Proteomics und molekularbiologische Analyse der zellfreien Proteinbiosynthese

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe bioanalytischer Methoden und Proteomanalysen eine eingehende Diagnose der Limitationen der zellfreien Proteinbiosynthese durchzuführen. Bei den Untersuchungen wurden ausschliesslich S30 Zellextrakte von Escherichia coli eingesetzt. Langfristiges Ziel soll dabei die Therapie der identifizierten Begrenzungen der in vitro Biosynthese sein, um schliesslich die Produktkonzentrationen und Raum-Zeitausbeuten für die synthetisierten Proteine zu verbessern. Durch quantitative Analysen wurde gezeigt, dass die Energieversorgung der zellfreien Biosynthese durch das Energieregenerierungssystem von Acetatkinase/Acetylphosphat nicht limitierend für die Proteinbiosynthese ist. Mit hochauflösender zweidimensionaler Elektrophorese (2DE) plus Sequenzanalysen konnten Elongationsfaktoren und ribosomale Proteine identifiziert werden, jedoch lagen diese essentiellen Proteine im Verlauf der Proteinbiosynthese zum Teil in unterschiedlichen Isoformen vor. Offensichtlich stehen also Zustandsänderungen der Lysatproteine im Zusammenhang mit der Translationsaktivität eines zellfreien Lysates. So wurde festgestellt, dass sich das Phosphorylierungsmuster mit der translationalen Aktivität des zellfreien Lysates ändert. In inaktiven Lysaten konnten kaum Modifizierungen dieser Art gefunden werden, während in aktiven Lysaten essentielle Proteine phosphoryliert waren. Zeitgleich mit dem Zusammenbruch der zellfreien Synthese im Batch-Verfahren haben die meisten dieser Proteine ihre Modifikation verloren. Allein von EF-Tu war bisher bekannt, dass eine Phosphorylierung an Threonin 382 essentiell ist. Aufgrund weiterer Messungen konnte ausgeschlossen werden, dass die Energie- oder Substratversorgung des zellfreien Systems sowie die Transkription den Zusammenbruch nach 50min Batch-Reaktion herbeiführen. Als die Biosynthese potentiell limitierender Faktor zeigte sich die Änderung des Modifizierungsmusters der Lysatproteine und damit der vorhandenen Aktivität und Funktion.

The aim of this study was a detailed investigation of possible limitations of a cell-free protein biosynthesis by means of bioanalytical methods and proteome analysis. S30 cell extracts obtained from Escherichia coli were used exclusively. Long term goal of this research is the therapy of the identified limitations of the in vitro biosynthesis, to improve product concentrations and overall yields of the newly synthesised proteins. Quantitative analysis showed that the energy supply by an energy regenerating system consisting of acetate kinase/acetyl phosphate is not restricting protein biosynthesis. By means of high-resolution two dimensional electrophoresis (2DE) and sequencing analysis elongation factors and ribosomal proteins were identified, but during time course of biosynthesis their isoform composition changed. Apparently, status changes of lysate proteins are corresponding with translational activities of cell-free lysates. By means of a screening technique for two dimensional western-blots with monoclonal antibodies it was observed that the phosphorylation pattern is changing along with the activity of the cell-free lysate. Inactive lysates were free from phosphorylations, whereas elongation factors Ts and Tu, different ribosomal proteins and chaperones were phosphorylated on at least one site in active lysates. In parallel with the breakdown of a cell-free biosynthesis in a batch-process after 50min, most of these proteins have lost their modifications. Up to now, only EF-Tu was known for a phosphorylation on threonine residue 382, playing an essential role in reactivating the factor for the next elongation cycle. Additional studies excluded energy- or substrate supply, as well as transcription, as a reason for the breakdown of the batch-synthesis after 50min. The only potentially limiting factor for biosynthesis was the change in the phosphorylation pattern of lysate proteins and therefore modified activity and function.