Novel functions of aberrant cyclin D1/CDK4 activity in mantle cell lymphoma and consequences for proteasome inhibitor treatment

Abstract

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive B cell-non-Hodgkin lymphoma with generally poor outcome and only transient responses to conventional chemotherapy. Cells of MCL patients are characterized by an aberrant high cyclin D1-driven cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) activity. Recently, the ubiquitin proteasome system (UPS) inhibitor bortezomib has been approved for the treatment of relapsed/refractory MCL and has shown promising results in first-line treatment of MCL patients. However, little is known about how the aberrant cyclin D1-driven CDK4 activity does affect the treatment efficacy of UPS inhibitors in MCL. The present work aimed to identify novel functions for cyclin D1/CDK4 activity in MCL that regulate the efficacy of proteasome inhibitor treatment. In this study, the efficacy of proteasome inhibitor treatment was found to depend on the aberrant cyclin D1/CDK4 activity in MCL. Inhibition of cyclin D1/CDK4 activity with the CDK4 inhibitor palbociclib antagonized bortezomib induced cell death in MCL cells. Moreover, the antioxidant defense protein sestrin 3 was identified to be strongly regulated by cyclin D1-driven CDK4 activity. Although, bortezomib efficacy was demonstrated to be regulated by reactive oxygen species (ROS) or antioxidants, changes in sestrin 3 expression levels are not responsible for cell death regulation after UPS blockage in MCL. Furthermore, even though targeting cyclin D1/CDK4 activity with palbociclib induces cell cycle arrest, changes in cell cycle distribution after cyclin D1/CDK4 inhibition also do not mediate the antagonizing effect on bortezomib induced cell death. Astonishingly, it could be demonstrated that cyclin D1/CDK4 inhibition antagonizes the bortezomib induced cell death through a reduction of NOXA protein accumulation. It could also be shown that this mechanism is not exclusive for the proteasome inhibitor bortezomib but also applies to other agents that depend on NOXA protein accumulation for efficient cell death induction in MCL cells. Importantly, results of the present study revealed that this regulation of NOXA protein levels by cyclin D1/CDK4 activity is not associated with a reduction of NOXA transcript levels but is mediated by the regulation of NOXA protein stability. This identified novel function of cyclin D1/CDK4 to regulate NOXA protein half-life in the presence of UPS blockage is mediated by the autophagic degradation machinery. This study identified, the regulation of autophagic activity as a novel cell cycle independent function of cyclin D1/CDK4 activity in MCL. In this context, it was demonstrated that inhibition of cyclin D1/CDK4 activity by palbociclib treatment induces autophagic activity in MCL. Cyclin D1/CDK4 and autophagic activity, however, are not linked by the common autophagy regulating pathways, AMP-activated protein kinase (AMPK) or ROS. In addition, genetic or pharmacological inhibition of autophagic activity reverses the palbociclib mediated antagonism on bortezomib induced cell death and NOXA protein accumulation. Remarkably, this study demonstrates that the NOXA protein can be targeted for proteasomal as well as autophagosomal degradation. Targeting NOXA protein for degradation through selective autophagy might be mediated through a LC3-interacting region (LIR) motif that was identified in the amino acid sequence of the NOXA protein. Interestingly, combination of bortezomib with known autophagy inhibitors potentiates cell death induction as well as NOXA protein accumulation compared to bortezomib treatment alone. Furthermore, screening for a highly efficient combinatorial blockade of the UPS and the ALP revealed that the fatty acid synthase (FASN) inhibitor orlistat can be repositioned for autophagy inhibition. Consequently, the combinatorial treatment with bortezomib and orlistat leads to a very efficient NOXA protein induction and caspase dependent cell death in MCL cells. This cell death is again dependent on the aberrant high cyclin D1/CDK4 activity. The expression levels of certain other apoptotic proteins, however, are not affected by the combinatorial treatment. In conclusion, the present study revealed the regulation of autophagic activity as a novel function of cyclin D1/CDK4 activity in MCL. These findings are of utmost importance for the treatment of MCL patients, as combination of proteasome inhibitors with autophagy inhibitors could greatly improve therapy outcomes or overcome bortezomib resistances. In addition to known autophagy inhibitors, treatment options could include conventional drugs that are repurposed for targeting the autophagic degradation machinery. On the other hand, care must be taken when combining proteasome inhibitors with other chemotherapeutics that might impair cyclin D1/CDK4 activity or induce autophagy.

Das Mantelzell-Lymphom (MCL) ist ein aggressives B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom mit sehr schlechter klinischer Prognose und nur zeitweiligem Ansprechen auf konventionelle Chemotherapie. Zellen von MCL-Patienten zeichnen sich durch eine anormal hohe Cyclin D1-vermittelte Cyclin-abhängige Kinase 4 (CDK4) Aktivität aus. Kürzlich wurde der Ubiquitin-Proteasom-System (UPS)-Inhibitor Bortezomib für die Behandlung des rezidivierten bzw. refraktären MCl zugelassen und zeigte vielversprechende Ergebnisse unter anderem in der Primärtherapie von MCL-Patienten. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie die anormale Cyclin D1/CDK4-Aktivität beim MCL die Wirksamkeit der Behandlung von UPS-Inhibitoren beeinflusst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher neue Funktionen für die Cyclin D1/CDK4 Aktivität im MCL zu identifizieren, die die Wirksamkeit der Behandlung von Proteasominhibitoren beeinflussen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Wirksamkeit der Proteasominhibitoren von der anormalen Cyclin D1/CDK4-Aktivität in MCL-Zellen abhängig ist. Außerdem wurde nachgewiesen, dass das Antioxidans-Protein Sestrin 3 durch die Cyclin D1-vermittelte CDK4-Aktivität reguliert wird. Es konnte dabei gezeigt werden, dass die Wirksamkeit von Bortezomib durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder Antioxidantien reguliert wird. Dennoch sind Veränderungen der Sestrin 3 Expressionslevel nicht für die Regulation des Zelltods nach UPS-Blockade im MCL verantwortlich. Obwohl die Hemmung der Cyclin D1/CDK4-Aktivität durch Palbociclib einen Zellzyklusarrest induziert, vermitteln diese Veränderungen im Zellzyklus nicht die antagonisierende Wirkung von Palbociclib auf den Bortezomib induzierten Zelltod. Erstaunlicherweise konnte gezeigt werden, dass Palbociclib den Bortezomib induzierten Zelltod durch eine reduzierte NOXA-Proteinakkumulation antagonisiert. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass dieser Mechanismus nicht nur auf den Proteasominhibitor Bortezomib beschränkt ist, sondern auch für andere Wirkstoffe gilt, die für eine effiziente Zelltodinduktion im MCL auf die Akkumulation des NOXA-Proteins angewiesen sind. Wichtig ist hierbei, dass die Cyclin D1/CDK4 vermittelte Regulierung der NOXA-Proteinexpression, nicht durch eine Reduzierung des NOXA-Transkripts, sondern durch eine Regulierung der NOXA-Proteinstabilität vermittelt wird. Diese Funktion von Cyclin D1/CDK4, die Halbwertszeit des NOXA-Proteins in Anwesenheit einer UPS-Blockade zu regulieren, wird hierbei durch die autophagosomalen Abbauwege vermittelt. Die Regulation der autophagosomalen Aktivität wurde im Rahmen dieser Arbeit, als eine neue zellzyklusunabhängige Funktion der Cyclin D1/CDK4 Aktivität im MCL identifiziert. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass die Hemmung der Cyclin D1/CDK4 Aktivität durch die Behandlung mit Palbociclib, die autophagosomale Aktivität im MCL erhöht. Cyclin D1/CDK4 und autophagosomale Aktivität stehen jedoch nicht durch die Signalwege miteinander in Verbindung, die üblicherweise Autophagie regulieren, wie die AMP aktivierte Proteinkinase (AMPK)- oder ROS Signalwege. Des Weiteren hob die genetische oder pharmakologische Hemmung der autophagosomalen Aktivität, den durch Palbociclib vermittelten Antagonismus auf den Bortezomib induzierten Zelltod und die NOXA-Proteinakkumulation auf. Erstaunlicherweise zeigt die vorliegende Arbeit, dass das NOXA-Protein sowohl proteasomal als auch autophagosomal abgebaut werden kann. Die Markierung des NOXA-Proteins für den Abbau durch selektive Autophagie, könnte durch ein LC3-interagierende Region (LIR)-Motiv vermittelt werden, das in der Aminosäuresequenz des NOXA-Proteins identifiziert werden konnte. Interessanterweise potenziert die Kombination von Bortezomib mit bekannten Autophagie-Inhibitoren die Zelltod- sowie NOXA-Induktion, im Vergleich zu der Bortezomib Behandlung allein. Zudem ergab ein Substanzscreening zur Identifikation einer hocheffizienten dualen Blockade des proteasomalen und autophagosomalen Abbaus, dass der Fettsäure-Synthase-Inhibitor Orlistat für die Autophagie-Inhibition umfunktioniert werden kann. Infolgedessen führte die Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Orlistat zu einer sehr effizienten NOXA-Proteininduktion und einem Caspase-abhängigen Zelltod in MCL-Zellen. Dieser Zelltod ist ebenso abhängig von der anormal hohen Cyclin-D1/CDK4-Aktivität. Die Expressionsraten bestimmter anderer apoptotischer Proteine werden jedoch durch die Kombinationsbehandlung nicht beeinflusst. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit die Regulation der autophagosomalen Aktivität als neue Funktion der Cyclin D1/CDK4-Aktivität im MCL identifiziert werden. Diese Ergebnisse sind für die Behandlung von MCL-Patienten von großem Interesse, da die Kombination von Proteasominhibitoren mit Autophagie-Inhibitoren die Therapie deutlich verbessern, sowie Bortezomib-Resistenzen überwinden könnte. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass diese Behandlungsoptionen, zusätzlich zu den bekannten Autophagie-Inhibitoren, auch konventionelle Medikamente beinhalten die hierbei als Regulatoren der autophagosomalen Abbaumechanismen eine neue Verwendung finden. Wiederum besteht das Risiko von antagonistischen Effekten bei der Kombination von Proteasominhibitoren mit Chemotherapeutika, da diese die Aktivität von Cyclin D1/CDK4 beeinträchtigen oder Autophagie induzieren könnten.