffer vorhandene Dithiothreitol zur Reduktion und Spaltung von Disulfidbrücken. Schlussendlich sorgt die Anlagerung von SDS an die denaturierten Proteine dafür, 6 engl. Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Eletrophoresis Material und Methoden 53 dass jedes Protein eine zu seiner Größe proportionale, negative Ladung erhält. Wie schon bei der Agarose-Gelelektrophorese wird somit eine Unterscheidung der Proteine aufgrund ihrer Größe und Ladung möglich. Das diskontinuierliche Verfahren nach Laemmli216 ist die am häufigsten verwendete Elektrophorese-Methode. Das Polyacrylamidgel besteht hierbei aus zwei unterschiedlichen Gelen: dem Sammel- und dem Trenngel. Das 5 %ige Sammelgel ist dabei zur Fokussierung der Proteine notwendig, die Trennung wird durch das 10 bzw. 12 %ige Trenngel erreicht. In Tabelle 2.23 sind die Rezepturen für Trenn- und Sammelgele (ausreichend für zwei Gele) aufgelistet. Tabelle 2.23: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels für die SDS-PAGE nach Laemmli216 Komponente Trenngel (10/12 %) Volumen [mL] Sammelgel (5 %) Volumen [mL] H2Obidest. 4 / 3,3 2,7 30 % Arylamidlösung* 3,3 / 4 0,67 1,5 M Tris (pH 8,8) 2,5 / 2,5 - 1,5 M Tris (pH 6,8) - / - 0,5 10 %(w/v) SDS in H2Obidest. 0,1 / 0,1 0,04 40 %(w/v) APS in H2Obidest.** 0,1 / 0,1 0,04 TEMED** 0,004 / 0,004 0,004 * Acrylamid/Bis-Acrylamid (37,5:1) ** Ammoniumperoxodisulfat (APS) ist der temperatursensible Radikalstarter für die Polymerisierungsreaktion und wird in Aliquots bei - 20 °C gelagert. Tetramethylethylendiamin (TEMED) dient als Polymerisierungskatalysator und wird als Reinsubstanz dazugegeben. Für die SDS-PAGE wurde die Proben auf einen Proteingehalt von 1 µg/µL standardisiert (s. Kapitel 2.7.1) und mit 6x SDS-Ladepuffer (s. Tabelle 2.12) im Verhältnis von 1:5 versetzt. Zur Denaturierung der Proteine wurden diese bei 95 °C für 5 min gekocht, zentrifugiert (RT/7000 x g/10 s) und danach auf Eis abgekühlt. Das auspolymerisierte Gel wurde in die Gelapparatur eingespannt und mit 1x SDS-Laufpuffer (s. Tabelle 2.12) überschichtet. Nach Entfernen des Taschenkamms wurden 5 µL eines kommerziellen Molekulargewichtsmarkers (s. Tabelle 2.1) und die vorbereiteten Proben aufgetragen. Zum Sammeln der Proteine im Sammelgel wurde zunächst eine Spannung von 10 mA pro Gel für 15 min angelegt, danach wurde die Spannung auf 20-25 mA pro Gel erhöht. Die Gelelektrophorese wurde bei Erreichen der Proteinlauffront am Gelende beendet. Nach erfolgreicher Trennung Material und Methoden 54 der Proteine erfolgte die Visualisierung der Proteinbanden mittels Coomassie Brilliant Blue R-250. Der Farbstoff bildet im Sauren mit basischen oder aromatischen Aminosäureresten Farbstoff-Protein-Komplexe aus, welche im sichtbaren Bereich bei einer Wellenlänge von 592 nm absorbieren.217 Die Gele wurden in eine Coomassie-Färbelösung (s. Tabelle 2.12) für mehrere Stunden inkubiert, wodurch das gesamte Gel blau gefärbt wurde. Um den nicht Protein gebundenen Farbstoff wieder zu entfernen, erfolgte anschließend die Inkubation in der Coomassie-Entfärbelösung (s. Tabelle 2.12) auf einem Kipp-Schüttler bei Raumtemperatur. Die Entfärbelösung wurde entfernt, sobald eine deutliche Differenzierung der blauen Proteinbanden vom Gelhintergrund möglich war. 2.7.3 Proteinanalyse mittels Western Blot und Immundetektion Als Western Blot bezeichnet man die Übertragung7 von Proteinen auf eine Träger-membran. Auf die Membran übertragene Proteine werden anschließend über einen immunologischen Antikörpernachweis (Immundetektion) nachgewiesen. Hierbei handelt es sich meist um einen gekoppelten Antikörpernachweis, welcher aus einem primären, Antigen spezifischen Antikörper und einem sekundären Reporterantikörper besteht. Dem Blot-Verfahren vorausgehend findet eine Auftrennung der zu untersuchenden Proteine durch eine SDS-PAGE (s. Kapitel 2.7.2) statt. Das erhaltene Gel wird nach folgendem Schema (s. Abbildung 2.7) als Sandwich in das Transfersystem gelegt, wobei durch Anlegen eines senkrecht zum Polyacrylamid-Gel gerichteten elektrischen Feldes die Proteine aus dem Gel und auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen werden.218 Die Whatman® Cellulose Filterpapiere wurden zunächst in Transferpuffer (s. Tabelle 2.12) gelegt und möglichst frei von Luftblasen mit den anderen Bestandteilen zu 7 engl. Blotting Bodenplatte Deckel 2x Whatman® Cellulose Filterpapier Nitrocellulose-Membran SDS-Gel 2x Whatman® Cellulose Filterpapier Abbildung 2.7: Aufbau des Western Blot-Sandwiches Material und Methoden 55 einem Sandwich zusammengefügt. Für die Übertragung wurde eine Spannung von 15 V für 45 min angelegt. Nach erfolgtem Transfer auf die Membran fand die Detektion über einen spezifischen Antikörpernachweis statt. In dieser Arbeit war der Nachweis von nicht-getaggten Proteinen (Nachweis der α- und β-Untereinheiten der Naphthalen Dioxygenase) notwendig, weshalb ein speziell für die katalytische Einheit des Multikomponentensystems hergestellter, proteinspezifischer Antikörper generiert wurde. Hierzu erfolgte die Reinigung der Dioxygenase wie in Kapitel 2.5.5 beschrieben und das gereinigte Protein wurde als Antigen an Pineda Antikörper-Service (Berlin, DE) übergeben. Über die durch das Antigen ausgelöste Immunantwort8 konnten funktionale, primäre Antikörper für die Naphthalen Dioxygenase erhalten werden. Gekoppelt wurden dieser mit einem sekundären Reporterantikörper Ziege-anti-Hase IgG konjugiert mit einer Peroxidase (s. Tabelle 2.1). Für die Absättigung freier Bindestellen auf der Nitrocellulose-Membran wurde diese mit einer Blockierlösung bestehend aus 4 %(w/v) Milchpulver gelöst in 1x TBS-Puffer (s. Tabelle 2.12) für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurde überschüssiges Milchpulver durch dreimaliges Waschen (3x 15 min/RT) mit 1x TBS-T entfernt. Für die Bindung des Primärantikörpers wurde erneut eine 4 %(w/v)ige Milch-pulverlösung in 1x TBS-Puffer hergestellt und im Verhältnis von 1:5000 mit Primärantikörper versetzt. Nach Inkubation auf einem Kippschüttler über Nacht bei 6 °C erfolgte ein weiterer Waschschritt mit 1x TBS-T (3x 15 min/RT). Danach wurde der Sekundärantikörper im Verhältnis 1:10 000 in einer 4 %(w/v)igen Milch-pulverlösung in 1x TBS-Puffer gelöst und für 1 h bei RT inkubiert. Abschließend wurde die Membran nochmals mit 1x TBS-T (3x 15 min/RT) gewaschen. Für die Entwicklung der Membran wurde ein enhanced chemiluminescence Nachweis (ECL) verwendet. Hierfür wurden zunächst folgende Lösungen hergestellt (s. Tabelle 2.24). Tabelle 2.24: Zusammensetzung der verwendeten Lösungen für den ECL-Nachweis Lösung Komponente Konzentration Lösung A 0,1 M Tris-HCl (pH 8,6) 200 mL Luminol 50 mg Gekühlt lagern ! 8 Die polyklonalen Antikörper wurden durch die Immunantwort von Kaninchen hergestellt. Material und Methoden 56 Lösung B 4-Hydroxyzimtsäure 11 mg DMSO 10 mL Dunkel lagern ! Mastermix Lösung A Lösung B 35 % H2O2 4 mL 0,4 mL 1,2 µL Der Mastermix wurde für 2 min unter Schwenken mit der Membran inkubiert und die resultierende Chemilumineszenz anschließend mit einem Fusion-SL-Dokumentationssystem (Vilber Lourmat, Eberhardzell, DE) detektiert. 2.8 Analytische Methoden 2.8.1 Aktivitätsbasierter Agarplattendiffusionstest Für eine erste Charakterisierung der generierten Enzymvarianten wurde ein aktivitätsbasierter Agarplattendiffusionstest mit Indol als Substrat durchgeführt. Die spontane Dimerisierung des Wasser-Eliminationsproduktes Indoxyl führt zur Bildung des blauen Farbstoffes Indigo (s. Abbildung 2.8). Für den Indol-Assay wurden frisch transformierte E. coli-Zellen auf selektiven LB-Agarplatten ausgestrichen und für 30 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit einer 10 %(w/v) Indollösung (in Aceton) versetzt. Dazu wurden runde Filterplättchen unter dem Abzug mit der Indollösung getränkt und im Deckel der jeweiligen Petrischalen platziert. Die Farbentwicklung wurde nach 24 h grafisch dokumentiert. 0 1 2 3 Abbildung 2.8: Aktivitätsbasierter Agarplattendiffusionstest mit Indol als Indikatorsubstrat (0-3: Farbskala zur Auswertung) Material und Methoden 57 2.8.2 Gaschromatographie Für die Analyse von Biotransformationen und Syntheseprodukten wurde ein Gaschromatograph (GC-2010/plus, Shimadzu, Kyōto, JP) verwendet. Die Detektion von Analytmolekülen erfolgte entweder mit einem Flammenionisationsdetektor (FID) oder einem Massenspektrometer (MS-QP2010, Shimadzu, Kyōto, JP). Die Gaschromatographie an der GC/FID-2010 erfolgte mit einer ZB-1 Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Phenomenex, Torrance, US) und Wasserstoff als Träger-gas. Die Injektortemperatur lag bei 250 °C, die Detektortemperatur bei 330 °C. Bei allen Analysen wurde bei einem Injektionsvolumen von 1 µL mit einem Split von 1:10 gearbeitet. Temperaturprogramm_FID_1 (Pressure: 50,2 kPa) Die Säule wurde für 1 min bei 70 °C äquilibriert, mit 15 °C/min auf 120 °C erhitzt und weiter mit einer Rate von 50 °C/min auf die Endtemperatur von 320 °C erhitzt. Daraufhin wurde die Temperatur 2 min bei 320 °C gehalten. Analysierte Substrate Toluol, tert-Butylbenzol, α-Methylstyrol, trans-β-Methylstyrol, Allylbenzol, 4-Allylanisol, 4-Methoxy-styrol Temperaturprogramm_FID_2 (Linear velocity: 40 cm/s) Die Säule wurde für 0,5 min bei 80 °C äquilibriert, mit 50 °C/min auf 90 °C erhitzt und für 11 min konstant gehalten. Weiterhin erfolgte die Erhöhung der Temperatur mit einer Rate von 50 °C/min auf die Endtemperatur von 320 °C. Die Endtemperatur wurde 2 min gehalten. Analysierte Substrate Ethylbenzol (nach Derivatisierung mit Essigsäure-anhydrid), 1-Phenylpentan Temperaturprogramm_FID_3 Für die Analyse von R-Limonen und den hydroxylierten Produkten des Monoterpens wurde eine HP-5MSi Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Agilent, Santa Clara, US) verwendet. Für die Analysen wurde bei einem Injektionsvolumen von 1 µL ein Split von 1:5 gewählt. Die Säule wurde für 1 min bei 70 °C äquilibriert, mit 15 °C/min auf 230 °C erhitzt und weiter auf eine Endtemperatur von 325 °C mit einer Rate von 50 °C/min erhitzt. Die Endtemperatur wurde für 2 min gehalten. Analysierte Substrate R-Limonen Material und Methoden 58 Für die chirale GC-Analyse von 1-Phenylethanol wurde eine ChiraSil-Dex CB Kapillarsäule (25 m × 250 µm × 0,25 µm, Agilent, Santa Clara, US) und Wasserstoff als Trägergas verwendet. Die Injektortemperatur lag bei 225 °C, die Detektor-temperatur bei 225 °C. Bei allen Analysen wurde bei einem Injektionsvolumen von 1 µL mit einem Split von 1:10 gearbeitet. Temperaturprogramm_chiralFID (Linear velocity: 30 cm/s) Die Säule wurde für 1 min bei 70 °C äquilibriert, mit 10 °C/min auf 100 °C erhitzt und weiter auf eine Endtemperatur von 225 °C mit einer Rate von 30 °C/min erhitzt. Die Gaschromatographie an der GCMS-QP2010 erfolgte mit einer ZB-5 Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Phenomenex, Torrance, US) und Helium als Trägergas. Das Massenspektrum wurde mit einer Elektronenspray-Ionisation (70 eV) erzeugt, wobei die Injektortemperatur bei 280 °C, die Temperatur der Ionenquellen bei 200 °C und die Interfacetemperatur bei 250 °C lag. Bei allen Analysen wurde bei einem Injektionsvolumen von 1 µL mit einem Split von 1:10 gearbeitet. Temperaturprogramm_MS (Linear velocity: 30 cm/s) Die Säule wurde für 1 min bei 70 °C äquilibriert, mit 10 °C/min auf 280 °C erhitzt und für zwei Minuten gehalten. Mit einer Heizrate von 40 °C/min wurde weiter auf die Endtemperatur von 310 °C geheizt. Die Endtemperatur wurde für 2 min gehalten. Analysierte Substrate R-Limonen, tert-Butylbenzol 2.8.3 Acetylierung von Analytmolekülen Zur Derivatisierung von Analytmolekülen wurde eine Mischung aus Pyridin und Essigsäureanhydrid verwendet. Bei der Acetylierung wird die Stabilität der zu analysierenden Moleküle durch den Schutz der instabilen Gruppen erhöht. Des Weiteren wird die Polarität der OH-Gruppen reduziert und die Flüchtigkeit erhöht. Pyridin wird häufig als basischer Katalysator verwendet, um die Reaktion zu katalysieren und um als Lösungsmittel zu dienen.219 Dabei reagiert Pyridin mit entstehenden sauren Nebenprodukten, kann aber auch mit dem Derivatisierungs-reagenz selbst reagieren. Für die Derivatisierung von Ethylbenzol wurden 50 µL des in MTBE extrahierten Reaktionsansatzes mit 100 µL einer Essigsäureanhydrid/Pyridin (1:1)-Mischung Material und Methoden 59 versetzt und bei 70 °C für 1 h inkubiert. Die Messung der derivatisierten Proben erfolgte zeitnah auf der GC-FID. 2.8.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Die Analyse des natürlichen Substrates Naphthalen wurde mittels reversed phase Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) durchgeführt. Hierzu wurde eine HPLC-Anlage von Agilent (Agilent 1200 series, Waldbronn DE) verwendet. Die Anlage umfasst einen Degasser (G1315D), ein quaternäres Pumpsystem (G1311A), einen Säulenofen mit Temperaturkontrolle (G1316A), eine Autosamplereinheit (G1329A) und einen Diodenarray-Detektor (DAD, G1315D). Für die Auftrennung der Analytmoleküle wurde eine Eclipse XDB-C18 Säule (5 µm, 4.6 x 150 mm, Agilent, Santa Clara, US) verwendet und mittels eines Gradienten-Programmes bei 20 °C gefahren. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 0,9 mL/min und es wurde 1 µL Probe injiziert. Die Detektion der Umsetzungen erfolgte bei 270 nm. Tabelle 2.25: HPLC-Gradienten-Methode zur Analyse von Naphthalen-Umsetzungen. Zeit [min] Anteile der verwendeten Lösungsmittel H2O + 0,1 %(v/v) Ameisensäure [%] Acetonitril [%] 0 70 30 1 70 30 4 30 70 8 2 98 8,01 70 30 10 70 30 Die chirale HPLC-Analytik erfolgte mit einer zum RP-HPLC-System analogen System, wobei dieses als normal phase HPLC (NP-HPLC) betrieben wurde. Zur Auftrennung der Enantiomere wurde eine Chiralpak® IB Säule (5 μm, 150 x 4.6 mm, Daicel, Illkirch, Fr) verwendet. Die mobile Phase bestand aus einer Mischung von n-Hexan und Ethanol (98:2) und wurde mit einer Flussrate von 0,9 mL/min isokratisch gefahren. Es wurden 10 µL Probe injiziert und der Säulenofen wurde auf 20 °C temperiert. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 210 nm. In Tabelle 2.26 sind die Retentionszeiten der jeweiligen Enantiomerepaare aufgelistet. Material und Methoden 60 Tabelle 2.26: Retentionszeiten der Enantiomerenpaare (NP-HPLC) Substrat Analyt Retentionszeit [min] Styrol S-1-Phenyl-1,2-ethandiol 21,6 R-1-Phenyl-1,2-ethandiol 22,6 α-Methylstyrol S-2-Phenyl-1,2-propandiol 16,2 R-2-Phenyl-1,2-propandiol 15,6 trans-β-Methylstyrol (1S,2S)-1-Phenylpropan-1,2-diol 15,1 (1R,2R)-1-Phenylpropan-1,2-diol 15,7 Allylbenzol S-2-Phenyl-1,2-propandiol 16,2 R-2-Phenyl-1,2-propandiol 15,6 4-Methoxy-Styrol R-1-(4-Methoxyphenyl)ethan-1,2-diol 37,1 S-1-(4-Methoxyphenyl)ethan-1,2-diol 38,8 2.8.5 Kernspinresonanzspektroskopie Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR9) wurde zur Überprüfung der Identität von chemisch und biochemisch hergestellten Verbindungen verwendet. Protonen (1H) und Kohlenstoff (13C)-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Avance 500 Spektrometer bei 500,15 MHz und 125,76 MHz gemessen. Die chemische Verschiebung (δ) wurde in parts per million (ppm) angegeben und auf den internen Standard Tetramethylsilan (δ = 0 ppm) bezogen. Für die Identifizierung und Zuordnung von komplexeren Signalen wurden des Weiteren auch 2D-NMR-Methoden eingesetzt. 2.9 Bioinformatische Methoden Im Rahmen dieser Arbeit wurden Sequenzalignments und Datenbankanalysen (Konsensussequenz) durchgeführt. Für die Überlagerung von Sequenzdaten wurde der Webservice Clustal Omega mit den Standardeinstellungen verwendet. Als Datenbank für die Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen wurde im Zuge des EU-Projektes BIOOX (http://bioox.wpengine.com/) von dem Projektpartner Bio-Prodict eine Datenbank erstellt, welche als Basis für Konsensussequenz- sowie Konservierungsanalysen diente.10 Die 3DM-Datenbank basiert auf einer Sequenz-Struktur-Analyse der eingepflegten Sequenzen und vergibt für Aminosäurereste, die sich im dreidimensionalen Raum an der gleichen Stelle befinden, eine einheitliche 9 engl. Nuclear Magnetic Resonance 10 Iron sulfur proteins - Bet v1-like (2014); https://3dm.bio-prodict.nl/ mit 8100 Sequenzen Material und Methoden 61 Nummerierung. So können vergleichbare Aminosäurepositionen in den verschiedensten Sequenzen identifiziert werden. Des Weiteren wurden in silico - Analysen durchgeführt und energieminimierte Kristallstrukturen mit einer Reihe von Substraten gedockt. Die Docking-Experimente wurden mit YASARA11 durchgeführt. Die Energieminimierung erfolgte in einer mit Wasser gefüllten Simulationszelle, wobei das Wasser für das Docking mit AutoDock Vina wieder entfernt wurde. Sämtliche Berechnungen wurden mit dem AMBER force field durchgeführt. Die Visualisierung von in silico - Analysen und Kristallstrukturen wurde mit Pymol realisiert. 2.10 Synthese von Referenzmolekülen Die Synthese von Referenzmolekülen wurde sowohl mittels Reinigung des Zielmoleküls aus präparativen Biotransformationen als auch mittels chemischen Synthesen erzielt. 2.10.1 Metallkatalysierte asymmetrische Dihydroxylierung Im Folgenden wird das Standardprotokoll für die asymmetrische Dihydroxylierung mittels α- oder β-AD-Mix nach Sharpless beschrieben. 1,4 g AD-Mix (α oder β, 1.8 mmol) wurden in 5 mL tert-Butanol-Wasser (1:1) bei RT gelöst und es wurde 1 mmol Substrat hinzugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht bei 6 °C im Kühlraum gerührt und danach mit 0,5 g Natriumhydrogensulfit und 20 mL Wasserdest. versetzt. Die Synthese wurde für weitere 30 min bei RT gerührt und mit 3x 10 mL Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels Säulenchromatographie aufgereinigt. Nach der Säulenchromatographie (Gradient von Cyclohexan:Ethylacetat 1:1 zu reinem Ethylacetat) wurde S-2-Phenyl- 11 www.yasara.org α-AD-Mix t-BuOH:H2O (1:1) 4°C Material und Methoden 62 1,2-propandiol als farbloses Öl erhalten. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.220 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 1.53 (s, 3H), 2.17 (br s, 2H), 3.63 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.27 (m, 1H), 7.36 (m, 2H), 7.45 (m, 2H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 26.0, 71.1, 74.8, 125.0, 127.2, 128.4, 144.9. Der Synthese für die beiden Enantiomere des dihydroxylierten trans-β-Methylstyrols, (1S,2S)-1-Phenylpropan-1,2-diol (β-AD-Mix) und (1R,2R)-1-Phenylpropan-1,2-diol (α-AD-Mix), wurde vor der Inkubation im Kühlraum noch 1 mmol Methansulfonamid hinzugefügt. Nach Extraktion und Entfernen des Lösungsmittels konnten 111 mg des 1R,2R-Diols (73 % Ausbeute) und 75 mg des 1S,2S-Diols (50 % Ausbeute) isoliert werden. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.220 Für 1R,2R-Diol 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 1.061 (d, 3H), 3.843-3.895 (m, 1H), 4.372-4,387 (d, 1H), 4.798 (s, OH), 7.319-7.375 (m, 5H) und 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 18.8, 72.3, 79.5, 126.8, 128.2, 128.5, 141.0. Für 1S,2S-Diol 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ = 1.083 (d, 3H), 3.829-3.916 (m, 1H), 4.373-4.398 (d, 1H), 4.680 (s, OH), 7.304-7.365 (m, 5H) und 13C-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ = 18.8, 72.2, 79.5, 126.8, 128.2, 128.5, 141.0. Der Synthese für die beiden Enantiomere des dihydroxylierten 4-Methoxystyrols, R-1-(4-Methoxyphenyl)ethan-1,2-diol (β-AD-Mix) und S-1-(4-Methoxyphenyl)ethan-1,2-diol (α-AD-Mix), wurde vor der Inkubation im Kühlraum noch 1 mmol Methansulfonamid hinzugefügt. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.221 R-Diol (weißer Feststoff, 90 % Ausbeute) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 2.21 (br s, 2H), 3.65 (dd, J = 8.2, 11.6 Hz, 1H), 3.72 (dd, J = 3.69, 11.18 Hz, 1H), 3.8 (s, 3H), 4.76 (dd, J = 8.53, 8.44 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.86 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.7 Hz, 1H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 55.3, 68.1, 74.2, 113.9, 127.3, 132.6, 159.4 AD-Mix t-BuOH:H2O (1:1) 4°C α-AD-Mix: 1R,2R β-AD-Mix: 1S,2S AD-Mix t-BuOH:H2O (1:1) 4°C α-AD-Mix: S β-AD-Mix: R Material und Methoden 63 S-Diol (weißer Feststoff, 96 % Ausbeute) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 2.27 (br s, 2H), 3.58 (dd, J = 8.2, 11.3 Hz, 1H), 3.64 (dd, J = 3.53, 11.15 Hz, 1H), 3.8 (s, 3H), 4.76 (dd, J = 3.98, 8.28 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.83 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8.47 Hz, 1H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 55.3, 68.1, 74.3, 113.9, 127.3, 132.6, 159.4. Zur Herstellung von 2-Methyl-6-methylenoct-7-en-2,3-diol wurde Myrcen eingesetzt und nach dem Standardprotokoll vorgegangen. Nach der Säulenchromatographie (Cyclohexan:Ethylacetat 1:1) wurde 2-Methyl-6-methylenoct-7-en-2,3-diol als farbloses Öl erhalten. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.189 R-(β-AD-Mix, gelbes Öl, 30 % Ausbeute) und S-Diol (α-AD-Mix, gelbes Öl, 40 % Ausbeute) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 1.15 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 1.45-1.56 (m, 1H), 1.62-1.72 (m, 1H), 1.94 (br s, 1H), 2.24-2.32 (m, 1H), 2.50-2.58 (m, 1H), 3.40 (dd, J = 1.77, 10.73 Hz, 1H), 5.04 (d, J = 5.94 Hz, 2H), 5.08 (dd, J = 11.33, 20.94 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 17.70 Hz, 1H), 6.38 (dd, J = 10.59, 17.69 Hz, 1H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 23.2, 26.5, 28.5, 30.2, 73.1, 78.2, 113.6, 116.0, 138.7, 146.1. Im Folgenden wird die Mangan-katalysierte Synthese von 1,2- und 3,10-Dihydroxy-myrcen ausgehend von Myrcen beschrieben.222 16.5 mmol Kaliumpermanganat wurden in 500 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 16.5 mmol Benzyltributylammoniumchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h bei RT gerührt und anschließend auf -10 °C abgekühlt. Danach erfolgte die Zugabe des Eduktes Myrcen (36 mmol). Die Synthese wurde für 1 h mit steter Kontrolle der Temperatur gerührt, wobei die Bildung von Braunstein beobachtet werden konnte. Aufgearbeitet wurde das Reaktionsgemisch mit 5 g Natrium-hydroxid in 80 ml Wasser, 5 g Natriumdisulfit in 100 ml Wasser und 5,5 ml Schwefelsäure in 100 ml Wasser. Die Zugabe der verschiedenen Lösungen erfolgte nacheinander und durch langsames Hinzutropfen. Danach wurde der Syntheseansatz über einen Büchnertrichter filtriert. Die organische Phase wurde mit insgesamt 500 mL Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt säulen-chromatographisch (Cyclohexan:Ethylacetat 1:1) aufgereinigt. 1,2-Dihydroxymyrcen AD-Mix t-BuOH:H2O (1:1) 4°C α-AD-Mix: S β-AD-Mix: R KmnO4, Benzyltributyl- ammoniumchlorid DCM -10 °C Material und Methoden 64 und 3,10 - Dihydroxymyrcen wurden als gelbes Öl erhalten. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.222 Für 1,2-Dihydroxymyrcen (5,7 % Ausbeute) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 1.61 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.94-2.20 (m, 4H), 2.93 (br s, 2H), 3.53 (dd, J = 7.64, 11.46 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 3.49, 11.35, 1H), 4.19 (dd, J = 3.28, 7.86 Hz, 1H), 4.97 (s, 1H), 5.10 (t, 1H), 5.14 (s, 1H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 17.7, 25.7, 26.6, 32.6, 65.6, 75.1, 110.9, 123.7, 132.2, 148.2. Für 3,10 - Dihydroxymyrcen (3,7 % Ausbeute) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 1.46-1.55 (m, 1H), 1.59 (s, 3H), 1.60-1.66 (m, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.94-2.10 (m, 2H), 2.72 (br s, 2H), 3.47 (t, 2H), 5.11 (t, 1H), 5.26 (dd, J = 1.74, 10.69 Hz, 1H), 5.36 (dd, J = 1.26, 17.29 Hz, 1H), 5.80 (dd, J = 10.82, 17.29 Hz, 1H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 17.7, 22.0, 25.7, 36.8, 68.8, 76.3, 115.2, 124.2, 132.2, 140.7. 2.10.2 Reduktion von α-Hydroxysäuren mit Lithiumaluminiumhydrid Die Synthese von 3-Phenyl-1,2-propandiol ausgehend von Phenylmilchsäure erfolgte nach der Vorschrift zur Reduktion von α-Hydroxysäuren mittels Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH4).223 Für 1 Mol Alkohol wurden 0,75 Mol LiAlH4 eingesetzt. Als Edukte für die Synthese wurden sowohl ein racemisches Gemisch aus D/L-Phenylmilchsäure als auch reine L-Phenylmilchsäure verwendet. Unter Schutzatmosphäre (N2) wurden 0,22 g LiAlH4 (5.85 mmol) in 15 mL trockenem THF vorgelegt. Auch 2.8 mmol Edukt (D/L- oder L-Phenylmilchsäure) wurden in 15 mL trockenem THF gelöst und langsam unter Rühren der LiAlH4 Lösung zugetropft. Nach erfolgter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch für 1 h unter Rückfluss gerührt. Daraufhin wurde die Reaktion mit Eiswasser gequencht, bis keine Wasserstoffentwicklung mehr zu erkennen war. Das entstandene Aluminium-hydroxid wurde mit 10-%iger Schwefelsäure gelöst und die wässrige Phase dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet, filtriert und weiter im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie aufgereinigt (Cyclohexan:Ethylacetat, 2:1) und als weißer Feststoff erhalten. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.224,225 Weißer Feststoff (57 % Ausbeute für Racemat, 82 % Ausbeute für S-Enantiomer) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 2.66-2.79 (m, 2H), 3.34 (s, 2H), 3.46 (dd, J = 7.10, 11.40 1H), 3.62 (dd, J = 3.12, 11.43 Hz, 1H), 3.86-3.94 (m, 1H), 7.15-7.28 (m, 5H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 39.7, 66.0, 73.1, 126. 6, 128.6, 129.3, 137.8. LiAlH4, THF D/L-Phenylmilchsäure 9b Material und Methoden 65 2.10.3 Simmons-Smith-Oxidation Die allylische Monohydroxylierung von α-Methylstyrol wurde mittels einer Simmons-Smith-Oxidation erzielt, beschrieben im Patent EP 1537913 A1.220 In einem 100 mL Rundkolben wurden 12,5 mL n-Decan, 6,45 mL tert-Butanol und 50 mL Dichlormethan vorgelegt. In diesem Lösungsmittelgemisch wurden sowohl 1 mmol Selendioxid (111 mg) als auch 1,5 mmol Essigsäure (86,6 μL) gelöst. Anschließend wurde die Lösung für 30 min bei RT gerührt und 49,7 mmol des Eduktes α-Methylstyrol (6,5 mL) hinzugegeben. Die Reaktion wurde für weitere 71 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend im Vakuum abgetrennt und das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie (Cyclohexan:Ethylacetat, 5:1) aufgereinigt. 3-Hydroxyphenylpropen konnte als gelbliches Öl gewonnen werden. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.220 Für 3-Hydroxyphenylpropen (2 % Ausbeute) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 1.43 (s, 1H), 4.55 (s, 2H), 5.36 (d, J = 1.27 Hz, 1H), 5.48 (s, 1H), 7.29-7.37 (m, 3H), 7.44-7.46 (m, 2H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 65.0, 112.6, 126.1, 127.9, 128.5, 138.5, 147.3. 2.10.4 Dioxygenase-katalysierte asymmetrische Dihydroxylierung Die biologische Synthese von Diolen wurde in präparativen Biotransformationen (60-160 mL) mit ruhenden Zellen durchgeführt (s. Kapitel 2.5.6). Waren die Ausbeuten zu gering für eine spektroskopische Analyse, erfolgte die Auswertung mittels Gaschromatographie. Durchgeführte, präparative Biotransformationen sind in Tabelle 2.27 dargestellt. Tabelle 2.27: Präperative Biotransformationen mit rekombinanten, induzierten Eschichia coli-Zellen Rekombinanter Stamm Eingesetzte(s) Substrat/-menge Analysemethode E. coli JM109(DE3)_pDTG141 Æ Naphthalen Dioxygenase α-Methylstyrol (153,6 mg) GCMS Allylbenzol (177,2 mg) NMR E. coli JM109(DE3)_pIP107D Æ Cumol Dioxygenase Styrol (62,5 mg) GCMS α-Methylstyrol (70,9 mg) GCMS E. coli JM109(DE3)_pDTG601 Æ Toluol Dioxygenase Diphenylmethan (133,3 mg) NMR Toluol (73,7 mg) GCMS SeO2 n-Decan, t-BuOH DCM, RT Material und Methoden 66 Abbildung 2.9: GCMS-Chromatogramm der präparativen Umsetzung von α-Methylstyrol mit NDOwt (in schwarz) Präparative Umsetzung von α-Methylstyrol mit Naphthalen Dioxygenase 26 g induzierte Biofeuchtmasse wurden in 130 mL Assaypufferin vivo (s. 2.5.6) resus-pendiert, mit 153,6 mg α-Methylstyrol versetzt und für 20 h bei 30 °C inkubiert. Danach erfolgte die Extraktion mittel MTBE (3x 130 mL). Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und das erhaltene Rohprodukt mit der GCMS vermessen. Sowohl das mono- als auch das dihydroxylierte Produkt konnten detektiert werden. Die Auftrennung der beiden Produkte wurde mittels Säulenchromato-graphie durchgeführt. Nach der Chromatographie war jedoch der Produkt-verlust so hoch, dass lediglich ein Nachweis über die Dünnschichtchromatographie möglich war. Die Produkte wurden deswegen mittels chemisch synthetisierten oder kommerziellen Standards identifiziert (s. Abbildung 2.9). Präperative Umsetzung von Allylbenzol mit Naphthalen Dioxygenase 30 g induzierte Biofeuchtmasse wurden in 150 mL Assaypufferin vivo (s. 2.5.6) resuspendiert, mit 177,2 mg Allylbenzol versetzt und für 20 h bei 30 °C inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgte analog zur Umsetzung von α-Methylstyrol mit NDOWt. Das erhaltene Rohprodukt konnte mittels NMR identifiziert werden und stellte sich als 3-Phenylpropan-1,2-diol heraus. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.226 Für 3-Phenylpropan-1,2-diol 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 2.01 (br s, 2H), 2.66-2.76 (m, 2H), 3.46 (dd, J = 7.32, 11.46 Hz, 1H), 3.63 (dd, J = 2.93, 11.51 Hz, 1H), 3.86-3.96 (m, 1H), 7.12-7.2 (m, 3H), 7.21-7.28 (m, 2H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 38.8, 65.0, 71.9, 125.6, 127.6, 127.7, 128.3, 136.6. Material und Methoden 67 Präparative Umsetzung von α-Methylstyrol und Styrol mit Cumol Dioxygenase Je 12 g induzierte Biofeuchtmasse wurden in 60 mL Assaypufferin vivo (s. 2.5.6) resuspendiert, mit 62,5 mg Styrol bzw. 70,9 mg α-Methylstyrol versetzt und für 20 h bei 30 °C inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgte analog zur Umsetzung von α-Methylstyrol mit NDOWt. Die Menge der erhaltenen Rohprodukte für beide Umsetzungen war zu gering für die säulenchromatographische Auftrennung, sodass eine erste Identifizierung der Produkte mittels GCMS erfolgte (s. Abbildung 2.10). Die Analyse der Fragmentierungsmuster führt zu der Annahme, dass die Cumol Dioxygenase sowohl am Substituenten dihydroxyliert als auch am Ring. Hierbei stellt P1 das Wasser-Eliminationsprodukt dar (Phenol-Form), P2 das Dihydrodiol-Produkt und P3 konnte mittels kommerziellem Standard als 1-Phenyl-1,2-ethandiol identifiziert werden. Ein ähnliches Bild zeigt sich auch bei der Umsetzung von α-Methylstyrol und bestätigt somit Vorarbeiten am ITB, worin der Wildtyp der Cumol Dioxygenase als ring-spezifische Dioxygenase beschrieben wurde.201 Die Identifizierung der Produkte erfolgte auch hier über GCMS und den resultierenden Fragmentierungs-mustern der Produkte (s. Abbildung 2.12). 50.0 75.0 100.0 125.0 150.00 50 100 % 91 120 655143 77 11810286 133 50.0 75.0 100.0 125.0 150.00 50 100 % 91 120 77655341 109 13863 9574 11883 136 50.0 75.0 100.0 125.0 150.00 50 100 % 10779 51 1381059143 6553 12074 14986 133 P1 P2 P3 P1 P2 P3 Abbildung 2.11: (Re) GCMS-Chromatogramm der Umsetzung von Styren mit Cumin Dioxygenase, (Li) Fragmentierungsmuster der unterschiedlichen Produktpeaks . 0 (Li) - r t r präp rativen Umsetzung von Styrol mit CDOWtRe) Fragmentierungsmuster der unterschiedlichen Produktpeaks Material und Methoden 68 50.0 75.0 100.0 125.0 150.00 50 100 % 13491 119 7765 11510551 89 13143 62 50.0 75.0 100.0 125.0 150.00 50 100 % 91 13411977 10541 6755 103 1188957 131 15275 Bei der Umsetzung von α-Methylstyrol konnte keine Dihydroxylierung des Substituenten beobachtet werden. P1 stellt vermutlich das Wasser-Eliminationsprodukt dar (Phenol-Form), P2 das Dihydrodiol-Produkt. Präperative Umsetzung von Diphenylmethan mit Toluol Dioxygenase 15,9 g induzierte Biofeuchtmasse wurden in 79,5 mL Assaypufferin vivo (s. 2.5.6) resuspendiert, mit 133,3 mg Diphenylmethan versetzt und für 20 h bei 30 °C inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgte analog zur Umsetzung von α-Methylstyrol mit NDOWt. Das erhaltene Rohprodukt konnte mittels NMR identifiziert werden und stellte sich als 3-Benzyl-3,5-Cyclohexadien-1,2-diol heraus. Die NMR-Daten stimmen mit der Literatur überein.228 Für 3-Benzyl-3,5-Cyclohexadien-1,2-diol 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 3.46 (s, 2H), 3.69 (d, J = 6.21 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 51.9 Hz, 2H), 5.53 (d, J = 4.81 Hz, 1H), 5.64 (dd, J = 2.88, 9.57 Hz, 1H), 5.75-5.82 (m, 1H), 7.16-7.23 (m, 3H), 7.25-7.33 (m, 2H) und 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ = 40.3, 68.2, 68.7, 120.0, 123.0, 125.9, 128.2, 128.9, 129.5, 139.8, 141.6. Präparative Umsetzung von Toluol mit Toluol Dioxygenase Je 16 g induzierte Biofeuchtmasse wurden in 80 mL Assaypufferin vivo (s. 2.5.6) resuspendiert, mit 73,7 mg Toluol versetzt und für 20 h bei 30 °C inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgte analog zur Umsetzung von α-Methylstyrol mit NDOWt. Die Menge des erhaltenen Rohproduktes war zu gering für die säulen- Abbildung 2.12: (Li) GCMS-Chromatogramm der Umsetzung von α-Methylstyren mit Cumol Dioxygenase, (Re) Fragmentierungsmuster der unterschiedlichen Produktpeaks P2 P1 P2 P1 Material und Methoden 69 chromatographische Auftrennung, sodass eine erste Identifizierung der Produkte mittels GCMS erfolgte (s. Abbildung 2.13). Die Umsetzung von Toluol mit der Toluol Dioxygenase lieferte zwei Produktpeaks: P1 das Wasser-Eliminationsprodukt, welches im Sauren entsteht und P2 das in der Literatur beschriebene Dihydrodiol. 50.0 75.0 100.0 125.00 50 100 % 108 79 9080 8951 6340 55 7449 110 50.0 75.0 100.0 125.00 50 100 % 1087980 41 916553 97 12663 89 11145 70 105 124 P1 P2 P1 P2 Abbildung 2.13: (Li) GCMS-Chromatogramm der Umsetzung von Toluol mit Toluol Dioxygenase, (Re) Fragmentierungsmuster der unterschiedlichen Produktpeaks Ergebnisse 70 3 Ergebnisse Im Weiteren sind die experimentellen Arbeiten beschrieben, wobei der folgende Reaktionsraum mit den Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen erschlossen wurde. Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit eine breite Palette an Substraten untersucht, die sich in Substrate mit aromatischem Motiv (I), Monoterpene (II) und Sesquiterpene (III) gliedern lässt (s. Abbildung 3.1). Abbildung 3.1: Übersicht der untersuchten Substratpalette I. Substrate mit aromatischen Motiv II. Monoterpene III. Sesquiterpene Ergebnisse 71 3.1 Naphthalen Dioxygenase im in vitro System 3.1.1 Expression und Aufreinigung über Affinitätschromatographie Für die heterologe Expression in E. coli M15(pREP4) wurden die einzelnen Komponenten, wie in Kapitel 2.5.3 beschrieben, exprimiert. Zur Bestimmung der optimalen Expressionsdauer wurde die Bildung der Zielproteine über eine SDS-PAGE über 20 h verfolgt. In Abbildung 3.2 ist der Expressionsverlauf der Reduktase und Oxygenasekomponenten über die Zeit dargestellt. Da die Proben durch ein chemisches Aufschlussverfahren lysiert wurden, kam es im Fall der Oxygenase zur Akkumulation der Zielproteine im Zellpellet. Im Weiteren [kDa] 170 130 100 70 55 40 35 25 15 [kDa] 170 130 100 70 55 40 35 25 15 M v. I. 1h 2h 3h 4h 5h 20h M v. I. 1h 2h 3h 4h 5h 20h Oxygenase-Zellpellet nach chemischem Zellaufschluss mit BugBuster® Oxygenase-Zellüberstand nach chemischem Zellaufschluss mit BugBuster® M v. I. 1h 2h 3h 4h 5h 20h M v. I. 1h 2h 3h 4h 5h 20h Reduktase-Zellpellet nach chemischem Zellaufschluss mit BugBuster® Reduktase-Zellüberstand nach chemischem Zellaufschluss mit BugBuster® Abbildung 3.2: 12 %ige SDS-PAGE des Expressionsverlaufs der His-getaggten Reduktase und Oxygenasekomponenten der NDOWt in E. coli M15(pREP4) über 20 h. (Li. o./re. o.: Oxygenase-Zellpellet/Zellüberstand; Li. u./re. u.: Reduktase-Zellpellet/Zellüberstand; schwarze Pfeile markieren die exprimierten Zielproteine (α-Untereinheit: 50 kDa, β-Untereinheit: 22 kDa, Reduktase: 37 kDa); Proteingehalt mittels BCA standardisiert auf 15 µg/Spur) Ergebnisse 72 erfolgte der Aufschluss mittels Ultraschall, wodurch die Oxygenase in der löslichen Fraktion detektiert werden konnte. Nichtsdestotrotz zeigte die ansteigende Proteinkonzentration der Zielproteine, dass eine Expressionsdauer von 20 h für die Herstellung der Zielproteine geeignet ist. Die Reinigung der His-getaggten Komponenten wurde wie in Kapitel 2.5.5 durchgeführt. Zur Ermittlung der Zielfraktionen wurden zunächst alle erhaltenen Elutionfraktionen gesammelt und mit einer SDS-PAGE analysiert. Das Ergebnis für die Zielfraktionen ist in Abbildung 3.3 für die Oxygenase, das Ferredoxin und die Reduktase der Naphthalen Dioxygenase dargestellt. Im Fall der Oxygenase ist nur die α-Untereinheit getaggt, die β-Untereinheit weist jedoch eine starke Affinität zur α-Untereinheit auf, sodass diese gemeinsam eluieren. Neben der Herstellung von gereinigten Proteinfraktionen für in vitro Versuche wurde die Reinigung der Reduktase und Oxygenase noch aus einem weiteren Grund verfolgt. Bei der Analyse des in vivo Systems wurde keine (Über)expression des Multikomponentensystems beobachtet, weshalb eine Reihe von Optimierungs-versuchen durchgeführt wurde, jedoch ohne eine deutliche Expression der Zielproteine zu erhalten. Da im in vivo System keine spezifischen Tags verwendet wurden, wurde der spezifische Nachweis mittels eines Protein-spezifischen Antikörpers angestrebt. Da der Nachweis lediglich für denaturierte Proteine (mittels SDS-PAGE) notwendig war, wurden die Antigene (Oxygenase und Reduktase) mittels His-Tag gereinigt und als denaturierte Antigene an Pineda Antikörper- α-Untereinheit (50 kDa) β-Untereinheit (22 kDa) Ferredoxin (12 kDa) Reduktase (37 kDa) Abbildung 3.3: Ergebnis der IMAC-Reinigung des Multikomponentensystems Naphthalen Dioxygenase von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 (Li: Gereinigte Oxgenase, Mi: Gereinigtes Ferredoxin, Re: Gereinigte Reduktase; Eppendorf-Tubes zeigen die Kolorierung der eluierten Zielfraktion an; Proteingehalt mittels BCA standardisiert auf 15 µg/Spur) Ergebnisse 73 Service (Berlin, DE) zur Herstellung der Antikörper übergeben. In Abbildung 3.4 sind die gereinigten Antigenproben dargestellt. Die Funktionsüberprüfung der spezifischen Protein-Antikörpers ist in Kapitel 3.2.1 dargestellt. 3.1.2 Optimierung des in vitro Systems Bei der Optimierung des in vitro Systems wurden drei Parameter untersucht: x Verhältnisse der Einzelkomponenten x Reaktionszeit und x eingesetztes Cosolvens zur Verbesserung Substratlöslichkeit Von weiteren Optimierungsparametern wurde abgesehen, da das verwendete Puffersystem für verwandte Naphthalen Dioxygenasen bereits in der Literatur beschrieben ist.208 Gerade im Bezug auf die Stabilität der reduktiven Partner Ferredoxin und Reduktase gibt es in der Literatur bereits zahlreiche Hinweise auf die unterschiedlichen Stabilitäten229–231 der einzelnen Komponenten, weshalb in den meisten in vitro Untersuchungen ein Überschuss der Redoxpartner gewählt wurde.182,208 Mit dieser Grundlage wurden unterschiedliche Kombinationen der drei Komponenten der Naphthalen Dioxygenase getestet. Als I wird hierbei die Kombination von 1 µM Oxygenase, 20 µM Ferredoxin und 5 µM Reduktase bezeichnet, als IV die Kombination von 1 µM Oxygenase, 12 µM Ferredoxin und 3 µM Reduktase. In Abbildung 3.5 sind Zeitverläufe der in vitro Umsetzungen des natürlichen Substrates Naphthalen (1) und Styrol (6) über 2 h bei 30 °C dargestellt. [kDa] 170 130 100 70 55 40 35 25 15 α-Untereinheit (50 kDa) β-Untereinheit (22 kDa) Reduktase (37 kDa) Abbildung 3.4: 12 %ige SDS-PAGE der IMAC-Reinigung der His-getaggten Reduktase und Oxygenasekomponenten der NDOWt in E. coli M15(pREP4) (Proteingehalt mittels BCA standardisiert auf 15 µg/Spur) Ergebnisse 74 Lagen Ferredoxin und Reduktase mit 20 µM und 5 µM im Überschuss vor, wurden 1,48 ± 0,02 mM 1,2-Naphthalendihydrodiol gebildet. Wurde der Überschuss auf 12 µM bzw. 3 µM reduziert, sank die Ausbeute um mehr als die Hälfte auf 0,64 ± 0,06 mM 1a. Dieser Effekte zeichnet sich bei der Umsetzung von Styrol ebenfalls ab, jedoch war die Auswirkung bei einer allgemein schlechteren Umsetzung des nicht-natürlichen Substrates weniger stark zu beobachten. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde I als geeignete Komponentenkombination für weitere Experimente verwendet. Generell konnte das getestete in vitro System für die Untersuchung von verschiedenen Enzymvarianten eingesetzt werden, da mit rund 74 % Umsatz des natürlichen Substrates sowohl bessere als auch schlechtere Varianten identifiziert werden können. Bei der Umsetzung von nicht-natürlichen Substraten wurden mit ~ 41 % Umsatz ebenfalls moderate Ausbeuten erhalten. Im Bezug auf die Reaktionsdauer wurde ein Zeitfenster von 1,5 bzw. 2 h für die Biotransformationen gewählt, welche nachfolgend als Endpunktbestimmungen durchgeführt wurden. Als dritter Parameter wurde das verwendete Cosolvens zur Lösung der meist hydrophoben Substrate untersucht. Bereits in vorangegangenen Studien232 konnte 00.2 0.40.6 0.81 1.21.4 1.61.8 2 0 0.5 1 1.5 2 2.5 c P ro du kt , n or m . a uf IS TD [m M ] Reaktionszeit [h] 1_ I6_I1_IV6_IV Abbildung 3.5: Zeitverlauf der in vitro Umsetzungen von 2 mM Naphthalen (1) und Styrol (6) zu den korrespondieren Diolen (1,2-Naphthalendihydrodiol (1a) und 1-Phenylethan-1,2-diol (6a)) mit unterschiedlichen Kombinationen aus Oxygenase:Ferredoxin:Reduktase (I: 1:20:5 µM; IV: 1:12:3 µM) (Normierung der Peakflächen für Umsetzungen und die Kalibriergerade erfolgte auf 1 mM 1-Octanol als internen Standard. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.) Ergebnisse 75 AcetonAcetonitrilIsopropanolEthanol MethanolDodecanCyclohexanDCM THFDMSO 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1% 5% 10% 20% GC -P ea kf lä ch e no rm . a uf I ST D [- ] Aceton Aceton itril Isopro panol Ethano l Methan ol Dodeca n Cycloh exan DCM THF DMSO der große Einfluss des Lösungsmittels auf die Aktivität in in vitro Umsätzen gezeigt werden. Zur Untersuchung des Einflusses des Cosolvens wurden neben wasser-nichtmischbaren Lösungsmitteln wie Dodecan, Cyclohexan und Dichlormethan auch wassermischbare Lösungsmittel wie DMSO, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Aceton, Isopropanol, Methanol und Ethanol untersucht. Außerdem wurden unterschiedliche Volumenprozent (1-20 %(v/v)) der zehn Lösungsmittel bei der Umsetzung von Styrol (6) getestet (s. Abbildung 3.6). Grundsätzlich wurde die Aktivität beim Einsatz von nicht-wassermischbaren Lösungsmitteln am Stärksten reduziert. Aceton, Acetonitril, Isopropanol, Ethanol und Methanol zeigten hingegen durchwegs gute Aktivitäten, beim Einsatz von Tetrahydrofuran und DMSO wurde eine Reduktion der Aktivität um den Faktor zwei beobachtet. Des Weiteren konnte der Volumenanteil des Lösungsmittels als kritischer Parameter identifiziert werden. Bei allen getesteten Lösungsmitteln konnten die höchsten Aktivitäten mit einem Volumenanteil von 5 %(v/v) erzielt 5 %(v/v) Lösungsmittel Abbildung 3.6: Effekt von unterschiedlichen wassermischbaren und nicht-wassermischbaren Lösungsmitteln und deren prozentualen Anteil (1-20 %(v/v)) auf die Aktivität der Naphthalen Dioxygenase im in vitro System (I) nach einer Reaktionsdauer von 1,5 h bei 30 °C (Re. o.: Darstellung der Aktivitäten bei Einsatz von 5 %(v/v) Lösungsmittel). Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 76 Fe A206 V209 G204 W358 F202 F352 N297 L307 V260 F224 L253 H295 A B werden. Methanol stellte hierbei eine Ausnahme dar, da es als einziges Lösungsmittel auch beim Einsatz von 10 %(v/v) die gleiche Aktivität gegenüber dem Einsatz von 5 %(v/v) aufwies. Durch die Erhöhung des Cosolvens-Anteils von 1 %(v/v) auf 5 %(v/v) Ethanol konnte die Aktivität um den Faktor zwei gesteigert werden. 3.1.3 Semi-rationales Proteindesign: Alanin-Scan und Konsensus-Varianten Zur Identifizierung von Mutagenese-Hotspots in der aktiven Tasche der Naphthalen Dioxygenase wurden insgesamt zwölf Positionen adressiert und mittels QuikChangeTM-Mutagenese in Alanin oder Glycin überführt. Die untersuchten Positionen stellen first shell Aminosäuren dar und bilden somit die Oberfläche der aktiven Tasche. Da es sich bei der Geometrie des aktiven Zentrums um eine planare, zylinderförmige Struktur handelt, wurden die Aminosäurereste durch ihre Entfernung vom cokristallisierten Substrat kategorisiert (s. Abbildung 3.7). Im Abstand von vier Ångström befinden sich die Reste F202, H295, N297, F352 und A206. In Richtung des Substrateinganges sind die fünf Ångström entfernten Aminosäuren V209, L253, L307 und G204 zu finden. F224, V260 und W358 sind bereits sechs Ångström vom cokristallierten Substrat Indol entfernt. Abbildung 3.7: (A) Querschnitt durch die α-Untereinheit der Naphthalen Dioxygenase von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 mit Ausschnitt der aktiven Tasche (PDB code: 1O7N; Katalytisches Eisen in orange; molekularer Sauerstoff in rot; ε-Loop ist als Cartoon dargestellt (Aminosäuren 221-238)) (B) Darstellung der aktiven Tasche mit den zwölf first shell Aminosäureresten sowie dem cokristallisierten Substrat Indol (PDB code: 1O7N; Katalytisches Eisen in orange; Sauerstoff in rot; Aminosäuren als lines; Substrat in sticks) Ergebnisse 77 Im Weiteren wurden bioinformatische Methoden zur Erweiterung der Bibliothek eingesetzt. Zunächst wurden Varianten basierend auf der Konsensussequenz der im Rahmen des EU-Projektes BIOOX generierten Dioxygenase Datenbank („Iron sulfur proteins - Bet v1-like (2014)“) von Bio-Prodict (3DM, Nijmegen, NL) generiert. Diese Datenbank umfasst rund 8100 Sequenzen und gruppiert unterschiedliche Dioxygenasen in entsprechende Familien. Relevante Familien im Zusammenhang mit dieser Arbeit sind 1O7MA (NDOlike), 1ULIC (BDO/TDOlike) und 3GZXA (CDOlike). Die Konsensussequenz dieser Familien im Bereich der aktiven Tasche ist in Abbildung 3.8 dargestellt. Des Weiteren wurde ein hoch konservierte Motiv, NWK-x(3)-[ED]-[NQ]-x(3)-[DE]-x-Y-H12, welches durch ein globales Sequenzalignment von über 18 000 Dioxygenase-Sequenzen identifiziert wurde13, verwendet. Basierend auf diesen bioinformatischen Analysen wurden 24 Enzymvarianten generiert (s. Tabelle 3.1). Tabelle 3.1: Konsensussequenz-Bibliothek mit Enzymvarianten der Naphthalen Dioxygenase 3DM Nr. Variante des NDOWt 3DM Nr. Variante des NDOWt 3DM Nr. Variante des NDOWt 3DM Nr. Variante des NDOWt 176 A197F 198 S219A 229 L253F 251 K314R 177 P198A 221 M242F 230 W254F 254 N317H 182 V203A/C 222 T243R 234 N297H 295 S360Q 183 G204S 223 S244A 237 V300I 298 N363G 196 L217I 224 S248H 246 C309G 299 D364E 197 R218L 226 M250S 247 S310T 301 M366W 12 Hochkonserviertes Motiv in Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (x = variable Position, keine Konservierung; () = Anzahl möglicher Aminosäuren; [] = eine der genannten Aminosäuren tritt immer auf)201 13 Bioinformatische Arbeiten von Dr. Constantin Vogel; nähere Beschreibung der Datenbank in 201 Abbildung 3.8: Konsensussequenz der Dioxygenase-Familien 1O7MA (NDOlike), 1ULIC (BDO/TDOlike) und 3GZXA (CDOlike) aus der 3DM Dioxygenase Datenbank „Iron sulfur proteins - Bet v1-like (2014)“ von Bio-Prodict Ergebnisse 78 3.1.4 Biotransformation im in vitro System Das Screening der Alanin- bzw. Glycinvarianten wurde mit einem reduzierten Satz an Substraten getestet: α-Methylstyrol (7), Styrol (6), Toluol (2) und 4-Allylansiol (11). Die Ergebnisse der in vitro Umsetzungen sind in Abbildung 3.9 dargestellt. Generell konnte von 6 über 7 hinzu 2 und 11 eine Abnahme der Aktivität beobachtet werden. So zeigten der Wiltyp und die Varianten bei der Umsetzung von Styrol mit 50-60 % die höchsten Aktivitäten (oben links). Die Punktmutationen A206G und G204A lieferten mit 1,2 ± 0,01 mM bzw. 1,14 ± 0,04 mM für das Diol 6a rund 20 % 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Wt F202G H295G N297A F352A A206G V209A L253A L307A G204A F224A V260A W358A c B en zy la lk oh ol [m M ] 00.2 0.40.6 0.81 1.21.4 Wt F202G H295G N297A F352A A206G V209A L253A L307A G204A F224A V260A W358A c 1 -P he ny le th an -1 ,2 -d io l [ m M ] 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Wt F202G H295G N297A F352A A206G V209A L253A L307A G204A F224A V260A W358A c 4 -A lly lp he no l [ m M ] 00.2 0.40.6 0.81 1.21.4 Wt F202G H295G N297A F352A A206G V209A L253A L307A G204A F224A V260A W358A c P ro du kt [m M ] 7a 7b 6a 2a 11a Abbildung 3.9: In vitro Biotransformationen von 2 mM α-Methylstyrol (7, rechts oben) und Styrol (6, links oben), sowie Toluol (2, links unten) und 4-Allylansiol (11, rechts unten) mit den korrespondierenden hydroxylierten Produkten (7a: 3-Hydroxyphenylpropen, 7b: 2-Phenylpropan-1,2-diol, 6a: 1-Phenylethan-1,2-diol, 2a: Benzylalkohol und 11a: 4-Allylphenol) mit dem gereinigten Enzymkomplex (1 µM Oxygenase, 20 µM Ferredoxin, 5 µM Reduktase) bei 30 °C für 2 h. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 79 mehr Produkt als der Wildtyp. Bei der Umsetzung des verzweigten Alkens 7 war ein ähnlicher Aktivitätsverlauf über den untersuchten Mutationsraum zu beobachten. Wiederum waren die höchsten Umsätze bei A206G und G204A zu finden. Des Weiteren konnten auch bei den Varianten V260A, F224A und L253A moderate Produktkonzentrationen nachgewiesen werden. Die erzielten Aktivitäten und die Analyse der entsprechenden Stereoselektivitäten von 6a und 7b sind in Tabelle 3.2 dargestellt. Weitere Aktivitätseinbußen ließen sich bei der Katalyse von Toluol feststellen, wobei das allylisch monohydroxylierte Produkt Benzylalkohol (2a) entstand. Die O-Demethylierung von 4-Allylanisol (10) zeigte die geringsten Produktbildungsraten mit einem Umsatz von maximal 5 %. Die Glycin-Variante an Position 206 zeigte bei den untersuchten Hydroxylierungs-reaktionen eine deutliche Aktivität gegenüber den eingesetzten Substraten, wobei in allen Fällen eine Aktivitätssteigerung gegenüber des Wildtyps zu beobachten war. Dies konnte auch für die Varianten H295G, L253A, L307A, G204A, F224A und V260A festgestellt werden. Keine der Varianten zeigte eine dem Wildtyp gegenläufige Regio- oder Stereoselektivität, sie unterschieden sich jedoch in ihrer Aktivität gegenüber den eingesetzten Substraten (s. Tabelle 3.2). Tabelle 3.2: In vitro Produktbildung der Substrate 6 und 7 mit der NDO Bibliothek unter Standardbedingungen (n. d.: nicht detektiert; n. a.: nicht auswertbar, da Umsatz zu gering; * NK_1: Umsetzung mit hitze-inaktiviertem Wildtyp; ** NK_2: Assay ohne Zugabe von Protein) Varianten Styrol α-Methylstyrol c6a [mM] ee_R [%] c7ab [mM] ee_S [%] NDOWt 1,02 ± 0,07 86 ± 0 0,54 ± 0,01 (53:47 7a:7b) 77 ± 2 F202G n. d. n. d. 0,05 ± 0,00 (88:12 7a:7b) n. a. H295G 0,16 ± 0,01 n. a.+ 0,15 ± 0,00 (57:43 7a:7b) 76 ± 4 N297A n. d. n. d. 0,04 ± 0,00 (94:6 7a:7b) n. d. F352A n. d. n. d. 0,04 ± 0,00 (96:4 7a:7b) n. d. A206G 1,20 ± 0,01 81 ± 0 0,74 ± 0,05 (48:52 7a:7b) 79 ± 0 V209A n. d. n. d. 0,03 ± 0,00 (100:0 7a:7b) n. d. L253A 0,34 ± 0,04 94 ± 1 0,35 ± 0,01 (36:64 7a:7b) 81 ± 0 L307A 0,11 ± 0,02 n. a.+ 0,16 ± 0,00 (53:47 7a:7b) 88 ± 1 G204A 1,14 ± 0,04 83 ± 1 0,63 ± 0,00 (47:53 7a:7b) 67 ± 1 F224A 0,52 ± 0,03 90 ± 0 0,28 ± 0,05 (43:57 7a:7b) 78 ± 1 V260A 0,60 ± 0,07 77 ± 0 0,42 ± 0,02 (48:52 7a:7b) 67 ± 1 W358A n. d. n. d. 0,04 ± 0,00 (100:0 7a:7b) n. d. NK_1*/ NK_2** n. d. n. d. n. d. n. d. Des Weiteren wurden die erstellten Varianten ausführlich im in vivo System getestet und im Weiteren in Kapitel 3.2 diskutiert. Ergebnisse 80 Die Positionen der Konsensus-Varianten in der α-Untereinheit werden im Folgenden in unterschiedliche Gruppen basierend auf Strukturelementen eingeteilt: Umgebung des katalytischen Eisens (B), aktive Tasche (C), Interaktion mit β-Untereinheit (D), Loopregion (E) und zentrales β-Faltblatt (F) (s. Abbildung 3.10). Abbildung 3.10: α-Untereinheit der NDO (PDB code: 1O7N) mit molekularem Sauerstoff (rot), dem katalytischen Eisen (orange), dem Eisen-Schwefel-Cluster (rot/orange) und der koordinierenden Triade (lines, schwarz) bestehend aus His208, His213 und Asp362. Mutierte Aminosäurereste sind als sticks dargestellt. (A) α-Untereinheit, (B-F) Varianten nach Strukturmerkmalen eingeteilt. A B C D E F H208 H213 A197 A198 M366 N363 N297 G204 V203 L217 R218 S219 S360 D364 W254 L253 M250 M242 S244 T243 G248 I300 C309 S310 K314 N317 Ergebnisse 81 Die Enzymvarianten wurden mit Styrol (6) getestet und lieferten die in Abbildung 3.11 dargestellten Ergebnisse. Abbildung 3.11: Relative prozentuale Aktivität der in vitro Umsetzung von Styrol mit den Konsensussequenz-Varianten der Naphthalen Dioxygenase bezogen auf den Wildtyp. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Die Varianten A197F und P198A, sowie die resultierende Doppelmutante A197F_P198A zeigten eine erhöhte Aktivität (+ 20 %) gegenüber dem Wildtyp-Enzym und sind basierend auf dem hoch konservierten Motiv gewählt worden. Der Austausch von Asparagin an Position 363 zu Glycin führte hingegen zu einer Reduktion der Aktivität auf 60 % bezogen auf NDOWt. Die Eigenschaft der Carbonsäureamid-Seitenketten eine zwitterionische Struktur auszubilden, könnte für den Elektronentransfer oder für die Bildung von stabilisierenden Wasserstoffbrücken notwendig sein und die starke Reduktion der Aktivität erklären. Des Weiteren liegt diese Position in direkter Nachbarschaft zur Eisen-koordinierenden Asparaginsäure 362 und könnte dadurch die Koordination des katalytischen Eisens beeinflussen. Der Austausch eines Methionins gegen ein Alanin an Position 366 erzeugte keine Veränderung der Aktivität gegenüber dem Wildtyp. Die Alanin- bzw. Cysteinsubstitution an Position V203 trug zu einer Aktivitäts-steigerung von bis zu ~ 40 % gegenüber dem Wildtyp bei. Diese Aminosäureposition liegt auf einer helikalen Struktur in der aktiven Tasche nahe des koordinierenden Eisens. Die Kavität der Tasche kann durch die Substitution eines Valins gegen ein Alanin vergrößert werden und dadurch sterisch die Umsetzung von Styrol begünstigen. Bei der Betrachtung der beiden Punktvarianten fällt auf, dass V203C 020 4060 80100 120140 A197F P198A A197F _P198A N363G D364E M366W V203 C V203A N297H L217I R218L S219A S360Q L253F M242F S244A S248H V300I C309G S310T K314R Re l. Ak ti vi tä t N D O w t [% ] Ergebnisse 82 lediglich eine Steigerung von 20 % erzielt. Hierbei könnte die Ausbildung von Disulfidbrücken ein störender Effekt sein. Die Position 297 liegt ebenfalls in der aktiven Tasche, rund vier Ångström vom cokristallisierten Indol (PDB code: 1O7N) entfernt. Der Austausch des Asparagins gegen ein Histidin führte nahezu zu einer Inaktivierung des Enzyms. Für die Variante G204S liegen keine Aktivitätsdaten vor, da die Expression nicht erfolgreich war. Die Aminosäurepositionen L217, R218L, S219 und S360 liegen an der Oberfläche der α-Untereinheit und könnten laut Quartärstruktur an der Interaktion mit der β-Untereinheit beteiligt sein. Der Austausch zu kleineren hydrophoben Aminosäuren wie Isoleucin, Leucin und Alanin führte zu einer Aktivitätssteigerung von bis zu 35 % (S219A). Bei der Umsetzung von Styrol mit S360Q hingegen konnte keine Aktivität nachgewiesen werden. Durch die Substitution von Leucin gegen Phenylalanin an Position 253 wurde die Wildtyp-Aktivität reproduziert. Eine weitere Position im Loopbereich der NDO (E), W254F, konnte nicht funktionell exprimiert werden. Die Varianten im zentralen β-Faltblatt zeigten ganz unterschiedliche Ausprägungen, wobei die Expression der Varianten T243R, M250S und N317H nicht möglich war. Der Austausch von Methionin an Position 242 gegen ein Phenylalanin erzielte eine Aktivitätssteigerung von ~ 40 % gegenüber dem Wildtyp. Der gleiche Phänotyp wurde bei der Umsetzung mit Variante S244A beobachtet. Mit dem Austausch des Serins an Position 248 gegen Histidin konnte eine 30 %ige Steigerung gegenüber der Wildtyp-Aktivität erreicht werden. Mit Isoleucin und Glycin an den Positionen V300I und C309G wurde die Aktivität um rund 10 % gegenüber der NDOWt gesteigert. Der Einsatz der großen hydrophoben Aminosäure Tryptophan gegen Serin an Position 310 resultierte in einer Wildtyp ähnlichen Aktivität von rund 93 % Produktbildung. Der gleiche Effekt konnte bei dem Austausch von Lysin gegen Arginin an Position 314 beobachtet werden. 3.2 Naphthalen Dioxygenase im in vivo System Eine Auswahl der Substrate (s. Kapitel 3) wurden zunächst mit einer Palette von Wildtypenzymen untersucht, um ein geeignetes Enzymtemplat für Mutagenesestudien zu identifizieren. Im Folgenden sind die untersuchten Enzyme Ergebnisse 83 aufgeführt: Cumol Dioxygenase aus Pseudomonas fluorescens IPO1 (CDO), Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 (NDO), Benzol (BDO) und Toluol (TDO) Dioxygenase aus Pseudomonas putida ML2, sowie Biphenyl Dioxygenase aus Burkholderia xenoverans LB400 (BPDO). In Tabelle 3.3 sind die Ergebnisse der Biotransformationen mit ruhenden Zellen dargestellt. Tabelle 3.3: In vivo Biotransformationen mit ruhenden Zellen (0,2 mgBFM/mL) von unterschiedlichen Substraten (10 mM) bei 30 °C über 20 h (Strukturen der Substrate sind in Abbildung 3.1 dargestellt.) Umsatz [%] 1 1‘ 3 3‘ 9 10 15 16 17 18 19 20 21 NDO 86 - ++ - + ++ - - - - - - - CDO 83 +++ +++ - +++ - - - - - - - - TDO > 99 +++ +++ +++ - - - - - - - - - BDO 93 +++ +++ - +++ - - - - - - - - BPDO 94 +++ +++ - +++ - - - - - - - - pT7-7 - - - - - - - - - - - - - - : nicht detektiert; +: neue Peaks im GC-Chromatogramm; ++: deutliche Abnahme des Substratpeaks und neue Peaks im GC-Chromatogramm; +++: kein Substratpeak detektiert und neue Peaks im GC-Chromatogramm Als Positivkontrolle wurde Naphthalen (1) umgesetzt, wodurch die funktionelle Expression der unterschiedlichen Dioxygenasen sichergestellt werden konnte. Des Weiteren wurde der Leervektor pT7-7 als Negativkontrolle unter gleichen Bedingungen untersucht, womit mehrere Parameter überprüft werden konnten: (I) Verdunstung des Substrates, (II) Zersetzung, Katalyse durch wirtseigene Enzyme oder Autokatalyse und (III) Temperatureffekte aufgrund der Analytik. Bei den Substraten 1‘, 3, 3‘, 9 und 10 wiesen die Dioxygenasen unterschiedliche Präferenzen auf. Diphenylmethan (1‘), Ethylbenzol (3) und Allylbenzol (9) wurden von allen Enzymen mit großer Akzeptanz umgesetzt. Bei der Umsetzung von 4-Ethylphenol (3‘) konnten nur bei der Umsetzung mit der Toluol Dioxygenase Produktpeaks beobachtet werden. Auch die Umsetzung von 4-Allylanisol (10) wurde nur mit einer Dioxygenase, der NDO, festgestellt. Gegenüber den getesteten Sesquiterpenen (15-21) zeigte keines der untersuchten Enzyme Aktivität. Da die Standardisierung des Biokatalysators nur gravimetrisch erfolgt und keine Konzentrationsbestimmung des katalytisch aktiven Enzymkomplexes möglich ist, wurde zunächst mittels SDS-PAGE eine proteinchemische Analysemethode gewählt. Die untersuchten Gencluster stehen alle unter der Kontrolle von starken Promotoren (T7/lac/tac), weshalb eine Überexpression der Gene erwartet wurde. In Abbildung 3.12 sind die löslichen Fraktionen nach Zellaufschluss mit Ultraschall Ergebnisse 84 der untersuchten Dioxygenasekonstrukte in E. coli JM109(DE3) vor und nach Induktion dargestellt. sdf Wie aus Abbildung 3.12 ersichtlich wird, konnte bei keinem der untersuchten Konstrukte eine Überexpression auf dem SDS-PAGE Gel festgestellt werden. Die Abwesenheit von Dioxygenase-spezifischen Proteinbanden in den induzierten Proben steht hierbei im Gegensatz zur hohen Aktivität, welche bei Umsetzungen mit Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen im in vivo System beobachtet werden kann. Da alle untersuchten Dioxygenasen dieselbe Problematik aufwiesen, wurde bei den folgenden Untersuchungen der Fokus auf die Naphthalen Dioxygenase gelegt. Dieses Enzym wurde aufgrund seines breiten Substratspektrums144 und dem Vorliegen von zahlreichen Kristallstrukturen, welche für einen rationalen Designansatz notwendig sind, als am Besten geeignet angesehen. 3.2.1 Kultivierung im Schüttelkolben und Immunodetektion In ersten Vorversuchen wurden die eigenen Ergebnisse mit Literaturdaten verglichen. Zur Überprüfung des Reaktionssetups wurde eine Untersuchung von Yu et al. (2001) herangezogen.233 Hierzu wurden der Naphthalen Dioxygenase Wildtyp (NDOWt) zusammen mit der Punktvariante NDO_H295I unter verschiedenen Expressionsbedingungen untersucht. Neben dem Expressionsmedium (MSB/LB) und der Expressionstemperatur (18/30 °C), wurde auch die Expressionsdauer [kDa] 170 130 100 70 55 40 35 25 15 CDO v. I. n. I. NDO v. I. n. I TDO v. I. n. I. BDO v. I. n. I. BPDO v. I. n. I. pT7-7 v. I. n. I. M M α-Untereinheit (37-51 kDa) β-Untereinheit (15-22 kDa) Ferredoxin (9-12 kDa) Reduktase (33-47 kDa) Abbildung 3.12: 12 %ige SDS-PAGE der löslichen Fraktion vor (v. I.) und nach (n. I.) Induktion von E. coli JM109(DE3) mit verschiedenen Dioxygenasekonstrukten (CDO, NDO, TDO, BDO, BPDO) und dem Leervektor pT7-7 (Expressionsbedingungen: 2 h bei 30 °C in LB-Medium, Induktion mit 0,1 mM IPTG; Proteingehalt mittels BCA standardisiert auf 15 µg/Spur) Ergebnisse 85 0 2 4 6 8 10 LB MSB LB MSB LB MSB2 h/30 °C 20 h/18 °C 12 h/30 °C c 1 ,2 -N ap ht ha le nd ih yd ro di ol [m M ] NDONDO_H295I Abbildung 3.13: In vivo Umsetzung von 10 mM Naphthalen zum korrespondierenden Dihydrodiol mit ruhenden Zellen (0,2 mgBFM/mL) bei unterschiedlichen Expressionsbedingungen. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. (2/12/20 h) variiert. Die erzielten Produktkonzentrationen für die in vivo Bio-transformationen sind in Abbildung 3.13 dargestellt. Die Wahl des Mediums, Komplex(LB)- oder Minimal(MSB)-Medium, schien im Fall einer 2-stündigen Induktion bei 30 °C keinen Einfluss auf die Aktivität zu haben. Bei Biotransformationen mit dem NDOWt konnten > 99 % Produktbildung beobachtet werden, mit der Isoleucin-Variante H295I konnten 3,80 ± 0,00 bzw. 2,41 ± 0,04 mM Dihydrodiol detektiert werden. Diese Ergebnisse stimmen mit den Literaturdaten von Yu et al. (2001) überein.233 Bei den Parameterkombinationen 20 h/18 °C und 12 h/30 °C wurden niedrigere Produktkonzentrationen detektiert. Nach der Analyse der Proben mittels SDS-PAGE zeigte sich bei allen Umsätzen ein ähnliches Bild wie in Abbildung 3.12. Um den Einfluss unterschiedlicher Expressionsparameter und die Steuerung der Zielproteinbildung besser zu verstehen, wurde im Rahmen der Masterarbeit von Lisa Schweizer eine umfangreiche Optimierungsstudie durchgeführt.234 Trotz einer intensiven Untersuchung von Expressionsmedium (Komplex/Minimal), -temperatur (18-30 °C), -zeit (4-20 h), -wirt (E. coli BL21(DE3)/ E. coli JM109(DE3) und -vektor (pT7-7/pET-22b(+)/pJOE575-1) konnte keine Überexpression der Zielproteine erreicht werden. Da dennoch der Nachweis des Zielproteins als essentiell angesehen wurde, musste auf eine spezifischere Nachweismethode zurückgegriffen werden. Deshalb erfolgte die Immunodetektion der Zielproteine mit den in Kapitel 3.1.1 beschriebenen Proteinantikörpern. n.d. Ergebnisse 86 Zunächst sind die Ergebnisse des Oxygenase-spezifischen Proteinantikörpers dargestellt (s. Abbildung 3.14). Obwohl der Protein-spezifische Antikörper eine relativ hohe Hintergrundaktivität für andere E. coli Proteine aufweist, kann ein halbquantitativer Nachweis über die Menge an produziertem Zielprotein getroffen werden. So lässt sich beispielsweise die Abwesenheit der Aktivität im Fall der Umsetzung mit dem NDOWt erklären, da hier auf dem Western Blot keine Bande zu sehen ist und demnach auch keine Dioxygenase exprimiert wurde. Der Aktivitätsunterschied der drei anderen Enzymvarianten korreliert ebenfalls mit der Menge an produzierten Protein. So erscheint bei der aktivsten Variante, NDO_F224A, eine deutliche Bande im Western Blot. Die Überprüfung der Expression der Reduktase war mit dem hergestellten Proteinantikörper nicht möglich, da ein zu starkes Hintergrundsignal erzeugt wurde (s. Anhang 6.5). Die Notwendigkeit für eine Standardisierung bzw. eine Stabilisierung der Expression des Multikomponentensystems wird am Beispiel der Cumol Dioxygenase (CDO) Variante M232A_I288F deutlich. Diese Variante der CDO wurde im Zuge der Untersuchungen von R-Limonen (12) generiert, basierend auf einem Vergleich mit der NDO und soll hier stellvertretend die unstete Expression der ROs verdeutlichen. Es wurden zehn separate Expressionen im 100 mL Maßstab in LB-Medium für 2 h A206G F224A V260A NDO Gereinigte NDO His M [kDa] 170 130 100 70 55 40 35 25 15 α-Untereinheit (50 kDa) β-Untereinheit (22 kDa) 02 46 810 Wt V260A F224A A206GNDO c N ap ht ha le n- 1, 2- di hy dr od io l [mM] NDO Abbildung 3.14: (Li.) Western Blot nach ECL-Nachweis der gereinigten Naphthalen Dioxygenase und in vivo exprimierten Varianten sowie NDOWt; (Re.) Umsetzungen der geblotteten Varianten und NDOWt (0,2 mgBFM/mL) mit 10 mM Naphthalen bei 30 °C für 20 h. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 87 bei 30 °C durchgeführt und anschließend die Aktivität mit der Umsetzung von 10 mM Naphthalen (1) überprüft. In Abbildung 3.15 ist das Ergebnis der zehn separaten Expressionen (A), sowie die der gemittelte Umsatz daraus (B) dargestellt. Betrachtet man die Gesamtabweichung über die zehn Klone, so liegt diese bei 32 %. Vergleicht man jedoch Klon 1 und 5 liegt die Standardabweichung bei über 80 %. Dies macht die Notwendigkeit deutlich, ein stabiles Expressionssystem für die Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen zu entwickeln. Da derzeit keine genauere Quantifizierung des Katalysators möglich ist, wurde ein Standardprotokoll zur Expression von Varianten entwickelt, welches reproduzierbare Ergebnisse liefert und die Abweichungen zwischen separaten Expressionsreihen auf ein Minimum reduziert (s. Abbildung 3.16). Durch dieses Protokoll können Enzymvarianten verlässlich in ihrer Gesamtheit (Aktivität, Selektivität und Eignung zur heterologen Expression) beurteilt werden. Die Standardabweichungen in unterschiedlichen Versuchsreihen lagen mit dem beschriebenen Protokoll in den meisten Fällen ≤ 5 % und bis auf wenige Ausnahmen (Abweichung ≤ 20 %) lagen alle Standardabweichungen bei ≤ 10 %. 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 c N ap ht ha le n- 1, 2- di hy dr od io l [ m M ] 0 10 20 30 40 50 60 U m sa tz [% ] Abbildung 3.15: In vivo Biotransformation von 10 mM Naphthalen mit zehn separat exprimierten Klonen (1-10) der Cumol Dioxygenase CDO_M232A/I288F (A) und der gemittelte Umsatz (B) (Expressionsbedingungen: 2 h bei 30 °C in LB-Medium, Induktion mit 0,1 mM IPTG) A B Ergebnisse 88 0 1 2 3 4 5 6 CDO CDO_M232A CDO CDO_M232AÜberstand Zellsuspension GC -F lä ch e n or m . a uf IS TD [- ] 1,2-Dihydroxymyrcen3,10-Dihydroxymyrcen2-Methyl-6-methylenoct-7-en-2,3-diol2-Methyl-6-methylenocta-2,7-dien-1-olMyrcen 01 23 45 67 89 10 CDO CDO_M232A c N ap ht ha le n- 1, 2- di hy dr od io l [ m M ] ÜberstandZellsuspension 3.2.2 Aufarbeitung von Biotransformationen Für eine verlässliche Produktaufarbeitungen mittels Extraktion wurde untersucht, ob die Extraktion des Überstandes189,235,236 oder die Extraktion des gesamten Biotransformationsansatzes sich besser eignet. Stellvertretend für die aromatischen Substrate wurde Naphthalen (1) und für die Terpene Myrcen (14) mit dem Wildtypenzym Cumol Dioxygenase (CDOWt) und der Punktvariante CDO_M232A getestet (s. Abbildung 3.17). Abbildung 3.16: Expressionsprotokoll für heterolog exprimierte Dioxygenasen Abbildung 3.17: In vivo Biotransformation von 10 mM Naphthalen (1, links) bzw. Myrcen (14, rechts) zu den korrespondierenden Produkten mit dem Cumol Dioxygenase Wildtyp und der Variante CDO_M232A (Expressionsbedingungen: 2 h bei 30 °C in LB-Medium, Induktion mit 0,1 mM IPTG). Experimente wurden als Triplikate durchgeführt. Aktivitätsbasierter Agarplattendiffusionstest Æ frisch transformierter E. coli JM109(DE3) Æ 10 %(v/v) Indollösung Æ 2 h Inkubation bei RT Expression in 2 L Schikanekolben Æ eine Kolonie frisch transformierter E. coli JM109(DE3) Æ 0,1 mM IPTG und Expression für 18 h bei 25°C In vivo Biotransformation Æ 0,2 mgBFM/mL Zellsuspension in 100 mM KPi (pH 7,2) mit 20 mM Glucose Ergebnisse 89 Generell wurden bei der Extraktion des gesamten Reaktionsansatzes (Zell-suspension) höhere Substrat- und Produktkonzentrationen beobachtet. Bei den Umsetzungen mit 1, welches als Stellvertreter für die aromatischen Substrate gewählt wurde, konnten bis zu 22 % mehr Produkt extrahiert werden. Dies zeigt bereits eine deutliche Verbesserung gegenüber der Extraktion des reinen Überstandes, da in der Membran oder der Zelle verbliebene Substrat- bzw. Produktmoleküle extrahiert werden. Die erhöhten Konzentrationen an Produkt und Substrat wurden bei der Umsetzung des Monoterpens 14 wesentlich stärker wahrgenommen. So wurde die Extraktion des verbliebenen Substrates verbessert, jedoch nicht reproduzierbar, was sehr wahrscheinlich durch die hohe Flüchtigkeit des Monoterpens erklärt werden kann. Allerdings wurde der Gehalt an hydroxylierten Produkten um bis zu 65 % (2-Methyl-6-methylenocta-2,7-dien-1-ol) gesteigert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Extraktion des gesamten Reaktionsansatzes für die weiteren Versuche verwendet. 3.2.3 Kultivierung im Fermenter und statistische Versuchsplanung (DoE) Für die Optimierung der Expression der Naphthalen Dioxygenase im Fermenter wurde ein teilfaktorieller Versuchsplan verwendet (s. Tabelle 2.13). Folgende Parameter wurden hierzu variiert: Expressionstemperatur (18 - 30 °C), Expressions-dauer (4 - 20 h), Belüftungsrate (0,4 - 1,6 vvm) und Rührerdrehzahl (300 - 1000 rpm). Hierbei wurden diejenigen Expressionsbedingungen als optimal angesehen, bei welchen die Produktkonzentration maximal war. Die Aktivitäten der Ganzzell-Biotransformationen der unterschiedlichen Parameterkombinationen für 1 sind in Tabelle 3.4 dargestellt. Tabelle 3.4: Untersuchte Faktoren zur Expressionsoptimierung (Statistische Versuchsplanung) und Aktivitäten des Naphthalen Dioxygenase Wildtyps gegenüber Naphthalen Faktor Grenzen Kombinationen / c1,2-Naphthalendihydrodiol [mM] Temperatur 18 - 30 °C 30 °C/0,4 vvm/1000 rpm Æ 4,63 ± 0,23 mM 30 °C/1,6 vvm/300 rpm Æ 5,61 ± 0,41 mM 4 h 18 °C/0,4 vvm/300 rpm Æ 4,36 ± 0,02 mM 18 °C/1,6 vvm/1000 rpm Æ 3,68 ± 0,00 mM Zeit 4 - 20 h 24 °C/1,0 vvm/650 rpm* Æ 6,85 ± 0,19 mM 24 °C/1,0 vvm/650 rpm* Æ 6,51 ± 0,01 mM 12 h Belüftung 0,4 - 1,6 vvm 18 °C/0,4 vvm/300 rpm Æ 8,28 ± 0,04 mM 18 °C/1,6 vvm/1000 rpm Æ 10,92 ± 0,16 mM Ergebnisse 90 Rührerdrehzahl 300 - 1000 rpm 30 °C/0,4 vvm/300 rpm Æ 6,32 ± 0,05 mM 30 °C/1,6 vvm/1000 rpm Æ 6,48 ± 0,01 mM 20 h 18 °C/0,4 vvm/1000 rpm Æ 7,67 ± 0,04 mM 18 °C/1,6 vvm/300 rpm Æ 10,20 ± 0,28 mM * Zentrumspunkt als biologisches Duplikat Mithilfe der Statistiksoftware MODDE (Umetrics, SWE) wurde ein Modell für den Aktivitätsverlauf aus den in Tabelle 3.4 dargestellten Eckpunkten generiert. Mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,97 wies das berechnete, quadradratische Modell eine gute Näherung für die Messwerte auf. Q2 dient als weiterer Parameter zur Beurteilung der Modellqualität und beschreibt die Eignung des Modells für die Vorhersage von nicht experimentell ermittelten Werten. Mit Q2 = 0,59 war das Modell noch für eine Vorhersage geeignet. Je näher Q2 an einen Wert von 1 heranreicht, desto besser ist das erstellte Modell für die Vorhersage von Werten im untersuchten Reaktionsraum geeignet. In Abbildung 3.18 ist das Modell basierend auf der Aktivität bei Umsetzungen von 10 mM Naphthalen (1) dargestellt. Abbildung 3.18: 4D Konturdiagramm der in vivo Umsetzung von 10 mM Naphthalen (1) zum korrespondierenden Dihydrodiol (1a) mit ruhenden Zellen der Naphthalen Dioxygenase (0,1 mgBFM/mL) bei 30 °C nach 22 h (< 4 mM Produkt (blau) bis 10 mM Produkt (rot)). Ergebnisse 91 Wie bereits bei der Expression in Schüttelkolben zeigte sich auch bei der Untersuchung im Fermenter, dass eine niedrige Expressionstemperatur in Verbindung mit einer längeren Expressionsdauer zu guten bis exzellenten Produkt-konzentrationen (5 - 10 mM) führt. Des Weiteren konnte bei Anwendung einer niedrigen Rührerdrehzahl (Vermeidung von Scherstress) und einer hohen Belüftungsrate (1,6 vvm) eine hohe Toleranz gegenüber den Parametern Expressionstemperatur und Expressionsdauer (s. Abbildung 3.18, unten rechts) beobachtet werden. Zusätzlich zur Umsetzung von Naphthalen wurde auch das nicht-natürliche Substrat α-Methylstyrol (7) mit der generierten Biomasse und unterschiedlichen Parameterkombinationen getestet. Hierzu wurden Zeitverläufe über 4 h aufgenommen, welche im Anhang in Abbildung 6.20 zu finden sind. 3.2.4 Evolvierbarkeit und semi-rationales Design der Naphthalen Dioxygenase Für die Untersuchungen im in vivo System wurden die in Kapitel 3.1.3 bereits beschriebenen Aminosäurepositionen übertragen und erweitert. In Tabelle 3.5 ist die generierte Variantenbibliothek der Naphthalen Dioxygenase dargestellt. Tabelle 3.5: In vivo Bibliothek der Naphthalen Dioxygenase bestehend aus 36 Einzelvarianten Pos. 202 295 297 352 206 209 253 307 204 224 260 358 Kons. [%]* 33 19 38 54 30 31 40 27 20 56 - 20 Su bs ti tu ti on A A A A G A A A A A A A V V V V V G V V V V G V I I I I I I I I I I I I 4 Ångstrom 5 Ångstrom 6 Ångstrom *Konservierung des Aminosäurerestes basierend auf der Analyse von 8100 Dioxygenase-Sequenzen mithilfe der 3DM Datenbank von Bio-Prodict Des Weiteren wurden Doppelvarianten generiert, welche basierend auf in silico Analysen (YASARA, AutoDock Vina) mit R-Limonen identifiziert wurden. Die Simulationszelle (PBD code: 1O7N) wurde dabei wie folgt definiert: x = 14 Å, y = 15 Å und z = 15 Å entfernt vom Cβ der Position 307. In Abbildung 3.19 ist die aktive Tasche der NDO dargestellt. Ergebnisse 92 Aufgrund der Docking-Ergebnisse mit dem Monoterpen R-Limonen (12) wurden die in Abbildung 3.21 dargestellten Doppelvarianten als Erweiterung der NDO-Bibliothek generiert. Die NDO-Bibliothek wurde zunächst auf ihre Funktionalität überprüft, wobei sowohl der aktivitätsbasierte Agarplattendiffusionstest mittels Indol sowie die Umsetzung mit dem natürlichen Substrat Naphthalen (1) durchgeführt wurde. Die Ergebnisse des Indol-Assays für die Einzelvarianten sind in Abbildung 3.21 dargestellt. 25 von 36 Einzelvarianten zeigten noch Aktivität gegenüber Indol, wobei 14 Einzel-varianten Wildtyp-Aktivität aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurde bei elf der getesteten NDO-Varianten keine Aktivität gegenüber Indol beobachtet. Bei der Untersuchung der 26 Doppelvarianten (A206I_V260I konnte nicht generiert werden) wiesen lediglich 17 der 26 Varianten Aktivität in Form der typischen Blau-färbung auf (s. Abbildung 6.21) Abbildung 3.19: Kristallstruktur (PDB code: 1O7N) der Naphthalen Dioxygenase (links) und Docking-Ergebnis mit R-Limonen (rechts) mit Positionen V260, H295 und A206 in sticks. Abbildung 3.20: Erweiterung der in vivo Bibliothek der Naphthalen Dioxygenase bestehend aus 26 Doppelvarianten A206 V260 H295 R-Limonen Ergebnisse 93 Da der Indol-Assay ausschließlich auf nicht-induzierter Expression des T7-Promotors beruht und somit sehr stark vom Zellhintergrund abhängt, wurde die Funktionalität der NDO-Bibliothek zusätzlich in in vivo Biotransformationen mit dem natürlichen Substrat Naphthalen (1) überprüft (s. Abbildung 3.22). Im Gegensatz zum Agarplattendiffusionstest konnte in der Biotransformation mit induzierten, ruhenden Zellen für 34 der Einzelvarianten das erwartete Produkt 1,2-Naphthalendihydrodiol (1a) nachgewiesen werden. Lediglich die Einzelvarianten NDO_L307I und NDO_G204I zeigten keine Aktivität nach 20 h. Des Weiteren konnte 02 46 810 12 Wt pT7-7 F202 H295 N297 F352 A206* V209* L253 L307 G204 F224 V260* W358 c 1 ,2 -N ap ht ha le nd ih yd ro di ol [m M ] AlaValIle 0 1 2 3 Wt pT7-7 F202 H295 N297 F352 A206* V209* L253 L307 G204 F224 V260* W358 AlaValIle Abbildung 3.21: Indol-Assay der Einzelvarianten der NDO-Bibliothek mit 10 %(w/v) Indol (*: Gly) Abbildung 3.22: In vivo Biotransformation von 10 mM Naphthalen zu 1,2-Naphthalendihydrodiol mit Einzelvarianten der NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h (*: Gly). Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 94 für Position 209 mit dem Austausch von Valin gegen die kleineren hydrophoben Aminosäuren Alanin und Glycin ein drastischer Aktivitätseinbruch beobachtet werden. Dies stimmt mit den Ergebnissen des Indol-Assays überein. Im Gegensatz dazu konnten in den in vivo Biotransformationen für die Positionen 297, 352 und 358 deutliche Umsätze mit Naphthalen (1) nachgewiesen werden, obwohl der Indol-Assay ein negatives Ergebnis lieferte. So wurde bespielsweise für die Varianten W358A und W358V keine Indigo-Bildung beobachtet, mit ruhenden Zellen konnte aber 3,3 ± 0,0 bzw. 8,0 ± 0,2 mM 1a detektiert werden. Die Funktionsüberprüfung der Doppelvarianten erfolgte ebenfalls mit der Umsetzung von 1 und ist in Abbildung 3.23 dargestellt. Hierbei konnte bei allen Doppelvarianten eine Umsetzung von 1 zu 1a beobachtet werden. Auch diese Ergebnisse stimmen nur teilweise mit den Effekten des Indol-Assays überein. So konnte im Fall der NDO_V260G_H295A keine Blaufärbung durch spontane Dimerisierung des Indoxyls festgestellt werden, bei der Umsetzung von 1 wurden jedoch 7,4 ± 0,1 mM 1a detektiert. Von 61 NDO-Varianten konnten somit 59 aktive Enzymvarianten identifiziert werden, welche in der Lage waren das natürliche Substrat 1 mit 2,5 bis > 99 % umzusetzen. 3.2.5 Phenylring mit Erweiterung der Substituenten-Seitenkette Toluol Die Umsetzung von Toluol (2) zu Toluol-cis-2,3-dihydrodiol (2b) wurde bereits mit der Toluol Dioxygenase in der Literatur gezeigt.225 Die Biotransformationen mit dem V260A _H295 V260G _H295 V260I_ H295 A206G _H295 A206G _V260 A206V _H295 A206V _V260 A206I_ H295 A206I_ V260 cProdukt [mM] < 1 1,01-2,5 A 2,51-5 V/G 5,01-7,5 I - 7,51-10 Abbildung 3.23: In vivo Biotransformation von 10 mM 1 zu 1a mit Doppel-varianten der NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h Ergebnisse 95 0 2 4 6 8 10 Wt pT7-7 F202 H295 N297 F352 A206* V209* L253 L307 G204 F224 V260* W358 c B en zy la lk oh ol [m M ] AlaValIle NDOWt und der Variantenbibliothek resultierten dabei in dem monohydroxylierten Benzylalkohol (2a) (s. Abbildung 3.24). Das beste Ergebnis konnte mit der Punktvariante H295A erreicht werden und stellte eine 26 %ige Steigerung gegenüber dem Wildtyp dar. Der Austausch gegen kleinere (Glycin) und größere (Isoleucin) Aminosäuren führte hingegen zu einem Aktivitätsverlust. Die Position 295 gehört neben 202, 297 und 352 zu den Positionen, die mit ~ 4 Å dem katalytischen Eisen am Nächsten sind. Die Variation des Asparagins an 297, sowie die Austausche von Phenylalanin Aminosäuren an den Positionen 202 und 352, führten zu einer Reduktion der Aktivität, wobei die Variante F352I wieder einen Anstieg in der Aktivität zeigte. Ethylbenzol Ethylbenzol (3) wurde sowohl zum monohydroxylierten Produkt, 1-Phenylethanol (3a), als auch zum dihydroxylierten Produkt, 1-Phenylethan-1,2-diol (3b), Abbildung 3.24: In vivo Biotransformation von 10 mM 2 zu 2a mit dem NDOWt und der NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h (*: Gly). Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 96 -40 -20 0 20 40 60 80 100 WtF202H295N297F352A206*V209*L253L307G204F224V260*W358 eeS-1-Phenylethanol [%] Ala Val Ile umgesetzt. Hierbei wurde das notwendige Intermediat Styrol zur Bildung des Diols bereits über GC-MS detektiert.237 In Tabelle 3.6 sind die Umsätze und die resultierenden Produktverteilungen der getesteten Einzelvarianten, sowie die erreichten Stereoselektivitäten für das monohydroxylierte Produkt 3a dargestellt. Tabelle 3.6: (Li) Umsätze und Produktverteilung der Einzelvarianten der NDO-Bibliothek und (Re) Stereoselektivitäten für das monohydroxylierte Produkt 3a Umsatz [%] und Produktverteilung (3a:3b) Ala Val Ile NDO 50 (67:33) pT7-7 n. d. F202 33 (70:30) 20 (67:33) 31 (74:26) H295 52 (70:30) 11 (77:23) 60 (73:27) N297 9 (79:21) 5 (92:8) 12 (57:43) F352 3 (77:23) 15 (74:26) 14 (52:48) A206* 60 (69:31) 66 (89:11) 22 (89:11) V209* n. d. 1 (92:8) 65 (54:46) L253 31 (70:30) 31 (80:20) 53 (87:13) L307 34 (61:39) 11 (86:14) 1 (84:16) G204 15 (71:29) 1 (91:9) 16 (73:27) F224 22 (68:32) 30 (83:17) 1 (91:9) V260* 55 (74:26) 12 (80:20) 38 (61:39) W358 n. d. 4 (72:28) 55 (73:27) * statt A/V entsprechend G ausgetauscht; n. d.: nicht detektiert Das Screening der NDO-Bibliothek zeigte, dass vor allem die Positionen A206 und F352 Einfluss auf den Umsatz von 3 haben. Mit der Variante NDO_A206V konnte die Aktivität gegenüber dem Wildtyp um 32 % erhöht werden und die Regioselektivität zugunsten von 3a auf 5,9 ± 0,05 mM (89 %) verschoben werden. Die höhere Aktivität bzw. die gesteigerte Regioselektivität wirkte sich jedoch negativ auf die Stereoselektivität aus, so wurden mit der Punktvariante lediglich 32 %ee für das S-Enantiomer erreicht. Mit dem Austausch von Alanin gegen Isoleucin konnte die Regioselektivität im gleichen Maße unter Beibehaltung der Wildtyp-Stereoselektivität von > 96 %ee beeinflusst werden. In Abbildung 3.25 ist das Docking-Ergebnis des NDOWt und der Punkvarianten NDO_A206V bzw. NDO_A206I dargestellt. Ergebnisse 97 Durch das Docking ließen sich erste Indizien für die deutlich veränderte Regio-selektivität der Valin-Variante erkennen. Die Koordinationsebene des Substrates wurde in silico stark gedreht, sodass die Ethylgruppe stärker gegenüber dem aktivierten Sauerstoff exponiert war. Die erniedrigte Stereoselektivität könnte durch diese Verschiebung und die daraus resultierende höhere Dynamik in der aktiven Tasche erklärt werden. Des Weiteren nimmt das energetisch favorisierte Rotamer des Isoleucins bei der Punktvariante NDO_A206I eine ähnliche Position wie beim Wildtyp ein, weshalb vermutlich die vergleichsweise hohe Stereoselektivität von > 96 %ee beobachtet werden konnte. Im Weiteren wurde der Einfluss des Phenylalanins 352 auf die Stereoselektivität bestätigt.235 Die Aktivität der Valin-Variante war zwar mit 1,1 ± 0,07 mM für 3a stark erniedrigt (15 % Umsatz), konnte jedoch im Bereich der Stereoselektivität nahezu eine Inversion von 98 %ee (R) auf 42 %ee (S) für 3a erzeugen. Wird Phenylalanin mit Alanin oder Isoleucin ersetzt, wurde ebenfalls eine Erniedrigung der Stereoselektivität beobachtet. Der Effekt der kleineren bzw. größeren hydrophoben Aminosäure war jedoch nicht so stark ausgeprägt wie der des Valin-Austausches. Dies könnte unter anderem durch die Sterik bzw. Orientierungsmöglichkeiten des Substrates bedingt sein, da Alanin die Kavität der aktiven Tasche zu stark vergrößert (schlechte Koordination bzw. Wildtyp-Verhalten) und Isoleucin eine zu geringe Erweiterung der Tasche erlaubt. Grundsätzlich ist die allylische Monohydroxylierung gegenüber der Di-hydroxylierung bevorzugt. Dies kann durch die eingangs erwähnte, notwendige Bildung des Intermediats Styrol im Fall der Dihydroxylierungsreaktion bedingt sein. NDO_A206V NDO_A206I Abbildung 3.25: In silico Analyse mittels YASARA AutoDock vina des NDOWt und den Punktvarianten A206V/I mit Ethylbenzol (PDB code: 1O7N; x = 14 Å, y = 15 Å und z = 15 Å entfernt vom Cβ der Position 307; Ethylbenzol und mutierte Aminosäure in sticks; Eisen in orange, molekularer Sauerstoff in rot) NDO Ergebnisse 98 Im Gegensatz zur Katalyse des Alkohols ist für die Bildung des Diols ein Zwei-Schritt-Mechanismus notwendig: Desaturierung und Dihydroxylierung. Dies könnte auch ein Grund für die gegenläufige Stereoselektivität des Diol-Produktes (S für Alkohol und R für Diol) im Vergleich zum Alkohol sein. Bei der Umsetzung von Ethylbenzol (3) wurde der Enantiomerenüberschuss für das Produkt 3a nicht untersucht, jedoch konnte bei der direkten Umsetzung von Styrol zum entsprechenden Diol ein Überschuss des R-Enantiomers festgestellt werden. Diese Beobachtung wirft Fragen über den Ablauf der Desaturierung und der anschließenden Dihydroxylierung auf. Würde das Intermediat aus der Tasche entlassen und für die weitere Katalyse erneut in der aktiven Tasche positioniert werden, wäre eine vergleichbare Stereoselektivität zu erwarten. 1-Phenylpentan Mit fünf C-Atomen wurde mit 1-Phenylpentan (4) der größte Substituent untersucht. Grundsätzlich konnten nur sehr geringe Aktivitäten gegenüber diesem Substrat beobachtet werden, wobei sich die Anzahl von aktiven Varianten auf sechs beschränkte. Lediglich durch den Austausch mit kleinen hydrophoben Aminosäuren (Alanin, Glycin) konnte ein Umsatz des Substrates detektiert werden (s. Abbildung 3.26). Ergebnisse 99 3,7/3,6 Å 0.00.2 0.40.6 0.81.0 1.21.4 1.61.8 NDO pT7-7 F202A V260A GC -P ea kf lä ch e n or m . a uf IS TD [- ] 4c1-Phenylpentanol1-Phenylpenten 4,1Å 3,1 Å 3,4 Å Die Aktivität des Wildtyps konnte mit dem Austausch des Phenylalanins an Position 202 um den Faktor 4,75 gesteigert werden. Des Weiteren wurde neben der allylischen Monohydroxylierung zum entsprechenden Alkohol 4a die Änderung der Reaktionsspezifität in Form des Desaturierungsproduktes 1-Phenylpenten 4b beobachtet. Die Desaturierung könnte durch eine neue Positionierung des Substrates in der aktiven Tasche ermöglicht worden sein (s. Abbildung 3.26, rechts unten). Durch den Austausch der aromatischen hydrophoben Aminosäure Phenylalanin (grau) gegen ein Alanin (orange) wurde die Kavität der aktiven Taschen ins Innere des Proteins verlängert und eine um 180 ° gedrehte Koordination des 1-Phenylpentans im Gegensatz zum Wildtyp ermöglicht. Hierdurch könnte der Substituent näher am Sauerstoff positioniert werden (~ 3,6 Å) und dadurch die neue Reaktivität ermöglichen. Der Austausch des Valins an Position 260 gegen ein Alanin führte weiter zu einer Steigerung der Aktivität (9-fach erhöht). Sowohl der NDOWt als auch die Punktvariante NDO_V260A wiesen noch weitere Produktpeaks auf, welche auf die Bildung von 3- bzw. 4-Pentylcyclohexa-3,5-dien-1,2-diol (4c) hindeuten. Da die detektierte Signalintensität für 4c sehr gering war, wurde die weitere Analyse des vermeintlichen Diol-Produktes 4c ausschließlich Abbildung 3.26: (Li) In vivo Biotransformation von 10 mM 1-Phenypentan (4) zu 1-Phenylpentanol (4a), 1-Phenylpenten (4b) und 3- oder 4-Pentylcyclohexa-3,5-dien-1,2-diol (4c) mit dem NDOWt und ausgwählten Varianten der NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h und (Re) in silico Analyse mittels YASARA AutoDock vina des NDOWt (oben) und der Punktvariante NDO_F202A (unten) mit 4 (PDB code: 1O7N; x = 14 Å, y = 15 Å und z = 15 Å entfernt vom Cβ der Position 307; 1-Phenylpentan und mutierte Aminosäure in sticks; Eisen in orange, molekularer Sauerstoff in rot). Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. NDO NDO_F202A Ergebnisse 100 über das Fragmentierungsmuster der GCMS näher charakterisiert (s. Abbildung 3.27). Basierend auf der Analyse des Fragmentierungsmusters konnten die phenolischen Wasser-Eliminierungsprodukte von 3- bzw. 4-Pentylcyclohexa-3,5-diene-1,2-diol (4c) detektiert werden. Dass auch der NDOWt vermeintliche Spuren des Diols aufweist, scheint bei der Betrachtung des Docking-Ergebnisses mit 4 (s. Abbildung 3.26, rechts) plausibel. Der Abstand des Aromaten von 4 zum aktivierten Sauerstoff lag mit 3,1 bzw. 3,4 Å in einem zur Katalyse geeigneten Bereich. Trotzdem kann aufgrund der niedrigen Aktivitäten von einer schlechten Koordination des Substrates ausgegangen werden, wofür unter Anderem die vielen Rotationsebenen des Substituenten verantwortlich sein können. 3.2.6 Phenylring mit verzweigter Substituenten-Seitenkette tert-Butylbenzol 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 0 25 50 75 100 % 107 16477 9141 51 65 121103 115 13557 76 149141 157 A A B 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00 25 50 75 100 % 107 16477 12141 916553 80 103 135 207 B GCMS V260A 1-Phenylpenten 1-Phenylpentanol Abbildung 3.27: (Li) GCMS-Chromatogramm der analytischen Umsetzung von 1-Phenylpentan (4) mit der Punktvariante NDO_V260A (in schwarz) und den kommerziellen Standards von 1-Phenylpentanol (4a, in grün) und 1-Phenylpenten (4b, in orange); (Re) GCMS-Fragmentierungsmuster der zwei nicht identifizierten Peaks A und B Ergebnisse 101 Neben der Elongation der Seitenkette wirkte sich auch eine Verzweigung der Seitenkette in Form einer ter-Butyl-Gruppe sehr drastisch auf die beobachtete Aktivität aus. Bis auf die Alanin-Variante NDO_L307A konnte bei keiner der Varianten oder dem NDOWt Aktivität festgestellt werden. (s. Abbildung 3.28). Auch die detektierte Aktivität der L307A-Variante war sehr gering, weshalb eine Charakterisierung des Produktes nur mittels GCMS und der Analyse des Fragmentierungsmusters möglich war. Aufgrund der detektierten Fragmente und der Docking-Ergebnisse lag die Vermutung nahe, dass die Alanin-Variante 5 zu 5a katalysiert. Des Weiteren schien eine Positionierung des Substrates in der aktiven Tasche so möglich zu sein, dass ein akzeptable Distanz von 3,5 bzw. 3,9 Å für den Transfer der Sauerstoff-Atome auf den Aromaten bestand. 3.2.7 Phenylring mit ungesättigter Seitenkette Styrol (6), α-Methylstyrol (7) und trans-β-Methylstyrol (8) wurden ausgewählt, um den Einfluss einer ungesättigten Substituenten-Seitenkette und verschiedenen Methylierungsmustern zu untersuchen. 6.0 7.0 min0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0uV(x100,000) 50 100 1500 50 100% 11991 41 77 15010351 11843 65 8976 132 GCFID NDO_L307A NDO pT7-7 NDO_L307A 3,5 Å 3,9 Å Abbildung 3.28: (Li) GCFID-Chromatogramm der analytischen Umsetzung von tert-Butylbenzol (5) mit der Punktvariante NDO_L307A (in schwarz), dem NDOWt (in blau) und der Negativkontrolle mit dem Leervektor pT7-7 (in orange); (Mi) GCMS-Fragmentierungsmuster des vermeintlichen Diols 5a mit charakteristischen Fragmenten als Strukturformal dargestellt; (Re) In silico Analyse mittels YASARA AutoDock vina der Punktvariante NDO_L307A mit 5 (PDB code: 1O7N; x = 14 Å, y = 15 Å und z = 15 Å entfernt vom Cβ der Position 307; tert-Butylbenzol und mutierte Aminosäure in sticks; Eisen in orange, molekularer Sauerstoff in rot) Ergebnisse 102 -50 -30 -10 10 30 50 70 90 F202H295N297F352A206V209L253L307G204F224V260W358 eeR-1-Phenylethan-1,2-diol [%] 0 2 4 6 8 10 F202 H295 N297 F352 A206 V209 L253 L307 G204 F224 V260 W358 c 1 -P he ny le th an -1 .2 -d io l [ m M ] Ala Val Ile Styrol Styrol (6) wurde von den meisten Varianten mit moderaten bis exzellenten Umsätzen (4 - 9 mM) zum entsprechenden 1-Phenylethan-1,2-diol (6a) umgesetzt. Hierbei konnten mit dem Austausch gegen Alanin bzw. Glycin an den Positionen 202, 206 und 295 Verbesserungen hinsichtlich der Gesamtaktivität erreicht werden (s. Abbildung 3.29). Die Alanin-Varianten H295A, F224A und V260A sowie die Glycin-Variante A206G zeigten bis zu 92 % Umsatz. Des Weiteren bleibt zu vermerken, dass der Austausch des Asparagins zu Isoleucin an Position 297 nicht wie bei der Umsetzung von Ethylbenzol zur Ausbildung einer inaktiven Variante führte, sondern Wildtyp-Verhalten beobachtet wurde. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass trotz des gleichen zu erwartenden Produktes unterschiedliche Mechnismen für die Umsetzung von 3 und 6 bestehen könnten. Im Fall der Position W358 führte die Vergrößerung der ausgetauschten Aminosäure (Ala zu Val zu Ile) zur Wiederherstellung der Wildtyp-Aktivität. Im Gegensatz dazu konnte beim Austausch von Glycin an Position 204 gegen Valin bzw. Isoleucin einem Einbruch der Aktivität beobachtet werden, womit die Effekte bei der Umsetzung des natürlichen Substrates Naphthalen (1) bestätigt Abbildung 3.29: (Re) In vivo Biotransformation von 10 mM Styrol (6) zu 1-Phenylethan-1,2-diol (6a) mit dem NDOWt (schwarzer Strich) und der NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h und (Li) Stereoselektivitäten für das dihydroxylierte Produkt 6a mit dem NDOWt als schwarzer Strich. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 103 0 20 40 60 80 100 F202H295N297F352A206V209L253L307G204F224V260W358 eeS-2-Phenylpropan-1,2-diol [%] Ala Val Ile wurden. Eine Vermutung für diese Phänomen stellte die Störung der Elektronik in der Umgebung des mononuklearen Eisens dar. So wurde von Parales et al. (1999) die Asparaginsäure an Position 205 als essentiell für den Elektronentransfer beschrieben.176 Durch Einsatz von größeren Aminosäuren an Position 204 könnte dieser Transfer gestört werden. Im Fall der Stereoselektivität wurde bei den meisten Varianten eine Präferenz des R-Enantiomers festgestellt. Der NDOWt zeigt mit 78 %ee (R) bereits eine moderate Stereoselektivität, welche mit der Einzelvariante NDO_F202A auf 87 %ee (R) gesteigert werden konnte. Wie bereits bei Ethylbenzol (3) konnte beim Einsatz der Valin- bzw. Isoleucin-Variante an Position 352 die Stereoselektivität mit 46 %ee (S) bzw. 26 %ee (S) nahezu invertiert werden. α-Methylstyrol (7) wird zu dem monohydroxylierten 3-Hydroxyphenylpropen (7a) und dem dihydroxylierten 2-Phenylpropan-1,2-diol (7b) umgesetzt. α-Methylstyrol In Tabelle 3.7 sind die Umsätze mit den Einzelvarianten und dem NDOWt, sowie die erreichten Stereoselektivitäten für das Diol-Produkt 7b dargestellt. Tabelle 3.7: (Li) Umsätze und Produktverteilung der Einzelvarianten der NDO-Bibliothek und (Re) Stereoselektivitäten für das dihydroxylierte Produkt 7b mit NDOWt als schwarzer Strich Umsatz [%] und Produktverteilung (3a:3b) Ala Val Ile NDO 53 (47:53) pT7-7 n. d. F202 55 (40:60) 39 (48:52) 36 (50:50) H295 50 (22:78) 35 (22:78) 50 (18:82) N297 44 (37:63) 37 (58:42) 44 (74:26) F352 3 (77:23) 40 (7:93) 55 (13:87) A206* 68 (45:58) 67 (76:24) 67 (75:25) V209* n. d. n. d. 50 (47:53) L253 54 (36:64) 46 (56:44) 63 (47:53) L307 44 (35:65) 60 (31:69) n. d. G204 46 (45:55) n. d. n. d. F224 41 (44:56) 46 (53:47) 48 (52:48) V260* 53 (34:66) 56 (34:66) 61 (45:55) W358 n. d. 25 (39:61) 55 (39:61) * statt A/V entsprechend G ausgetauscht; n. d.: nicht detektiert Ergebnisse 104 Mit der Position 206 wurde die aktivste Variante für das Substrat 7 identifiziert, wobei bis zu 68 % Umsatz erreicht werden konnten. Jedoch wies diese Variante weder eine erhöhte Stereo- noch eine erhöhte Reaktionspsezifität auf. Im Gegensatz dazu wurde der Einfluss der Einzelvariante NDO_F352V auf die Selektivität bestätigt, die Produktverteilung konnte zugunsten des Diol-Produktes 7b (13:87) verschoben werden, die Wildtyp-Aktivität blieb dabei erhalten. Sämtliche Aminosäureaustausche an Position H295 wiesen eine ähnliche Reaktionsspezifität auf und zeigten vermehrt die Bildung von 7b. Des Weiteren konnte unter Verwendung der Alanin-Variante die Stereoselektivität für das S-Enantiomer von 55 auf 71 %ee (S) erhöht werden. Auch die Substitution an den Positionen F202 und V260 bewirkte eine Steigerung der Stereoselektivität, im Fall des Austausches des Phenylalanins an Position 202 wurde ein Enantiomerenüberschuss von 80 %ee (S) detektiert. Mit dem Einsatz der Variante NDO_V260G konnte der Enantiomerenüberschuss weiter auf 87 %ee (S) erhöht werden. Jedoch wiesen sowohl die Einzelvarianten an Position 202 sowie an Position 260 keine hohe Reaktionsselektivität auf, die Bildung des monohydroxylierten Produktes 7a sowie des dihydroxylierten Produktes 7b wurde zu gleichen Teilen beobachtet. Der Austausch des Valins an Position 209 gegen Alanin oder Glycin führte bisher bei jeder Umsetzung zu einer drastischen Reduktion der Aktivität, welche durch den Austausch mit Isoleucin teilweise wiederhergestellt werden konnte. Diese Beobachtung wurde ebenfalls bei der Umsetzung von 1 und 3 festgestellt. Da in unmittelbarer Nähe zu dieser Position eines der Eisen-koordinierenden Histidine (H208) lokalisiert ist, liegt auch hier wieder die Vermutung nahe, dass die empfindliche Elektronik der komplexen Katalysemaschinerie durch Aminosäuren-Austausche an Position V209 gestört wird. Wie bereits bei der Umsetzung von 6 konnte bei den Punktvarianten G204V bzw. G204I keine Aktivität beobachtet werden. Auch hier wird ein störender Effekt, sterisch oder elektronisch, vermutet. Der Austausch gegen größere Aminosäuren an dieser Position könnte zur Relokalisierung des Proteinrückgrats führen, wodurch die Distanzen für den Elektronentransfer über die Position D205 gestört werden. Mit der Umsetzung von 7 mit der erweiterten in vivo NDO-Bibliothek bestehend aus Doppelvarianten konnte keine weitere Steigerung der Aktivität beobachtet werden, Ergebnisse 105 54 85 90 83 50 31 010 2030 4050 6070 8090 100 ee S- 2- Ph en yl pr op an -1 ,2 -d io l [ % ] 010 2030 4050 6070 8090 100 Pr od uk tv er te ilu ng [% ] 7b7a allerdings wurden Effekte auf die Reaktions- und Stereoselektivität detektiert. In Abbildung 3.31 sind die besten Doppelvarianten und der NDOWt dargestellt. Abbildung 3.30: (Li) Produktverteilung der in vivo Umsetzungen von 10 mM α-Methylstyrol (7) zu 3-Hydroxyphenylpropen (7a) und 2-Phenylpropan-1,2-diol (7b) bei 30 °C für 20 h und (Re) Stereoselektivitäten für das Diol-Produkt 7b. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Durch die Kombination der Positionen V260 und H295 und der Generierung der Doppelvariante V260A_H295A konnten die positiven Effekte hinsichtlich der Produktverteilung und der Stereoselektivität beibehalten bzw. leicht gesteigert werden. Die Doppelvariante V260G_H295A zeigte mit einem Enantiomeren-überschuss von 90 %ee (S) die höchste Präferenz für das S-Enantiomer und konnte somit die hohe Selektivität der Glycin-Variante mit der hohen Reaktionsselektivität der Einzelvariante H295A verbinden. Wurde die Position 206, welche bei der Umsetzung von 7 die Bildung des Alkohols 7a bevorzugt wurde, mit Position H295 kombiniert, resultierte dies in einer starken Präferenz für das monohydroxylierte Produkt mit einem einhergehenden Verlust der Stereoselektivität für das Diol-Produkt 7b. Gerade bei Reaktionsräumen, die sehr nah beieinander liegen (Methylgruppe und C=C-Doppelbindung in 7), ist eine exzellente und präzise Koordination des Substrates für eine hohe Reaktionsselektivität notwendig. Die Identifizierung von vier Positionen, welche alle über die ganze Länge der aktiven Tasche verteilt sind, aber dennoch einen deutlichen Einfluss auf die Katalyse von 7 zeigen, lässt auf ein komplexes Koordinationsnetzwerk schließen. Die richtige Kombination von diesen Ergebnisse 106 Positionen könnte demnach zu einer hohen Reaktions- und Stereoselektivität führen. Dass bereits der Grundstein hierfür gelegt ist, lässt sich an der Abwesenheit des am Ring hydroxylierten Produktes erkennen. Durch die Evolution der aktiven Tasche kann keine produkive Konformation für eine Ringhydroxylierung mehr generiert werden. trans-β-Methylstyrol Bei der Umsetzung von trans-β-Methylstyrol (8) wurden sowohl der monohydroxylierte Zimtalkohol (8a) als auch das dihydroxylierte Produkt 8b, 1-Phenylpropan-1,2-diol, detektiert. Der NDOWt zeigte absolute Reaktionsspezifität, wodurch mit 2,3 ± 0,3 mM der Alkohol 8a als alleiniges Produkt beobachtet werden konnte. Bei der Untersuchung der NDO-Bibliothek wurden Positionen identifiziert, welche auch die Bildung des Diols 8b möglich machten. So wurde vor allem beim Austausch von aromatischen Aminosäuren ein Shift in der Reaktionsselektivität festgestellt. Der Austausch des Phenylalanins an Position 202 gegen ein Alanin lieferte mit 23 % Umsatz und einer Produktverteilung von 31:69 (8a:8b) die aktivste Diol produzierende Variante. Die Kavität der aktiven Tasche wurde durch den Austausch des Phenylalanins der Länge nach gestreckt und vermutlich wird dem Substrat bzw. der endständigen Methylgruppe deshalb erlaubt weiter am Eisen vorbeigeführt zu werden, wodurch die C=C-Doppelbindung für die Katalyse exponiert wird. Ein ähnliches Szenario konnte für den Austausch des Phenylalanins an Position 352 beobachtet werden. Die Punktvarianten F352V und F352I wiesen lediglich das dihydroxylierte Produkt 8b auf. Neben der bereits mehrfach erwähnten Position 206 konnte auch bei der Umsetzung von 8 mit den Punktvarianten V260A bzw. V260G die Bildung des Diol-Produktes 8b beobachtet werden. Die Punktvariante NDO_V260G zeigte mit einem Umsatz von 21 % die höchste Selektivität für 8b mit 8:92 (8a:8b). Die erzeugte Reaktionsselektivität konnte mit der in silico Analyse in Einklang gebracht werden (s. Abbildung 3.31). Zum Teil konnten exzellente Stereoselektivitäten für das produzierte Diol 8b erreicht werden. So wiesen alle Varianten der Position 202 einen Enantiomerenüberschuss größer 87 %ee (S,S), im Fall der NDO_F202A wurde die Selektivität auf > 99 %ee für das (S,S)-Enantiomer erhöht. Außerdem konnte der Ergebnisse 107 Einfluss auf die Stereoselektivität der Position 352 weiter bestätigt werden. Bei der Umsetzung von 8 wurde die Stereoselektivität für das produzierte Diol auf bis zu 19 %ee (R,R) invertiert. Die Analyse von trans-β-Methylstyrol lieferte zwei Hypothesen: (1) aromatische Aminosäuren sind wichtig für die Steuerung der katalytischen Maschinerie (Stabilisierung der Koordination von Substraten über π- π-Wechselwirkungen) und (2) Erweiterung der Kavität der aktiven Tasche lässt mehr Rotation des Substrates zu und ermöglicht dadurch neue Reaktionsselektivität. Allylbenzol Bei der Umsetzung von Allylbenzol (9) wurden die Bildung von 1-Phenyl-allylalkohol (9a) und 3-Phenylpropan-1,2-diol (9b) beobachtet. Das Hauptprodukt der Umsetzungen von sämtlichen Varianten wurde als das Diol-Produkt 9b identifiziert (s. Anhang Abbildung 6.22). Wiederum kristallisierten sich die Positionen 202, 206 und 260 als maßgeblich für die Steuerung der Selektivität heraus. Bei einem Umsatz von 52 % wurde bei der Einzelvariante NDO_ A206G eine Produktverteilung von 19:81 (9a:9b) detektiert und könnte als Startpunkt für das Abbildung 3.31: In silico Analyse mittels YASARA AutoDock vina des NDOWt und unterschiedlicher Punktvarianten mit trans-β-Methylstyrol (PDB code: 1O7N; x = 14 Å, y = 15 Å und z = 15 Å entfernt vom Cβ der Position 307; trans-β-Methylstyrol und mutierte Aminosäure in sticks; Eisen in orange, molekularer Sauerstoff in rot) NDO NDO_F352V NDO_F202V NDO_V260G Ergebnisse 108 protein engineering der NDO in Richtung Monohydroxylierung im Fall einer endständigen Doppelbindung dienen. Die Stereoselektivität war sowohl bei den Einzel- als auch bei den Doppelvarianten durchgehend > 86 %ee (R), bei den meisten Variante sogar > 95 %ee (R). Als einzige Ausnahme stellte sich die Einzelvariante NDO_F352I heraus, welche wie schon in vorangegangenen Untersuchungen, einen starken Einfluss auf die Selektivität ausübte und diese auf 41 %ee (R) senkte. Grundsätzlich konnte beobachtet werden, das bei einer endständigen C=C-Doppelbindung bzw. einer nicht-konjugierten Doppelbindung zum aromatischen System die Dihydroxylierung bevorzugt wurde. Des Weiteren wurden exzellente Stereoselektivitäten erreicht, was auf eine stabile Koordination des Substrates hinweist. 3.2.8 Phenylring mit ungesättigter Seitenkette und p-Methoxy-Gruppe Um den Einfluss einer weiteren Substitution am Phenylring auf die Reaktionsspezifität (Dihydroxylierung versus O-Demethylierung) zu untersuchen, wurden 4-Methoxystyrol (11) und 4-Allylanisol (10) ausgewählt. 4-Methoxystyrol Die Umsetzung von 4-Methoxystyrol (11) resultierte in 4-Vinylphenol (11a) als Produkt der Demethylierungsreaktion und 1-(4-Methoxyphenyl)-ethan-1,2-diol (11b) als Produkt der Dihydroxylierungsreaktion. Bei allen untersuchten Varianten wurde eine Präferenz für die Dihydroxylierung der konjugierten Doppelbindung beobachtet. Dabei stellten sich die in Abbildung 3.8 aufgeführten Varianten als besonders geeignet heraus. Ergebnisse 109 Abbildung 3.8: Relative Aktivität zum NDOWt von ausgewählten in vivo Biotransformationen mit ruhenden Zellen (0,2 mgBFM/mL) bei der Umsetzung von 4-Methoxystyrol (11, links) mit Stereoselektivitäten und Produktverteilung (rechts) Mit dem Einsatz der Punktvariante A206G wurde die Aktivität um den Faktor zwei gegenüber dem Wildtyp erhöht. Des Weiteren zeigte diese Variante eine ausgezeichnete Reaktionsselektivität von 5:95 (11a:11b). Im Gegensatz dazu wurde durch die Methoxy-Gruppe die Stereoselektivität gegenüber der Umsetzung von Styrol (6a mit 80 %ee (R)) drastisch gesenkt. Die Einzelvariante NDO_L307A wies bei ebenfalls gutem Umsatz (175 %) mit 77 %ee (R) die höchste Stereoselektivität auf. Durch den Austausch des Phenylalanins an Position 352 wurde die Aktivität stark gesenkt, im Fall der Stereoselektivität konnte wieder eine Inversion hinzu 57 %ee (S) beobachtet werden. Zeigten die Varianten bei Allylbenzol (9) noch absolute Reaktionsselektivität für die Dihydroxylierung der isolierten Doppelbindung, veränderte sich die Reaktions-selektivität beim Einbringen einer Methoxy-Gruppe bei der Untersuchung von 4-Allylanisol (10) deutlich. 4-Allylanisol Stereoselektivität [%] Produktverteilung (11a:11b) F202A n. b. (24:76) H295A 46 (R) (16:84) F352V 57 (S) (18:82) F352I 50 (S) (14:86) A206G 38 (R) (05:95) V209I 54 (R) (01:99) L253A 47 (R) (18:82) L307A 77 (R) (18:82) F224A 54 (R) (31:69) V260A 54 (R) (01:99) n. b.: nicht bestimmt 020 4060 80100 120140 160180 F202A H295A F352V F352I A206G V209I L253A L307A F224A V260A Re la ti ve A kt iv itä t N D O W t[% ] Ergebnisse 110 01 23 45 67 8 Wt pT7-7 F202 H295 N297 F352 A206* V209* L253 L307 G204 F224 V260* W358 c 4 -A lly lp he no l [ m M ] AlaValIle Bei der Umsetzung von 4-Allylanisol (10) wurde lediglich das demethylierte 4-Allylphenol (10a) detektiert. Hierbei resultierte jede eingebrachte Variation zur Wildtyp-Sequenz in der Reduktion der Aktivität (s. Abbildung 3.32). Bei der Umsetzung von Allylbenzol (9) wurde NDO_A206G als eine der besten und aktivsten Varianten identifiziert, wurde dem Substrat ein weiterer Subsituent in Form einer Methoxy-Gruppe hinzugefügt, nahm die Aktivität stark ab. Allein eine Variation am Eingang der aktiven Tasche, NDO_L253A, konnte an die Wildtyp-Aktivität anknüpfen. Grundsätzlich war der NDOWt mit 6,2 ± 0,6 mM 4-Allylphenol (10a) am Besten für die Umsetzung von 10 geeignet. Jedoch bleibt zu hinterfragen, warum der polarere Teil des Substrates bevorzugt in die hydrohobe Tasche geleitet wird und als Hauptprodukt 10a zu beobachten ist. Die Orientierung des Substrates, bei welcher der unpolare, ungesättigte Substituent in produktiver Koordination zum Eisen kooridiniert werden würde, hätte den Vorteil, dass der polare Teil des Substrates nicht die hydrophobe Tasche passieren müsste. Diese Konformation scheint jedoch nicht favorisiert zu sein, da dies zu einer Dihydroxylierung des Substrates führen würde. Neben dem Einfluss der Polarität spielt auch die für die Reaktion notwendige Energie eine Rolle. So bleibt die Frage offen, ob die Demethylierung der Dihydroxylierung nur deshalb vorgezogen wird, weil die Dihydroxylierung einer isolierten Doppelbindung energetisch aufwändiger ist als die Abbildung 3.32: In vivo Biotransformation von 10 mM 4-Allylanisol (10) zu 4-Allylphenol (11a) mit dem NDOWt und der NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h (*: Gly). Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 111 Demethylierung einer Methoxy-Gruppe. 3.2.9 Monoterpen R-Limonen R-Limonen wurde als Sonde für die Erweiterung des Substratraumes hinsichtlich nicht-aromatischer, nicht-planarer Moleküle verwendet. Die NDO-Bibliothek und die Erweiterung der Bibliothek bestehend aus Doppelvarianten wurde in vivo mit ruhenden Zellen untersucht. R-Limonen Die Umsetzung von R-Limonen (12) resultierte in den monohydroxylierten Produkten Carveol (12a) und Mentha-1,8-dien-10-ol (12b). In Abbildung 3.33 sind die aktivsten Varianten und der NDOWt dargestellt. Wiederum zeigten sich die Positionen 295, 206 und 260 als Schlüsselpositionen zur Steigerung der Selektivität und Aktivität. Mit der Alanin-Variante an Position H295 wurde die Produktverteilung gegenüber dem Wildtyp invertiert. Mit dem Austausch von Alanin gegen Glycin und Valin gegen Alanin wurden mit NDO_A206G bzw. NDO_V260A zwei sehr aktive Varianten (verglichen mit dem NDOWt) generiert. Hierbei wurde bevorzugt das monohydroxylierte Produkt Mentha-1,8-dien-10-ol (12b) gebildet. Wird nun eine für Carveol (12a) selektive Variante mit einer sehr 01 23 45 67 GC -P ea kf lä ch e n or m . a uf IS TD [- ] CarveolMentha-1,8-dien-10-ol 0 20 40 60 80 100 Pr od uk tv er te ilu ng [% ] Abbildung 3.33: (Li) In vivo Umsetzungen von 10 mM R-Limonen (12) zu Carveol (12a) und Mentha-1,8-dien-10-ol (12b) mit NDOWt und Varianten bei 30 °C für 20 h und (Re) Prozentuale Verteilung der Produkte. Alle Experimente wurden als Triplikate durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Ergebnisse 112 aktiven Variante, NDO_V260A, kombiniert, war ein additiver Effekt der Eigenschaften zu erkennen. Die Selektivität von H295A blieb erhalten und wurde mit der Aktivität von NDO_V260A verbunden. Diskussion 113 4 Diskussion Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential des Biokatalysators Naphthalen Dioxygenase von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 im in vitro und in vivo System hinsichtlich der Eignung zur heterologen Expression in Escherichia coli, sowie die Steuerung der Selektivität und Spezifität durch das Einbringen von Punktmutationen in die aktive Tasche untersucht. Hierdurch wurden sechs Positionen identifiziert, die für die Steuerung der Selektivität und Spezifität verantwortlich sind. 4.1 In vitro Untersuchung des Multikomponentenkomplexes Naphthalen Dioxygenase Im Zuge der in vitro Untersuchungen wurden verschiedene Aspekte des Enzymsystems beleuchtet: (1) Katalyse im zellfreien Milieu, (2) Beurteilung der Stabilität der Einzelkomponenten und (3) Einfluss von Aminosäureaustauschen in der first shell gegen kleinere hydrophobe Aminosäuren (Ala, Val, Ile), sowie Aminosäureaustausche basierend auf der Konsensussequenz. Katalyse im zellfreien Milieu: Reaktionssetup Für die Untersuchung der Naphthalen Dioxygenase (NDO) wurde eine Varianten-bibliothek bestehend aus zwölf Alanin bzw. Glycin-Varianten der aktiven Tasche generiert und die entsprechenden Oxygenasen über Affinitätschromatographie gereinigt (s. Kapitel 3.1.3). Bei der Umsetzung von Naphthalen (1) mittels des gereinigten NDOWt konnte innerhalb von 2 h 75 % Umsatz des Substrates detektiert werden. Durch dieses Reaktionssetup ist es möglich, sowohl Verbesserungen als auch Verschlechterungen gegenüber dem NDOWt durch eingebrachte Mutationen festzustellen. Allgemein zeigten in vitro Varianten im Vergleich zu den in vivo getesteten, entsprechenden Alanin bzw. Glycin-Varianten eine deutlich geringere Aktivität in den durchgeführten Biotransformationen. So setzte die Punktvariante NDO_A206G, eine der aktivsten Varianten des NDOWt, in vivo 70 % des eingesetzten Substrates (10 mM Toluol) um, bei der in vitro Umsetzung von Toluol mit derselben Variante wurde lediglich ein Umsatz von 10 % detektiert. Dieses Phänomen konnte Diskussion 114 auch bei anderen Varianten festgestellt werden und könnte auf eine mangelnde Stabilität des Multienzymkomplexes im in vitro System hindeuten. Grundsätzlich kann bei Mehrkomponentensystemen eine geringere spezifische Aktivität als bei Einzekomponentensystemen in gereinigter Form festgestellt werden (nmol statt µmol).238 Katalyse im zellfreien Milieu: Kopplungseffizienz Des Weiteren ist bei Mehrkomponentensystemen auch die Kopplungseffizienz zwischen verbrauchtem Cofaktor und der stattgefundenen Produktoxidation mit in Betracht zu ziehen. Deshalb wurde in in vitro Experimenten mit einem 2,5-fachen Überschuss an Cofaktor gegenüber der eingesetzten Substratmenge gearbeitet. Ist jedoch die Kopplungseffizienz niedrig, kann durch Wasserstoffperoxid (H2O2)-Bildung die Aktivität in in vitro Ansätzen stark reduziert werden.208 So wurde in in vitro Biotransformationen die Bildung von H2O2 beobachtet, wenn (I) die Kopplungseffizienz der Redoxpartner mit der katalytischen Oxygenase niedrig ist, oder wenn (II) die Redoxpartner im Überschuss vorlagen.208 Da sich im untersuchten in vitro System keine Katalase befand, ist eine Inaktivierung der katalytisch aktiven Dioxygenase durch Reaktion des H2O2 mit dem mononuklearen Eisen möglich.239 Die irreversible Inaktivierung der Dioxygenase wurde von Lee (1999) als eine Fenton-Reaktion beschrieben, wobei durch die Reaktion von H2O2 mit dem mononuklearen Eisen stark oxidative Spezies wie Hydroxyl-Radikale entstehen. So konnten Jouanneau und Kollegen (2006) bei der Untersuchung einer Naphthalen Dioxygenase aus Sphingomonas sp. CHY-1 eine stark vom Substrat abgängige Kopplungseffizienz beobachten.208 Wurden bei der Umsetzung des natürlichen Substrates Naphthalen 460 ± 20 nmol min-1 mg-1 Sauerstoff aufgenommen, konnte die Bildung von 418 ± 20 nmol min-1 mg-1 Dihydrodiol beobachtet werden, was einem Koeffizienten von 1,03 entspricht. Die Veränderung des Substrates hinsichtlich eines zusätzlichen aromatischen Ringes (Anthracen) reduzierte das Verhältnis auf 0,36. Verfügte das Substrat bereits über Hydroxy-Gruppen, wie im Fall von 1,2-Benz[α]anthracen-diol, verschlechterte sich die Kopplungseffizienz weiter auf < 0,01. Gerade im in vitro System ist deshalb eine gute Diskussion 115 Kopplung wichtig, da keine wirtseigenen Enzyme das potentiell entstehende Wasserstoffperoxid abbauen können. Stabilität der Einzelkomponenten: Verhältnis von Oxygenase, Ferredoxin und Reduktase Im Zuge der Optimierung des in vitro Systems wurden die Verhältnisse der unterschiedlichen Komponenten variiert: (I) mit 1 µM Oxygenase, 20 µM Ferredoxin und 5 µM Reduktase sowie (VI) mit 1 µM Oxygenase, 12 µM Ferredoxin und 3 µM Reduktase. Das Elektronenshuttle-Molekül Ferredoxin wurde dabei stets im Überschuss zugegeben. Bereits 1994 konnten Tan und Kollegen zeigen, dass die Zugabe von Ferredoxin im Überschuss sich als aktivitätssteigernd auf die Benzol Dioxygenase (BDO) von Pseudomonas putida ML2 auswirkte.240 So steigerte ferner die Zugabe von gereinigten Ferredoxin zu einem Zellextrakt der BDO exponentiell die detektierte Aktivität: bei Zugabe von 10 µg Ferredoxin konnte eine Aktvität von 20 nmol/min beobachtet werden, bei der Zugabe von 50 µg Ferredoxin bereits eine Aktivität von 65 nmol/min. Wurde zusätzlich gereinigte Reduktase hinzugegeben, konnte auch hier bei Zugabe von 10 µg gereinigtem Enzym ein linearer Anstieg der Aktivität bis auf 20 nmol/min beobachtet werden. Jedoch wurde ein geringerer Einfluss auf die Aktivität verzeichnet als bei der Zugabe von Ferredoxin. Deshalb liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei dem Ferredoxin um das entscheidende Bottleneck in der Elektronentransportkette handelt. Der Vollständigkeit halber wurde auch der Effekt einer weiteren Zugabe der Oxygenase untersucht, wobei jedoch keine Aktivitätssteigerung beobachtet werden konnte. Die Untersuchungen von Tan und Kollegen wurden durch weitere Studien unterstützt, in welchen ein Überschuss an Ferredoxin und Reduktase für die Erhöhung der Aktivität notwendig war.208 Des Weiteren konnte bei der industriellen Produktion von Indigo durch Genencor gezeigt werden, dass eine vermehrte Expression des Ferredoxins in einer höheren Produktausbeute resultierte.241 Diskussion 116 Stabilität der Einzelkomponenten: Verhältnis von Oxygenase, Ferredoxin und Reduktase Die Reinigung der hexameren Dioxygenase (α3β3) wurde lediglich über einen His-Tag an der α-Untereinheit bewerkstelligt. Es wurde stets davon ausgegangen, dass die Affinität der β-Untereinheit zu der großen α-Untereinheit für eine gemeinsame Reinigung ausreicht. Die erniedrigte Aktivität in den in vitro Experimenten könnte deshalb mitunter das Resultat eines bestehenden Missverhältnisses von α- und β-Untereinheit (1 : < 1) sein. In den meisten Dioxygenasen wird der β-Untereinheit nämlich eine stabilisierende Funktion zugeschrieben, wobei in manchen Fällen auch ein Einfluss auf die Substratspezifität durch die Untersuchung von Hybridenzymen beobachtet werden konnte.242 Aufgrund der Reinigung könnte die nicht-kovalent gebundene β-Untereinheit bei der Reinigung zumindest teilweise vor der Zielfraktion eluiert worden sein. Einfluss von Aminosäureaustauschen in der aktiven Tasche Da die zwölf in vitro generierten Varianten auch in das in vivo System übertragen wurden, werden die beobachteten Effekte der unterschiedlichen Aminosäure-austausche im in vivo System in Kapitel 4.2 diskutiert. Einfluss von Aminosäureaustauschen basierend auf der Konsensussequenz Bei der Umsetzung des Modellsubstrates Styrol (6) mit den 24 generierten Konsensusvarianten konnte bis auf wenige Ausnahmen (N363G, N297H, S360Q) mit allen untersuchten Varianten eine mit dem Wildtyp der Naphthalen Dioxygenase vergleichbare oder leicht verbesserte Aktivität (bis ~ 130 %) erzielt werden. Varianten, die basierend auf dem Sequenzmotiv NWK-x(3)-[ED]-[NQ]-x(3)-[DE]-x-Y-H201 (s. Kapitel 3.1.3) generiert wurden, zeigten dabei die stärksten Effekte. Der erste variable Abschnitt (x(3)) wurde mit A197F, P198A und der Doppelvariante A197F_P198A untersucht, wobei eine 10-20 %ige Steigerung der Aktivität erreicht werden konnte. Der nächste variable Abschnitt (x(3)) enthält die Positionen 202-204. Hierbei konnte für die Position F202 eine starke Reduktion der Aktivität in den in vitro Versuchen festgestellt werden. Phenylalanin stellt in der Tasche der NDO eine zentrale Aminosäure dar, durch deren Austausch bereits ein Regioshift in der Diskussion 117 Dihydroxylierung von aromatischen Substraten beobachtet werden konnte.185 Die Varianten an Position V203 mit den Aminosäuren Cystein bzw. Alanin, zeigten eine deutliche Steigerung (bis zu 30 %) beim Umsatz von Styrol (6). Da sich die Position V203 in unmittelbarar Nachbarschaft zur, als Elektronenbrücke fungierenden, Asparaginsäure 205 befindet, könnte durch den Einsatz einer kleinen hydrophoben Aminosäure eine verbesserte Positionierung von D205 begünstigt werden. Der essentielle Einfluss der Position 205 auf den Elektronentransfer wurde von Parales et al. (1999) bereits beschrieben.176 Weitere Substitutionen im Sequenzbereich um die Position D205 in dieser Arbeit verdeutlichen die Sensibilität dieser Region. Die Aktivität wurde vor allem dann stark erniedrigt, wenn bestehende Aminosäuren gegen größere Aminosäuren ausgetauscht wurden (z. B. G204V/L). Am Ende des Motivs befindet sich eine weitere variable Region x mit der Position 206. Dabei konnte der Austausch des vorhandenen Alanins gegen ein Glycin die Aktivität um ~ 20 % steigern. Der Einfluss der Position 206 wurde auch in anderen Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen untersucht, wobei ebenfalls der Ansatz über einen Sequenzvergleich gewählt wurde. Durch Aminosäureaustausche an der korrespondierenden Position konnte eine deutliche Erweiterung des Substrat-spektrums, sowie die generelle Beibehaltung bzw. Steigerung der Aktivität beobachtet werden.189 Gally und Kollegen konnten in Untersuchungen der Cumol Dioxygenase (CDO) zeigen, dass der Austausch des Methionins an der entsprechenden Position 206 (CDO: M232) gegen ein Alanin den Umsatz des sterisch anspruchsvollen (+)-α-Pinens zum korrespondierenden Diol ermöglichte. Jedoch scheinen noch weitere Strukturmerkmale bzw. Positionen in der aktiven Tasche für den erweiterten Substratraum verantwortlich zu sein, da die Untersuchung der strukturell und sequenzell ähnlichen Benzol Dioxygenase (BDO)14 mit der entsprechenden Punktvariante BDO_M220A keine Erweiterung des Substratraumes zur Folge hatte. Abschließend kann für die in vitro Untersuchungen eine positive Bilanz gezogen werden. Im Rahmen der Optimierung des in vitro Systems konnte durch die Umsetzung mit unterschiedlichen Verhältnissen an Oxygenase und Redoxpartnern die Redoxkette als wichtige Stellschraube für die Aktivität identifiziert werden. Der 14 Sequenzidentität: 64 % mit Cumol Dioxygenase; 32 % mit Naphthalen Dioxygenase Diskussion 118 für die Erhöhung der Aktivität notwendige Überschuss an Ferredoxin und Reduktase lieferte neue Ansätze hinsichtlich des protein engineerings für die Generierung von stabileren Redoxvarianten oder der Entwicklung von Hybridsystemen. Weiterhin besteht der Vorteil des entwickelten in vitro Systems darin, dass eine weitere Umsetzung der Produkte durch wirtseigene Enzyme unterbunden wird und zukünftig die Analyse von unbekannten Substanzen erleichert werden wird. Außerdem konnten bereits im in vitro System relevante Mutagenese-Hotspots mit den Positionen A206, H295, L307, G204 und V260 identifiziert werden. Des Weiteren wurden bei der Untersuchung der Konsensusvarianten mit Styrol Positionen identifiziert, welche zu einer Aktivitätssteigerung führten. Die Kombination von Varianten in der aktiven Tasche mit entsprechenden Konsenussequenzvarianten könnte deshalb eine weitere Optimierungsmöglichkeit des Mehrkomponentensystems NDO darstellen. 4.2 Naphthalen Dioxygenase im in vivo System Heterologe Expression der Naphthalen Dioxygenase Im Rahmen der in vivo Experimente wurde zunächst die stabile, heterologe Expression des Multikomponentenkomplexes in Escherichia coli (E. coli) untersucht, da dies einen essentiellen Faktor für reproduzierbare Ergebnisse in Ganzzell-umsätzen darstellt. Die heterologe Expression von Oxygenasen stellt deshalb eine Herausforderung dar, weil nicht nur ganze Gencluster transkribiert und translatiert werden müssen, sondern auch eine geeignete Rate zwischen den unterschiedlichen Komponenten gefunden werden muss.243,244 Im Fall der untersuchten Naphthalen Dioxygenase (NDO) wurden eine Reihe von Optimierungsversuchen unternommen, um die Über-expression des Multikomponentensystems zu forcieren und dadurch im in vivo System einen Ansatz für einen photometrischen, quantifizierbaren Nachweis des Katalysators zu generieren.176 Jedoch konnte trotz einer breit angelegten Palette an Parametern, welche von der Untersuchung von verschiedenen Vektoren über unterschiedliche E. coli Stämme, bis hin zur Kombination verschiedener Expressionsbedingungen reichte, keine sichtbare Expression des Multi-komponentenkomplexes mittels SDS-PAGE erlangt werden. Jedoch können mit dem Diskussion 119 in dieser Arbeit etablierten Expressionprotokoll hohe Produktausbeuten und eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleistet werden. Das Unvermögen die NDO in quantifizierbaren Mengen zu exprimieren scheint sich nicht auf die verwandten, CDOlike/TDOlike Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen zu erstrecken. So konnte beispielsweise die Biphenyl Dioxygenase (BPDO) in E. coli BL21(pLysS) überexprimiert und mittels SDS-PAGE nachgewiesen werden.188 Die Optimierung der Expression der BPDO wurde weiterhin von Que et al. (2013) untersucht, wobei neben der Expressionstemperatur und der Induktorkonzentration auch der Einfluss des Kulturmediums untersucht wurde.245 Wie auch in dieser Arbeit wurde die höchste Aktivität in Ganzzellumsätzen mit Zellen erreicht, welche bei tiefen Temperaturen (15-20 °C) exprimiert wurden. Des Weiteren konnte kein deutlicher Effekt durch die Variation der Induktorkonzentration festgestellt werden. Im Vergleich von Komplex- und Minimalmedium wirkte sich in den Untersuchungen von Que et al. (2013) der Einsatz des Minimalmediums positiv auf die Aktivität aus, in dieser Arbeit hingegen wurde das Komplexmedium als geeigneter identifiziert. Grundsätzlich ist die heterologe Expression stark vom eingesetzten Expressions-organismus abhängig und kann sich, besonders im Fall von oxidierenden Enzymen, negativ auf die Wirtsvitalität auswirken.246 So wurde bei der heterologen Überexpression einer Alkan Hydroxylase von Pseudomonas putida (P. putida) in P. putida und E. coli die Membranzusammensetzung und das Wachstum des Expressionswirts stark verändert bzw. beeinträchtigt.247,248 Des Weiteren spielen bei der hetereologen Herstellung von Zielproteinen auch Faktoren wie in vivo Cofaktor-recycling, Substrataufnahme und Toxizität der Substrate eine große Rolle.249 So weisen unterschiedliche Expressionswirte eine hohe Varianz an verfügbarem Cofaktor in der Zelle auf. Der Gehalt an NADH bzw. NADPH nimmt von Bacillus subtilis über E. coli hin zu P. putida ab.250 Zu klären bleibt jedoch, in welchem Wirt, abzüglich der wirtzeigenen Zellmaschinerie, der höchste Gehalt an reduziertem Cofaktor verfügbar ist. Die Problematik der Cofaktorregeneration wurde in dieser Arbeit auf ein Minimum reduziert, da zum Einen mit ruhenden Zellen gearbeitet wurde und zum Anderen Glucose für die Aufrechterhaltung der Cofaktor-regeneration bereit stand. Das so optimierte System scheint verglichen mit anderen Protokollen in der Literatur als geeignet für die heterologe Herstellung der NDO. So konnte in in vivo Untersuchungen mit der Punktvariante NDO_F224A ein Diskussion 120 Umsatz von > 99 % des natürlichen Substrates Naphthalen (10 mM) innerhalb von 20 h erreicht werden, was der Wildtyp-Aktivität entspricht. Im Gegensatz dazu wurde von Seo et al. (2013) für dieselbe Variante lediglich ein Umsatz von 6,8 % für Naphthalen berichtet.251 Dennoch bleibt zu überlegen, ob E. coli der geeignete Expressionsorganismus darstellt. P. putida weist eine höhere Toleranz gegenüber aromatischen Substraten auf, welche normalerweise toxisch für E. coli und andere Organismen sind.252 Deshalb findet in vielen Untersuchungen die Trennung von Fermentation und Biotransformation statt, da sonst das Zellwachstum zu stark beeinflusst werden würde.252 So konnte mit immobilisierten P. putida-Zellen die Toluol Dioxygenase heterolog exprimiert werden und rund 85 g/L enantiomerenreines Produkt bei der Umsetzung von Toluol zum korrespondierenden Produkt erzielt werden.253 Die hohe Ausbeute in Umsetzungen von aromatischen Substraten verdeutlicht den Optimierungsbedarf bei den Umsetzungen von Terpenen. So konnte mit einer heterolog exprimierten Toluol Dioxygenase in P. putida Limonen zu Perillaalkohol mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,2 g L-1 h-1 umgesetzt werden.254 Verglichen mit der Umsetzung von R-Limonen durch die Cumol Dioxygenase Variante CDO_M232A, welche heterolog in E. coli exprimiert wurde, konnte lediglich eine Raum-Zeit-Ausbeute von 0,04 g L-1 h-1 erreicht werden.201 Dies entspricht einer um den Faktor fünf erniedrigten Raum-Zeit-Ausbeute. Neben der erhöhten Toleranz gegenüber den eingesetzten Substraten könnte sich Pseudomonas sp. auch aus evolutiven Gründen besser für die heterologe Expression eignen, da ein Großteil der charakterisierten ROs aus Pseudomonaden stammt.166 Evolvierbarkeit der Naphthalen Dioxygenase Die Naphthalen Dioxygenase (NDO) aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 weist eine enorme Vielfalt im Bereich der Reaktions- und Substratspezifität auf. So wurden neben Dihydroxylierungen und allylischen Monohydroxylierung auch Desaturierungen, Dealkylierungen, sowie Sulfoxidierungen beobachtet.144 Des Weiteren sind bereits eine Vielzahl von Kristallstrukturen mit cokristallisierten Substraten publiziert, welche die produktive Koordination des Substrates eindrucksvoll verdeutlichen (s. Abbildung 4.1). Diskussion 121 Unabhängig vom katalysierten Reaktionstyp befindet sich das Substrat in allen Kristallstrukturen in derselben Koordinationsebene, wodurch auf einen hohen Konservierungsgrad der produktiven Konformation geschlossen werden kann.255 Neben der Sterik wurde auch der Einfluss der Elektronik von verschiedenen Substraten untersucht, wobei von Kerridge und Kollegen festgestellt werden konnte, dass viel mehr sterische als elektronische Einflüsse für eine erfolgreiche Katalyse entscheidend sind.256 Ein weiteres Indiz für die Relevanz der Größe der Tasche liefern die Untersuchungen von Ferraro et al. (2006) mit der Kristallisation der Punktvariante NDO_F352V (PDB code: 2HMN) und dem cokristallisierten Substrat Anthracen.257 Durch den Austausch des Phenylalanins gegen ein Valin konnte z. B. das Substrat Phenanthren tiefer in der Tasche platziert werden, wodurch ein Regioshift bei der Dihydroxylierung von 3,4- zu 1,2-cis-Phenanthrendihydrodiol zu beobachten war. Auch der Austausch eines Methionins zu einem Alanin in der Cumol Dioxygenase (CDO) Variante CDO_M232A lieferte statt der beim CDOWt beobachteten Ringdihydroxylierung (~ 70 %) die Dihydroxylierung an der Vinylgruppe des untersuchten Substrats Styrol.189 Im Zuge einer Sättigung der Position 232 wurde der vorherrschende Einfluss der Sterik weiter verdeutlicht, da mit der kleineren Aminosäure Glycin die größte Regioselektivität erzeugt wurde. In Abbildung 4.1: Überlagerung von 19 Kristallstrukturen der Naphthalen Dioxygenase von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 (PDB code: 1EG9, 1O7G, 1O7M, 1O7N, 1O7P, 2HMK, 2HMN, 2HMO, 4HJL, 4HKV, 4HM0, 4HM1, 4HM2, 4HM3, 4HM4, 4HM5, 4HM6, 4HM7, 4HM8; first shell Aminosäuren in sticks, His-Asp-Triade in lines, Sauerstoff in rot und Eisen in orange) A206 V209 G204 W358 F202 F352 N297 L307 V260 F224 L253 H295 H213 H208 D362 Diskussion 122 der vorliegenden Arbeit konnte des Weiteren auch der Effekt von kleinen Substratmodifikation hinsichtlich der Stereoselektivität beobachtet werden. Durch das Vorhanden sein einer zusätzlichen Methylgruppe wurde beispielsweise die Stereoselektivität invertiert. So wurde bei der Umsetzung von Styrol (6) das R- Enantiomer gebildet, bei der Umsetzung von α-Methylstyrol (7) trat hingegen eine erhöhte Enantioselektivität für das S-Enantiomer auf. Grundsätzlich weisen Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen eine ähnliche Topologie der aktiven Tasche auf, weshalb die Vermutung naheliegt, dass Aminosäureaustausche basierend auf artverwandten Enzymen, welche die gewünschte Eigenschaft beherbergen, zu der Übertragung der gewünschten Funktion führen können. Für eine weitere Betrachtung der Übertragbarkeit von Reaktivitäten unterschiedlicher Dioxygenasen ist in Tabelle 4.1 sowohl die Konsensussequenz der drei prominentesten Familien in der aktiven Tasche dargestellt, als auch die Konsensussequenz der einzelnen Familien 1O7MA (NDOlike), 1ULIC (BDO/TDOlike) und 3GZXA (CDOlike). Tabelle 4.1: Konsensussequenz von sieben relevanten first shell Aminosäuren basierend auf der 3DM Datenbank* NDO- Sequenz Konsensus- Sequenz 1O7MA NDOlike 1ULIC BDO/TDOlike 3GZXA CDOlike 202 F F F F 206 M A G M 224 - F - - 260 - - - - 295 A H A G 307 L L L L 352 F F F F * basierend auf 8100 Dioxygenase-Sequenzen Ein Beispiel für die erfolgreiche Übertragung einer spezifischen Reaktivität stellt die CDO Punktvariante CDO_M232A dar. Hierbei konnte bei der Umsetzung von Styrol durch den Austausch des Methionins (CDOlike) gegen ein Alanin (A206, NDOlike) die Substituentenspezifität der NDO auf die CDO übertragen werden. Die Übertragung der Reaktivität ist jedoch nicht immer gegeben, wie die Studie von Yu et al. (2001) zeigte.233 Hierbei wurde durch den Austausch von korrespondieren Aminosäuren Diskussion 123 nur eine bedingte Übertragbarkeit der Reaktions- und Substratspezifität der 2-Nitrotoluol Dioxygenase auf die NDO beobachtet.233 Die Konsensussequenz sowie die sechs in dieser Arbeit identifizierten Aminosäure-Hotspots in der NDO werden im Folgenden bezüglich ihres Einflusses auf die Regioselektivität, Reaktionsspezifität, Stereoselektivität und Aktivität diskutiert (s. Abbildung 4.2). Aus der Konsensussequenz in Tabelle 4.1 der first shell Aminosäuren wird deutlich, dass die Positionen 202, 307 und 352 über alle Familien hinweg hoch konserviert sind. Wirft man nun einen Blick auf die erhaltenenen Ergebnisse für Mutationen an diesen Stellen, kann man sowohl Auswirkungen auf die Aktivität als auch auf die Selektivität beobachten. Phenylalanin 202 Der Austausch des Phenylalanins 202 gegen eine kleinere hydrophobe Aminosäure führte bei Substraten mit gesättigten Substituenten zu einer Aktivitätssteigerung und zu einem Shift in der Reaktionsspezifität. So konnte bei der Umsetzung von 1-Phenylpentan (4) neben dem monohydroxylierten Hauptprodukt 4a auch das Desaturierungsprodukt 4b detektiert werden. Des Weiteren konnte bei der Umsetzung von Styrol (6) mit der Variante NDO_F202A sowohl eine Steigerung der Aktivität auf 85 % Umsatz als auch eine Steigerung der Stereoselektivität auf 87 %ee (R) beobachtet werden. Der Effekt der erhöhten Stereoselektivität wurde auch bei der Umsetzung von α-Methylstyrol (7) festgestellt, wobei die Stereoselektivität für A206 H295 V260 A206 H295 L307 F202 F352 H295 V260 F352 A B C Regioselektivität und Aktivität Reaktionsspezifität und Aktivität Stereoselektivität Abbildung 4.2: First shell Aminosäuren der aktive Tasche der Naphthalen Dioxygenase von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4; (A) Positionen, welche die Regioselektivität und Ativität beeinflussen, (B) Positionen, welche die Reaktionsspezifität und Aktivität beeinflussen, (C) Positionen, welche die Stereoselektivität beeinflussen (PDB code: 1O7N; first shell Aminosäuren in Lines, jeweils wichtige Aminosäuren in Sticks, Sauerstoff in rot und Eisen in orange) Diskussion 124 das Diol-Produkt 2-Phenylpropan-1,2-diol (7b) von 55 auf 80 %ee (S) angehoben wurde. Weiterhin zeigte die Alanin-Variante eine exzellente Selektivität bei der Umsetzung von trans-β-Methylstyrol (8) mit > 99 %ee (S,S) für 1-Phenylpropan-1,2-diol (8b). Die Methylgruppe in α-Methylstyrol (7) und trans-β-Methylstyrol (8) scheint hierbei einen entscheidenden Effekt auf die Stereoselektivität zu haben, da im Gegensatz zum (R)-Diol-Produkt des Styrols eine deutliche Präferenz für das S-Enantiomer festgestellt wurde. Hierbei scheinen der hohe Konservierungsgrad der produktiven Konformationsebene (s. Abbildung 4.1) und daher die Geometrie der aktiven Tasche bzw. die Sterik des Substrats ein wichtiges Indiz für die zu erwartende Selektivität zu sein. Weiterhin konnte durch die Adressierung der konservierten Position 202 verdeutlicht werden, dass gerade konservierte Positionen einen entscheidenden Einfluss auf Reaktivität und Selektivität haben, ohne einen sofortigen Aktivitätsverlust nach sich zu ziehen. Allerdings zeigten Untersuchung von Parales et al. (2001) auch, dass sich der Konservierungsgrad einer Position auf die Akzeptanz gegenüber Aminosäureaustauschen auswirken kann, indem beispielsweise für die Punktvariante NDO_F202L keine Aktivität beobachtet werden konnte.162 Obwohl durch den Aminosäureaustausch an Position 202 mehr Platz in der aktiven Tasche geschaffen wurde, konnte die Umsetzung von größeren Substraten wie 4-Allylanisol (10) oder R-Limonen (12) mit Varianten an der Position F202 nicht beobachtet werden. Phenylalanin 352 Mit der Adressierung der ebenfalls konservierten Position F352 wurde ein starker Einfluss auf die Stereoselektivität festgestellt, welcher mit einer Reduktion in der Aktivität einherging. In nahezu allen Umsetzungen wurde die Wiederherstellung der Wildtyp-Aktivität mit Zunahme der Größe der ausgetauschten Aminosäure (Ala, Val, Ile) beobachtet, weshalb auf einen stabilisierenden Effekt des Phenylalanins geschlossen wurde. Hierfür sind vermutlich π-π-Wechselwirkungen zwischen den aromatischen Motiven der Substrate und des Phenylalanins verantwortlich. Des Weiteren können die beobachteten Shifts in der Stereoselektivität auch auf sterischen Effekten basieren, da der Austausch des Phenylalanins Platz für eine Drehung des Substrates schaffen könnte. So wurde bei der Umsetzung von Ethylbenzol (3) mit NDO_F352V nahezu eine Inversion der Stereoselektivität von Diskussion 125 98 %ee (R) hin zu 42 %ee (S) für 1-Phenylethanol (3a) beobachtet. Des Weiteren stellten Parales et al. (2000) den Einfluss der Position 352 auf die Regioselektivität fest, wobei im Fall der Umsetzung von Phenylbenzol mit der Variante NDO_F352V ein Shift von cis-Biphenyl-2,3-dihydrodiol hin zu cis-Biphenyl-3,4-dihydrodiol detektiert wurde.185 Durch die Eliminierung von Phenylalanin in der aktiven Tasche (F202, F352) wurde der dirigierende Einfluss der aromatischen Aminosäure im Bezug auf Selektivität und Reaktivität verdeutlicht. Für nicht-aromatische Substrate scheint diese Steuerung nicht zutreffend zu sein, da weder ein aktivitäts- noch selektivitätssteigernder Effekt durch den Austausch des Phenylalanins bei Umsetzungen des Monoterpens R-Limonen zu beobachten war. Leucin 307 Die Adressierung der Position 307, welche basierend auf der Konsensussequenz ebenfalls als konserviert angesehen werden kann, führte zu deutlichen Aktivitätseinbußen bei der Umsetzung von nicht-natürlichen Substraten wie Ethylbenzol (3), Styrol (6) und Allylbenzol (9). Wurden die Austausche von Alanin und Valin in den meisten Fällen unter hohem Aktivitätsverlust noch akzeptiert, so wurde bei der Substitution des Leucins durch ein Isoleucin ein vollständiger Aktivitätsverlust beobachtet. Die Umsetzung des natürlichen Substrates war bei den Punktvarianten NDO_L307A und NDO_L307V nahezu vollständig, weshalb davon ausgegangen werden kann, dass die Koordination des aromatischen Moleküls weiterhin gegeben ist. Im Gegensatz dazu wurde bei der Umsetzung von nicht-natürlichen Substraten eine deutliche Reduktion der Aktivität beobachtet, wenn Leucin gegen kleinere Aminosäuren ausgetauscht wurde. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Position L307 einen wichtigen Beitrag zur Steuerung der Substratspezifität liefert. Ein weiterer Hinweis hierfür stellt die Umsetzung von tert-Butylbenzol (5) dar. Basierend auf massenspektrometrischen Daten scheint die Variante NDO_L307A in der Lage zu sein das entsprechende Dihydrodiol-Produkt zu katalysieren und ist somit als einzige Variante in der Lage, das sterisch anspruchsvolle Substrat tert-Butylbenzol für die Katalyse koordinieren zu können. Des Weiteren haben auch die variablen Positionen 206, 295 und 260 Einfluss auf die Katalyse der unterschiedlichen Aromaten gezeigt. Hierbei wurden bei der in silico Diskussion 126 Analyse mittels 3DM unterschiedliche Konservierungsgrade festgestellt. Die Positionen 206 und 295 weisen einen Konservierungsgrad von 30 bzw. 19 % auf, wohingegen die Position 260 auf einer flexiblen Loopstruktur sitzt und deshalb keine Konservierung aufweist. Alanin 206 Die Position A206 zeigte in dieser Arbeit vor allem Einfluss auf die Aktivität und führte in den meisten Fällen zu einem Wildtyp-ähnlichen Umsatz des eingesetzten Substrates. Von den sechs identifizierten Positionen liegt diese Aminosäure als einzige gegenüber vom zentralen β-Faltblatt der α-Untereinheit und nimmt die Rolle einer Stellschraube in der aktiven Tasche ein. Diese Beobachtung wird durch den Einfluss der korrespondierenden Position 232 in der Cumol Dioxygenase am Regioshift des Substrats Styrol mit dem Aminosäureaustausch von Methionin gegen Alanin verdeutlicht.189 Histidin 295 Auch die Subsitution des Histidins an Position 295 wirkte sich häufig aktivitätssteigernd aus. Bei der Umsetzung des Monoterpens R-Limonen (12) konnte beispielsweise die Regioselektivität beeinflusst werden und ein Regioshift von Mentha-1,8-dien-10-ol (12b) hin zu Carveol (12a) beobachtet werden. Mit den Einzelvarianten NDO_H295A/V/I konnte für die Substrate 2, 3, 6, und 12 eine Aktivitätssteigerung von bis zu 40 % gegenüber dem Wildtyp der NDO beobachtet werden. In Untersuchungen von Yu et al. (2001) wurde bei Doppel- und Dreifachvarianten, bei welchen auch die Position H295 adressiert wurde, ebenfalls eine Änderung der Regioselektivität beobachtet.233 In der vorliegenden Arbeit wurde dies durch die Doppelvariante A206I_H295I bestätigt, mit welcher die Reaktionsspezifität von 77 % für das monohydroxylierte 1-Phenylethanol (3a) auf ~ 90 % 3a erhöht werden konnte. Im Fall der Einzelvariante H295A wurde bei der Umsetzung von R-Limonen (12) nahezu eine Inversion der Produktverteilung erreicht, wobei statt des Alkohols Mentha-1,8-dien-10-ol (12b) fast ausschließlich Carveol (12a) produziert wurde. Die Wichtigkeit der Position 295 in Verbindung mit N297 wird ebenfalls in den Untersuchungen zur Umsetzung von flavanoiden Strukturen deutlich.158 Hierbei wurde die Stabilisierung des Übergangzustandes durch die Wasser-vermittelte Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen Diskussion 127 zwischen der Carbonylfunktion des Flavons und den Positionen H295/N297 mittels in silico Analysen beobachtet. Da die Koordination des Wassermoleküls zwischen dem Substrat und den first shell Aminosäuren für die Katalyse wichtig erscheint und die Kavität keine Drehung des Substrates zulässt, argumentieren die Autoren, dass deshalb Isolavon erst nach Öffnung des Substratzuganges (NDO_F224Y) umgesetzt werden konnte.251 Ob die Position N297 tatsächlich für die Stabilisierung notwendig ist, bleibt unklar, da der Austausch des Asparagins N297 in dieser Arbeit keinen Einfluss auf die Katalyse von Naphthalen (1) und Styrol (6) gezeigt hat, jedoch bei der Umsetzungen von aromatischen Substraten mit größeren Substituenten bzw. nicht-aromatischen Substraten stets ein deutlicher Aktivitätseinbruch zu beobachten war. Valin 260 Als weitere Stellschraube für Aktivität und Selektivität konnte die Position V260 identifiziert werden. Hierbei handelt es sich um eine Aminosäure, die strukturell nicht konserviert ist, da sie in einer variablen Loopregion lokalisiert ist. Bei der Umsetzung von gesättigten Substituenten konnte vor allem bei sterisch anspruchsvollen Substraten wie 1-Phenylpentan (4) und bei der Umsetzung von des Monoterpens R-Limonen (12) eine Öffnung des Substratraumes erreicht werden. Des Weiteren wurde im Fall von Styrol (6) eine Aktivitätssteigerung gegenüber dem Wildtyp festgestellt. Der Einfluss auf die Stereoselektivität wird am Beispiel der Punktvariante NDO_V260G für die Umsetzung von α-Methylstyrol (7) weiter verdeutlicht, indem die Stereoselektivität für das Diol-Produkt (7b) auf 87 %ee (S) angehoben werden konnte. Der Einfluss auf Aktivität und Selektivität der Position 260 wurde neben der Position F202 bereits bei der Dihydroxylierung von Phenylbenzol beobachtet.185 Des Weiteren wird in der Literatur die Position F224 als eine einflussreiche Position für die produktive Koordination von größeren Substraten postuliert. Ebenfalls auf einer flexiblen, nicht konservierten Loopstruktur lokalisiert, handelt es sich bei der Position 224 um eine nicht konservierte Aminosäure (s. Tabelle 4.1). So konnten Seo und Kollegen durch die Substitution des Phenylalanins gegen Tyrosin die Umsetzung von (2S)-Flavanon beobachten.251 Grundsätzlich beobachteten Carredano und Kollegen (2000) bei der Untersuchung von Indol die große Relevanz von Aminosäuren mit aromatischem Charakter (F224, Diskussion 128 I II III IV F202 V260 H295 A206 F202 F352 F202 H295 A206 V260 H295 A206 V260 F352 F202 F352 A206 L307 F202 H295 F352 H295 A206 H295 A206 L307 L307 A206 L307 V260 H295 A206 V260 H295 A206 F202, F352, W358 und H295).258 In dieser Arbeit wurde bei der Untersuchung der aromatischen Substrate 0-11 jedoch kein eindeutig positiver Effekt auf die Aktivität oder Selektivität im Fall des Phenylalanins 224 bzw. Tryptophans 358 festgestellt. Trotz einer Vergrößerung der Kavität konnte der Substratraum nicht auf sterisch anspruchsvollere Terpengeometrien erweitert werden. Jedoch beschrieben Seo et al. (2013) die Position 224 als eine wichtige Kontrollfunktion am Eingang der aktiven Tasche, wodurch der erfolgreiche Umsatz von flavanoiden Strukturen mit der Punktvariante F224Y begründet wurde. In Abbildung 4.3 werden für die Katalyse wichtige Aminosäurepositionen (F202, A206, V260, H295, L307, F352) bezüglich ihrer Effekte auf Regioselektivität (I), Reaktionsspezifität (II), Stereoselektivität (III) und Aktivität (IV) auf das unter-suchte Substratpanel dargestellt. Die Umsetzung von aromatischen Molekülen mit unterschiedlich großen Alkylresten wurde vor allem durch den Aminosäureaustausch von A206 beeinflusst. Des Weiteren zeigten vor allem die Positionen 202 und 352 mit der aromatischen Aminosäure Phenylalanin deutlichen Auswirkungen auf die Reaktionsspezifität und Abbildung 4.3: Einflüsse der generierten Punktvarianten der NDO auf die Regioselektivität (I), Reaktionsspezifität (II), Stereoselektivität (III) und Aktivität (IV) auf das untersuchte Substratpanel Diskussion 129 Aktivität, wobei sehr wahrscheinlich durch den Wegfall der π-π-Wechselwirkungen mehrere Variationsmöglichkeiten für eine produktive Koordination der Substrate ermöglicht wurden. Außerdem trägt der Austausch des Phenylalanins zu einer Erweiterung der aktiven Tasche bei, welcher zumindest im Fall von planaren Molekülen zu einem Regioshift führte.185 Die Aminosäurenaustausche an der Position H295 lieferten ebenfalls Veränderungen im Bereich der Selektivität und Aktivität, wobei mit dem Austausch des Histidins eine Aminosäure mit potentiell geladener Seitenkette gegen ungeladene, hydrophobe Aminosäuren ausgetauscht wurde. Histidin kann durch den Imidazol-Rest innerhalb des physiologischen pH-Bereiches seine Ladung wechseln, da der pKa-Wert der Imidazol-Gruppe von 6,0 entsprechend bei pH 6,0 zu 50 % protoniert vorliegt bzw. bei einem pH-Wert von pH 8,0 neutral ist. Des Weiteren weisen verwandte Dioxygenasen an dieser Position bereits kleine hydrophobe Aminosäuren wie Alanin oder Glycin auf. Im Fall der Position 260 kann keine Aussage über das Substitutionmuster in der Dioxygenase-Familie gemacht werden, da es sich hierbei um eine variable Position in einem Loop am Eingang der aktiven Tasche (A, AS 253-263) handelt (s. Abbildung 4.4). Grundsätzlich kann die Flexibilität der Loops (A-C) in der aktiven Tasche der NDO basierend auf den B-Faktoren der Kristallstruktur eingeschätzt werden. Neben dem N- und C-Terminus sind flexible Loopstrukturen die beweglichsten Regionen bei der Kristallisation eines Proteins. In den meisten Fällen geht deshalb auch die Denaturierung des Proteins von hier aus. Neben der Beweglichkeit von peripheren Strukturelementen wie z. B. Oberflächenloops ist die Flexibilität der aktiven Tasche eine Vorraussetzung für die Erniedrigung der Aktivierungsenergie und das V260 A B C Loop AS 253-263 Loop AS 204-209 ε-Loop AS 221-238 Abbildung 4.4: Variable Loopbereiche in der aktive Tasche der Naphthalen Dioxygenase von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 (PDB code: 1O7N; Koloration der Loopbereiche nach B-Faktor; Sauerstoff in rot und Eisen in orange) Diskussion 130 schnellere Ablaufen der katalysierten Reaktion essentiell.259 Des Weiteren wurden Konformationsänderungen bei der Bindung von Substraten oder spezifischen Liganden beobachtet. Aufgrunddesssen stellen flexible Loopregionen interessante Startpunkt für die Mutagenese dar.260 So konnten Reich und Kollegen (2014) die Erhöhung der Thermostabilität der Enreduktase NCR von Zymomonas mobilis durch Variation von zwei Oberflächenloops erreichen.261 Da sich bei den Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen vor allem sterisch anspruchsvolle Substrate als herausfordernd dargestellt haben, könnte auch der Ein- und Auslass dieser Substanzen sich als problematisch herausstellen. Eine vermeintlich weiteres Indiz für die Wichtigkeit von Loopbereichen in Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen und deren möglicher Einfluss auf den Substratraum kann anhand des Vergleichs der Kristallstrukturen von NDOlike bzw. CDOlike/TDOlike α-Untereinheiten beobachtet werden (s. Abbildung 4.5). So können CDOlike189 und TDOlike Dioxygenasen262 bereits Monoterpene mit guten Ausbeuten umsetzen, NDOlike Dioxygenasen scheinen hierbei durch ihre unter-schiedlichen Loopmorphologien in der Substratgeometrie limitiert zu sein. Abbildung 4.5: Variable Loopbereiche A und B in der aktive Tasche der Naphthalen Dioxygenase von Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 (Blau; PDB code: 1O7N), Cumol Dioxgenase von Pseudomonas fluorescens IP01 (Pink; PDB code: 1WQL), Biphenyl Dioxygenase von Burkholderia xenoverans LB400 (Oliv; PDB code: 2XR8) und Toluol Dioxygenase von Pseudomonas putida ML2 (Türkis; PDB code: 3EN1)(Sauerstoff in rot und Eisen in orange; Indol in Sticks) A B ε-Loop Loop AS 253-263 Diskussion 131 4.3 Bewertung der Osmium-katalysierten Sharpless Dihydroxylierung versus der Dihydroxylierung mittels Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen Die osmium-katalysierte Sharpless Dihydroxylierung stellt derzeit die am häufigsten verwendete Methode zur Herstellung von cis-1,2-Diolen dar. Der rein chemische Weg soll hierbei mit der Dihydroxylierung durch Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) verglichen werden, um zu sehen, inwieweit die Biokatalysatoren hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit entwickelt wurden und welches Potential noch ausgeschöpft werden kann. Vor allem die große Toleranz der Metall-katalysierten Dihydroxylierung gegenüber einer Vielzahl von funktionellen Gruppen durch den Einsatz des AD-Mixes ist hervorzuheben. Wie bereits in Kapitel 1.1.1.1 erläutert, können Alkene mittels Osmiumtetroxid mit hohen Ausbeuten und exzellenten Stereoselektivitäten umgesetzt werden. Neben der bereits gut untersuchten und erfolgreich durchführbaren Dihydroxylierung von mono-, trans-di, gem-di- und trisubstituierten Olefinen stellt die stereoselektive Oxyfunktionalisierung von cis-disubstituierten aliphatischen, aromatischen und cyclischen Olefinen allerdings immer noch eine Herausforderung für die Sharpless Dihydroxylierung dar.48 Des Weiteren zählen auch elektronendefiziente Alkene und allylische sowie homo-allylische Alkohole zu den anspruchsvolleren Edukten.263 Mit den ROs wurde bereits ein breite Palette an aromatischen Substraten (> 300) umgesetzt, wobei ihre Flexibilität im Bereich unterschiedlichster funktioneller Gruppen und Reaktionstypen unter Beweis gestellt wurde.145 In dieser Arbeit wurde unter anderem die Selektivität von verschiedenen Punktvarianten gegenüber unterschiedlich substituierten Aromaten untersucht, wobei in Tabelle 4.2 einige Beispiele für Dihydroxylierungsreaktionen mittels Osmiumtetroxid und ROs im Vergleich dargestellt sind. Diskussion 132 Tabelle 4.2: Vergleich von Ausbeuten und Stereoselektivitäten bei der Umsetzung von aromatischen Substraten mit ungesättigten Seitenketten (6-9) mittels Osmiumtetroxid und Napthalen Dioxygenase Varianten Substrat Sharpless Dihydroxylierung Naphthalen Dioxygenase* Ausbeute [%] ee [%] Ref. theo. Ausbeute [%] ee [%] Variante > 80 97 264 92 79 (R) H295A 85 87 (R) F202A 90 94 264 37 88 (S) V260G 95 84-95 265 22 95 (S,S) F202V 80 n. d. 266 49 96 (R) V260G * Punktvarianten in dieser Arbeit generiert Aus Tabelle 4.2 wird deutlich, dass für die Umsetzung von monosubstituierten Olefinen wie Styrol (6) gute Ausbeuten und exzellente Stereoselektivitäten mittels Osmiumtetroxid erreicht werden können. Mit dem α- bzw. β-AD-Mix wurden mit 97 %ee sehr hohe Stereoselektivitäten erreicht, wobei durch den Austausch des chiralen Liganden sowohl das S- als auch das R-Enantiomer gewonnen werden konnte. Auch bei der Umsetzung von Styrol (6) mit Punktvarianten der NDO konnten hohe Ausbeuten und moderate bis hohe Stereoselektivitäten von bis zu 87 %ee (R) erreicht werden. Mit α-Methylstyrol (7) wurde ein gem-di-substituierter Aromat untersucht, wobei das Substitutionsmuster keinen Einfluss auf die Katalyse mittels Osmiumtetroxid zeigte, jedoch die Ausbeute der RO-katalysierten Reaktion durch die Bildung des allylischen Alkohols 3-Hydroxyphenylpropen (7a) beeinträchtigt wurde. Trotz exzellenter Stereoselektivitäten von 88 %ee (S) sank die Ausbeute deshalb auf ~ 37 %. Diese Beispiele verdeutlichen die Robustheit der Sharpless Dihydroxylierung gegenüber unterschiedlichen Substituenten, da die Ausbeute nicht durch Nebenaktivitäten erniedrigt wird. Im Fall von trans-di-substituierten Aromaten konnte mit der Punktvariante NDO_F202V ein exzellenter Enantiomerenüberschuss von 95 %ee (S,S) 1-Phenyl-propan-1,2-diol (8b) erreicht werden, wobei die Ausbeute auf 22 % sank. Im Gegensatz dazu wurden mittels Sharpless AD-Mix sowohl exzellente Ausbeuten als auch Stereoselektivitäten erreicht. Diskussion 133 Bei der Umsetzung von Allylbenzol (9), einem Aromaten mit isolierter Doppelbindung, wurden für beiden Katalysatoren gute Ausbeuten beobachtet. Im Fall der Punktvariante NDO_V260G konnten des Weiteren exzellente Stereo-selektivitäten von 96 %ee (R) detektiert werden. Mit dem von Sharpless entwickelten AD-Mix lässt sich eine breite Palette von Olefinen stereo- und regioselektiv dihydroxylieren. Des Weiteren können mit der rein chemisch Variante hohe Ausbeuten erreicht werden. Jedoch kann bei der Entwicklung des AD-Mixes auf fast 25 Jahre Ligandenforschung zurückgeblickt werden, weshalb die in Tabelle 4.2 gezeigten Ausbeuten und Selektivitäten als optimierte Reaktionen angesehen werden können. Mit der Untersuchung der Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen wurden für die Dihydroxylierung von Olefinen noch großteils unerforschte Biokatalystoren für diese Problemstellung untersucht. Diese Enzyme werden vor allem im Bereich der Aromaten-Dihydroxylierung eingesetzt, worin sich die effiziente und wirkungsvolle Katalysemaschinerie dieser Enzyme wiederspiegelt. Neben der Adressierung des stabilsten Motivs in der organischen Chemie können sie hierbei auch regioselektive Katalyse am Ring durchführen. Mittels protein engineering wurde nun die Grundlage für eine Weiterentwicklung dieser vielversprechenden Enzyme für die selektive asymmetrische Dihydroxylierung gelegt. Resümee und Ausblick 134 5 Resümee und Ausblick Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) stellen durch ihre hohe Reaktionsvielfalt und ihren flexiblen Substratraum vielversprechende Biokatalysatoren für die Anwendung als Produzenten von Pharmabausteinen und Agrochemikalien dar.132,144,173,267 In dieser Arbeit wurde sowohl ein in vitro als auch ein in vivo System dieser Mehrkomponentenkomplexe etabliert, wodurch eine weitere Optimierung für entsprechende Zielanwendungen ermöglicht wird. Die Ergebnisse der in vitro bzw. in vivo Untersuchungen lieferten vergleichbare Effekte für die getesteten Varianten, weshalb die Analyse von unbekannten Zielmolekülen ohne den komplexen Zellhintergrund mittels des in vitro Sytsems ermöglicht wird. Des Weiteren konnten im Rahmen der systematischen Analyse der aktiven Tasche der Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 sechs Hotspot-Positionen identifiziert werden, welche Auswirkungen auf die Reaktionsspezifität, Regio- und Stereoselektivität gezeigt haben. Die Untersuchung eine diversen Substratpanels führte zu folgenden generellen Beobachtungen: (1) Erweiterung des Alkylsubstituenten in Gegenwart eines Aromaten erniedrigt die Aktivität, (2) Verzweigung des Alkylsubstituenten führt zur Adressierung des aromatischen Systems, (3) Alkenylreste mit konjugierter C=C-Doppelbindungen führen zu Diol-Produkten und werden gegenüber der Demethylierung einer Methoxygruppe in para-Stellung bevorzugt, (4) gem-di-substituierte Alkenylreste führen zu einer Mischung aus mono- und dihydroxylierten Produkten, (5) trans-di-substituierte Alkenylreste werden bevorzugt monohydroxyliert und (6) isolierte C=C-Doppelbindungen in Alkenylresten resultieren in Diol-Produkten, wenn keine Methoxygruppe in para-Stellung für die Demethylierung vorhanden ist. Um das Potential der ROs noch weiter auszuschöpfen, werden im Folgenden Strategien vorgeschlagen, welche sich zum Einen auf das Substratspektrum und zum Anderen auf das protein engineering dieser Enzyme konzentrieren. Substratspektrum Im Rahmen von früheren Untersuchungen wurde die natürliche Reaktion der ROs, die Dihydroxylierung am aromatischen Ring, schon mit einer Vielzahl an Resümee und Ausblick 135 verschiedenen Substitutionen am Aromaten untersucht, wobei eine breite Akzeptanz gegenüber unterschiedlichsten Arenen gezeigt werden konnte.131 Da das biosynthetische Potential der generierten Dihydrodiole bei Weitem noch nicht ausgeschöpft ist, wäre die Entwicklung von nachfolgenden Funktionalisierungs-reaktionen oder von enzymatische Kaskaden ein interessanter Weg zu neuen Synthesebausteinen (s. Abbildung 1.1, I). Des Weiteren stellt die Oxyfunktionalisierung von Olefinen ein interessantes Forschungsgebiet dar. Hierbei kann das Potential der ROs hinsichtlich ihres breiten Reaktionsraumes, welcher von Mono- bzw. Dihydroxylierungen über Sauerstoff-abhängige Desaturierungen bis hin zu Sulfoxidierungen reicht, noch weiter aufgespannt werden und neben der Adressierung einer aromatischen C=C-Doppel-bindung die Katalyse von einfachen Olefinen forciert werden (s. Abbildung 1.1, II). Protein engineering Die Multikomponentenkomplexe bieten durch ihre zahlreichen Bestandteile und den komplexen Mechanismus unterschiedlichste Angriffstellen für das protein engineering. Zunächst ist die katalytisch aktive Komponente, die Dioxygenase selbst, ein offensichtlicher engineering hotspot. Hierbei eröffnet sich durch den heterodimeren Charakter der Dioxygenase die Möglichkeit zur Erstellung von Hybrid-Enzymen, wobei die α-Untereinheit mit einer β-Untereinheit einer verwandten RO kombiniert werden kann (s. Abbildung 5.2, III). Das Potential von Hybriden konnte bereits im Fall der Biphenyl Dioxygenase gezeigt werden, wobei sich die Spezifität der Hybrid-Dioxygenase zur Wildtyp-Spezifität unterschied.268 Des Weiteren bieten auch Strukturmerkmale wie flexible Loopregionen (Kontrolle des Substrat-zugangs/Produktfreigabe) und das Eisen-Schwefel-Cluster (Steuerung des I) Modifikation von Dihydrodiolen131 II) Reduktion des natürlichen Motivs auf C-C-Doppelbindung X X Abbildung 5.1: (I) Cycloaddition, Kupplungsreaktionen, Claisen-Umlagerung, Epoxidierung und Ozonolyse als Funktionalisierungsmöglichkeiten von aromatischen 1,2-Dihydrodiolen und (II) die Reduktion des aromatischen Motivs auf eine C=C-Doppelbindung Resümee und Ausblick 136 Redoxpotentials entlang der Elektronentransportkette) potentielle Stellschrauben für die Generierung von maßgeschneiderten Oxidationsenzymen (s. Abbildung 5.2, IV und V). Neben rationalen und semirationalen Design-Ansätzen erscheinen mit einem geeigneten Screening-System auch die Methoden der gerichteten Evolution (z. B. DNA Shuffling, error prone PCR) als vielversprechende Werkzeuge zur Optimierung dieser vielfältigen Biokatalysatoren. Cys81 Abbildung 5.2: Potentielle Stellschrauben für das protein engineering in Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen His83 Cys101 His104 α-Untereinheit β-Untereinheit III) Generierung von Hybrid-Dioxygenasen IV) Vielfalt der Loop-Morphologie V) Redoxpotential und Kupplungseffizienz Anhang 137 6 Anhang 6.1 Gensequenz der bearbeiteten Enzyme x Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 (NDO) Das Gencluster nahAcAdAbAd der Naphthalen Dioxygenase ist unter der GenBank Nummer M83949.1 abrufbar. x Cumol Dioxygenase aus Pseudomonas fluorescens IP01 (CDO) Das Gencluster der Cumol Dioxygenase ist unter der GenBank Nummer D37828.1 verfügbar. x Toluol Dioxygenase aus Pseudomonas putida ML2 (TDO) Das Gencluster todC1C2BA der Toluol Dioxygenase ist unter der GenBank Nummer AB828709.1 verfügbar. x Benzol Dioxygenase aus Pseudomonas putida ML2 (BDO) Das Gencluster bedC1C2BA der Benzol Dioxygenase ist unter der GenBank Nummer AF148496.1 verfügbar. x Biphenyl Dioxygenase aus Burkholderia xenoverans LB400 (BPDO) Das Gencluster bphA1A2A3A4 der Biphenyl Dioxygenase ist unter der GenBank Nummer CP000272.1 verfügbar. 6.2 Plasmide Tabelle 6.1: Verzeichnis der Wildtyp-Plasmide ITB-Nr. Plasmidname Insert ITB-Nr. Plasmidname Insert pITB1009 pDTG141 NDO Gencluster pITB1420 pQE31_NahAcAd His-getaggte NDO-Oxygenase pITB1014 pJRM501 BDO Gencluster - pQE31_NahAb His-getaggtes NDO-Ferredoxin pITB1419 pDTG601 TDO Gencluster - pQE31_NahAa His-getaggte NDO-Reduktase pITB1418 pT7-BPDO BPDO Gencluster pITB1423 pETDuet_NahAaAb NDO-Ferredoxin und -Reduktase pITB1011 pIP107D CDO Gencluster pITB1424 pCOLADuet_NahAcAd NDO-Oxygenase Anhang 138 Tabelle 6.2: Verzeichnis der Einzelvarianten der Naphthalen Dioxygenase ITB-Nr. Plasmidname Mutation ITB-Nr. Plasmidname Mutation pITB1462 pDTG141_F202A F202A pITB1425 pQE31_NDO_A197F A197F pITB1463 pDTG141_F202V F202V pITB1426 pQE31_NDO_P198A P198A pITB1464 pDTG141_F202I F202I pITB1427 pQE31_NDO_V203C V203C pITB1465 pDTG141_H295A H295A pITB1428 pQE31_NDO_V203A V203A pITB1466 pDTG141_H295V H295V pITB1429 pQE31_NDO_G204S G204S pITB1467 pDTG141_H295I H295I pITB1430 pQE31_NDO_L217I L217I pITB1468 pDTG141_N297A N297A pITB1431 pQE31_NDO_R218L R218L pITB1469 pDTG141_N297V N297V pITB1432 pQE31_NDO_S219A S219A pITB1470 pDTG141_N297I N297I pITB1433 pQE31_NDO_M242F M242F pITB1471 pDTG141_F352A F352A pITB1434 pQE31_NDO_T243R T243R pITB1472 pDTG141_F352V F352V pITB1435 pQE31_NDO_S244A S244A pITB1473 pDTG141_F352I F352I pITB1436 pQE31_NDO_S248H S248H pITB1474 pDTG141_A206G A206G pITB1437 pQE31_NDO_M250S M250S pITB1475 pDTG141_A206V A206V pITB1438 pQE31_NDO_L253F L253F pITB1476 pDTG141_A206I A206I pITB1439 pQE31_NDO_W254F W254F pITB1477 pDTG141_V209A V209A pITB1440 pQE31_NDO_N297H N297H pITB1478 pDTG141_V209G V209G pITB1441 pQE31_NDO_V300I V300I pITB1479 pDTG141_V209I V209I pITB1442 pQE31_NDO_C309G C309G pITB1480 pDTG141_L253A L253A pITB1443 pQE31_NDO_S310T S310T pITB1481 pDTG141_L253V L253V pITB1444 pQE31_NDO_K314R K314R pITB1482 pDTG141_L253I L253I pITB1445 pQE31_NDO_N317H N317H pITB1483 pDTG141_L307A L307A pITB1446 pQE31_NDO_S360Q S360Q pITB1484 pDTG141_L307V L307V pITB1447 pQE31_NDO_N363G N363G pITB1485 pDTG141_L307I L307I pITB1448 pQE31_NDO_D364E D364E pITB1486 pDTG141_G204A G204A pITB1449 pQE31_NDO_M366W M366W pITB1487 pDTG141_G204V G204V pITB1450 pQE31_NDO_F202G F202G pITB1488 pDTG141_G204I G204I pITB1451 pQE31_NDO_H295A H295A pITB1489 pDTG141_F224A F224A pITB1452 pQE31_NDO_N297V N297V pITB1490 pDTG141_F224V F224V pITB1453 pQE31_NDO_F352I F352I pITB1491 pDTG141_F224I F224I - pQE31_NDO_A206G A206G pITB1492 pDTG141_V260A V260A pITB1455 pQE31_NDO_V209A V209A pITB1493 pDTG141_V260G V260G pITB1456 pQE31_NDO_L253A L253A pITB1494 pDTG141_V260I V260I pITB1457 pQE31_NDO_L307A L307A pITB1495 pDTG141_W358A W358A pITB1458 pQE31_NDO_G204A G204A pITB1496 pDTG141_W358V W358V pITB1459 pQE31_NDO_F224A F224A pITB1497 pDTG141_W358I W358I - pQE31_NDO_V260A V260A pITB1461 pQE31_NDO_W358A W358A Anhang 139 Tabelle 6.3: Verzeichnis der Doppelvarianten der Naphthalen Dioxygenase ITB-Nr. Plasmidname Mutation pITB1498 pDTG141_V260A_H295A V260A, H295A pITB1499 pDTG141_V260A_H295V V260A, H295V pITB1500 pDTG141_V260A_H295I V260A, H295I pITB1501 pDTG141_V260G_H295A V260G, H295A pITB1502 pDTG141_V260G_H295V V260G, H295V pITB1503 pDTG141_V260G_H295I V260G, H295I pITB1504 pDTG141_V260I_H295A V260I, H295A pITB1505 pDTG141_V260I_H295V V260I, H295V pITB1506 pDTG141_V260I_H295I V260I, H295I pITB1507 pDTG141_A206G_H295A A206G, H295A pITB1508 pDTG141_A206G_H295V A206G, H295V pITB1509 pDTG141_A206G_H295I A206G, H295I pITB1510 pDTG141_A206G_V260A A206G, V260A pITB1511 pDTG141_A206G_V260G A206G, V260G pITB1512 pDTG141_A206G_V260I A206G, V260I pITB1513 pDTG141_A206V_H295A A206V, H295A pITB1514 pDTG141_A206V_H295V A206V, H295V pITB1515 pDTG141_A206V_H295I A206V, H295I pITB1516 pDTG141_A206V_V260A A206V, V260A pITB1517 pDTG141_A206V_V260G A206V, V260G pITB1518 pDTG141_A206V_V260I A206V, V260I pITB1519 pDTG141_A206I_H295A A206I, H295A pITB1520 pDTG141_A206I_H295V A206I, H295V pITB1521 pDTG141_A206I_H295I A206I, H295I pITB1522 pDTG141_A206I_V260A A206I, V260A pITB1523 pDTG141_A206I_V260G A206I, V260G 6.3 Kalibriergeraden Abbildung 6.1: Exemplarische Kalibriergerade zur Bestimmung des Proteingehaltes mittels Bicinchoninsäure (BCA). y = 0.001x + 0.0208 R² = 0.9975 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 500 1000 1500 2000 2500 Δ A 56 2 nm [- ] cBSA [µg/mL] Anhang 140 y = 0.7201x R² = 0.9748 01 23 45 67 8 0 2 4 6 8 10A 1-P he ny le th an -1 ,2 -d io l/ A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c1-Phenylethan-1,2-diol [mM] y = 1.1826x R² = 0.9993 02 46 810 1214 0 2 4 6 8 10A 1- Ph en yl et ha no l/ A 1 m M 1- O ct an ol [- ] c1-Phenylethanol [mM] Abbildung 6.2: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von 1,2-Naphthalendihydrodiol (1a) Abbildung 6.3: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von Benzylalkohol (2a) Abbildung 6.4: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von acetyliertem 1-Phenylethanol (3a) und acetyliertem 1-Phenylethan-1,2-diol (3b) y = 0.6126x + 0.0093 R² = 0.9999 01 23 45 67 0 2 4 6 8 10 A 1 ,2 -N ap ht ha le nd ih yd ro di ol / A 3 -P he ny lp he no l [ -] c1,2-Naphthalendihydrodiol [mM] y = 1.042x R² = 0.9997 02 46 810 12 0 2 4 6 8 10A Ben zy la lk oh ol /A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] cBenzylalkohol [mM] Anhang 141 y = 1.0457x - 0.6517 R² = 0.9988 02 46 810 12 0 2 4 6 8 10A 2-P he ny lp ro pa n- 1, 2- di ol /A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c2-Phenylpropan-1,2-diol [mM] y = 1.3276x R² = 0.9986 02 46 810 1214 16 0 2 4 6 8 10A 3-H yd ro xy ph en yl pr op en /A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c3-Hydroxyphenylpropen [mM] y = 0.5652x R² = 0.9931 01 23 45 67 0 2 4 6 8 10A 1-P he ny le th an -1 ,2 -d io l/ A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c1-Phenylethan-1,2-diol [mM] y = 2.7022x R² = 0.9958 05 1015 2025 30 0 2 4 6 8 10 A Z im ta lk oh ol /A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] cZimtalkohol [mM] y = 1.2298x - 0.8246 R² = 0.9968 02 46 810 1214 0 2 4 6 8 10A 1-P he ny lp ro pa n- 1, 2- di ol /A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c1-Phenylpropan-1,2-diol [mM] Abbildung 6.5: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von 1-Phenylethan-1,2-diol (6a) Abbildung 6.6: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von 2-Phenylpropan-1,2-diol (7b) und 3-Hydroxyphenylpropen (7a) Abbildung 6.7: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von Zimtalkohol (8a) und 1-Phenylpropan-1,2-diol (8b) Anhang 142 y = 1.1004x R² = 0.9992 02 46 810 1214 0 2 4 6 8 10A 1- Ph en yl -a lly la lk oh ol /A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c1-Phenyl-allylalkohol [mM] y = 0.7929x - 0.5286 R² = 0.9987 01 23 45 67 8 0 2 4 6 8 10A 3-P he ny lp ro pa n- 1, 2- di ol /A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c3-Phenylpropan-1,2-diol [mM] Abbildung 6.8: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von 1-Phenyl-allylalkohol (9a) und 3-Phenylpropan-1,2-diol (9b) Abbildung 6.9: Kalibriergerade zur Bestimmung der molaren Konzentration von 4-Allylphenol (10a) y = 1.2677x R² = 0.9985 02 46 810 1214 0 2 4 6 8 10A 4- Al ly lp he no l/ A 1 m M 1 -O ct an ol [- ] c4-Allylphenol [mM] Anhang 143 6.4 HPLC- und GC-Chromatogramme 6.4.1 Chirale NP-HPLC-Analytik Abbildung 6.10: HPLC-Chromatogramm der chiralen NP-HPLC-Analytik von 1-Phenylethan-1,2-diol (6a) mit racemischem Standard (rot) und enantiomerenreinem R-1-Phenylethan-1,2-diol (blau) Abbildung 6.11: HPLC-Chromatogramm der chiralen NP-HPLC-Analytik von 2-Phenylpropan-1,2-diol (7b) mit racemischem Standard (blau) und enantiomerenreinem S-2-Phenylpropan-1,2-diol (rot) Abbildung 6.12: HPLC-Chromatogramm der chiralen NP-HPLC-Analytik von 1-Phenylpropan-1,2-diol (8b) mit (1R,2R)-1-Phenylpropan-1,2-diol (rot) und (1S,2S)-1-Phenylpropan-1,2-diol (rot) min20 21 22 23 24 25 mAU 0 20 40 60 80 100 120 DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,50 (V:\MESSGER...IOL INVITRO 2016-06-09 08-52-53\STD_1MM S1PHENYLETHANDIOL_2.D) DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,50 (V:\MESSGER...THANDIOL INVITRO 2016-06-09 08-52-53\STD_1PHENYLETHANDIOL_2.D) min14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 mAU 0 200 400 600 800 1000 DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,50 (V:\MESSGER...ROPANDIOL INVITRO 2016-06-09 16-30-27\STD_2PHENYLPROPANDIOL.D) *DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,50 (V:\MESSGER...DIOL INVITRO 2016-06-09 16-30-27\STD_S2PHENYLPROPANDIOL_1MM.D) Anhang 144 Abbildung 6.13: HPLC-Chromatogramm der chiralen NP-HPLC-Analytik von 3-Phenylpropan-1,2-diol (9b) mit racemischem Standard (blau) und enantiomerenreinem S-3-Phenylpropan-1,2-diol (rot) Abbildung 6.14: HPLC-Chromatogramm der chiralen NP-HPLC-Analytik von 1-(4-Methoxyphenyl)-ethan-1,2-diol (11b) mit R-1-(4-Methoxyphenyl)-ethan-1,2-diol (rot) und S-1-(4-Methoxyphenyl)-ethan-1,2-diol (blau) (Grün: Biotransformation mit NDOWt) 6.4.2 Chirale und achirale GC-FID/MS-Analytik Abbildung 6.15: GC-Chromatogramm der chiralen GC-FID-Analytik von 1-Phenylethanol (3a) mit racemischem 1-Phenylethanol (pink), S-1-Phenylethanol (schwarz) und in vivo Biotransformation mit NDO_F224A (blau) min36 37 38 39 40 mAU 0 10 20 30 40 50 DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,50 (V:\MESSGER...11-02 METSTYR 2016-11-02 13-13-55\STANDARD_ALPHAAD_METHSTYR.D) DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,50 (V:\MESSGER...-11-02 METSTYR 2016-11-02 13-13-55\STANDARD_BETAAD_METHSTYR.D) DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,50 (V:\MESSGER...\DATA\JDE\16-11-02 METSTYR 2016-11-02 13-13-55\WT_METSTYR_1.D) 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 uV(x10,000) Anhang 145 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 uV (x100,000) Abbildung 6.16: GC-Chromatogramm der achiralen GC-FID-Analytik von 4-Methoxystyrol (11) mit 4-Vinylphenol (11a, schwarz), (4-Methoxyphenyl)-ethan-1,2-diol (11b, blau), in vivo Biotransformation mit dem Leervektor pT7-7 (grün) und in vivo Biotransformation mit dem NDOWt (pink) Abbildung 6.17: GC-Chromatogramm der achiralen GC-MS-Analytik von R-Limonen (12) mit den Standards Carveol (12a, schwarz), Mentha-1,8-dien-10-ol (12b, grün), Carvon (rot), Perillaalkohol (blau) und Limonen-1,2-diol (pink) v Abbildung 6.18: GC-Chromatogramm der achiralen GC-FID-Analytik von Myrcen (14, dunkelgrün) mit den Standards 2-Methyl-6-methylenocta-2,7-dien-1-ol (hellgrün), 2-Methyl-6-methylenoct-7-en-2,3-diol (braun), 3,10-Dihydroxymyrcen (blau) und 1,2-Dihydroxymyrcen (schwarz) 6.00 6.25 6.50 6.75 7.00 7.25 7.50 7.75 8.00 8.25 8.50 8.75 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 uV(x1,000,000) 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 min 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 uV(x100,000) Anhang 146 6.5 Nachweise via SDS-PAGE und Western Blot Abbildung 6.19: (Li.) Western Blot nach ECL-Nachweis der gereinigten Reduktase des Multikomponentenkomplexes NDO und (Re.) SDS-PAGE Gel der gereinigten Reduktase der NDOWt 6.6 Umsetzung von Naphthalen und α-Methylstyrol mit Naphthalen Dioxygenase Wildtyp Abbildung 6.20: In vivo Biotransformation von 10 mM Naphthalen (1, links) bzw. α-Methylstyrol (7, rechts) zu den korrespondierenden Produkten mit dem Naphthalen Dioxygenase Wildtyp 0 2 4 6 8 10 12 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 4 h/30 °C/0.4 vmm/1000 rpm 4 h/18 °C/0.4 vmm/300 rpm 4 h/18 °C/1.6 vmm/1000 rpm 4 h/30 °C/1.6 vmm/300 rpm 12 h/24 °C/1 vvm/650 rpm20 h/30 °C/0.4 vvm/300 rpm 20 h/30 °C/1.6 vvm/1000 rpm 20 h/18 °C/0.4 vvm/1000 rpm 20 h/18 °C/1.6 vvm/300 rpm 0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 4 5 C 1 ,2 -N ap ht ha le nd ih yd ro di ol [m M ] Reaktionsdauer [h] 0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 4 5 C 2 -P he ny lp ro pa n- 1, 2- di ol [m M ] Reaktionsdauer [h] Reduktase (37 kDa) [kDa] 170 130 100 70 55 40 35 25 15 Gereinigte NDORed M Anhang 147 0 1 2 3 4 5 H295A H295V H295I H295A H295V H295I H295A H295V H295I H295A H295V H295I V260A V260G V260I H295A H295V H295I V260A V260G V260I H295A H295V H295I V260A V260GV260A V260G V260I A206G A206V A206I c P ro du ct [m M ] 3-Phenylpropan-1,2-diol 1-Phenyl-allylalkohol 01 23 45 67 89 10 A V I A V I A V I A V I A V I A V I A V I A V I A V I A V I A V I A V IF202 H295 N297 F352 A206* V209* L253 L307 G204 F224 V260* W358 c P ro du kt [m M ] 3-Phenylpropan-1,2-diol1-Phenyl-allylalkohol 6.7 Erweiterung der in vivo Bibliothek der Naphthalen Dioxygenase Abbildung 6.21: Indol-Assay der Doppelvarianten der NDO-Bibliothek mit 10 %(w/v) Indol Abbildung 6.22: In vivo Biotransformation von 10 mM Allylbenzol (9) zu 1-Phenyl-allylalkohol (9a) und 3-Phenylpropan-1,2-diol (9b) NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h 0 1 2 3 H295A H295V H295I H295A H295V H295I H295A H295V H295I H295A H295V H295I V260A V260G V260I H295A H295V H295I V260A V260G V260I H295A H295V H295I V260A V260GV260A V260G V260I A206G A206V A206I 0 1 2 3 4 5 c Produkt [m M ] Anhang 148 Abbildung 6.23: Relative Aktivität der in vivo Biotransformation von 10 mM 4-Methoxystyrol (11) mit der NDO-Bibliothek bei 30 °C für 20 h (*: Gly) 020 4060 80100 120140 160180 A V I A V I A V I A V I G V I A G I A V I A V I A V I A V I A G I A V IF202 H295 N297 F352 A206* V209* L253 L307 G204 F224 V260* W358 Re la ti ve A kt iv itä t N D O W t[% ] Literaturverzeichnis 149 7 Literaturverzeichnis (1) Reetz, M. 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