Entwicklung einer DNA-Vakzine gegen das humane Zytomegalievirus

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines DNA-Impfstoffes gegen das humane Zytomegalievirus. Eine humorale Immunantwort sollte gegen die viralen Glykoproteine gB und gH gerichtet sein, eine zelluläre Immunantwort sollte gegen das virale Phosphoprotein pp65 induziert werden. In einem ersten Teil der Arbeit wurde die genetische Variabilität der Glykoproteine gB und gH untersucht. Sowohl in immunsupprimierten als auch in immunkompetenten Patienten konnten nur vier verschieden gB-Genotypen (gB1-4) und zwei verschiedene gH-Genotypen (gH1-2) nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit entwickelte DNA-Vakzine sollte all diese Varianten der Glykoproteine gB und gH enthalten, um so einen effektiven Schutz vor einer Erkrankung mit HCMV zu ermöglichen. Für die DNA-Immunisierung wurden Expressionsvektoren konstruiert, die jeweils einzeln die Glykoproteine gB1, gB1?TM, gB2, gB3, gB4, gH1, gH2, gL sowie das Phosphoprotein pp65 des HCMV enthielten. Mäuse wurden i.m., i.c., oder i.n. mit diesen Vektoren immunisiert und auf die Induktion einer Immunantwort sowie auf die Verteilung von Plasmid-DNA in verschiedenen Organen hin untersucht. Eine humorale Immunantwort gegen das Glykoprotein gB konnte in i.m. immunisierten Mäusen induziert werden. Die Antikörpertiter erreichten Werte von bis zu 640. Durch i.n. Immunisierung konnten nur sehr spät und mit einem sehr geringen Titer gB-spezifische Antikörper induziert werden. Antikörper gegen gH oder gegen pp65 konnten nicht nachgewiesen werden. Auch eine zelluläre Immunantwort gegen das Phosphoprotein pp65 konnte durch DNA-Immunisierung nicht induziert werden. Die Untersuchung von Organen DNA-immunisierter Tiere und deren Nachkommen auf Plasmid-DNA zeigte, daß der Impfvektor sechs Wochen nach Immunisierung noch in allen untersuchten Organen persistiert. Dies war sowohl bei i.m. als auch bei i.c. immunisierten Tieren der Fall. Plasmid-DNA konnte auch in den Nachkommen DNA-immunisierter Mäuse nachgewiesen werden. Exprimiertes Protein (HBsAg) konnte in verschiedenen Organen von Mäusen nachgewiesen werden, die i.m. mit dem Expressionsvektor pCMV-S immunisiert worden waren.

The human cytomegalovirus (HCMV) causes significant and even lifethreatening disease especially in congenitally infected or immunocompromised individuals. A vaccine against HCMV is not available so far although several approaches have been used to develop one. Aim of this dissertation was the development of a DNA-vaccine against the human cytomegalovirus. It was intended to direct a humoral immune response against the viral glycoproteins gB and gH and a cellular immune response against the viral phosphoprotein pp65. In contrast to previous immunisation approaches the genetic variability of the immunodominant proteins was taken into acount. In the first part of the dissertation the genetic variability of HCMV glycoproteins gB and gH was analysed. In immunocompromised as well as in immunocompetent patients only four different gB genotypes (gB1-4) and two different gH genotypes (gH1-2) were detected. Intragenic variability between the different gB or gH genotypes was also observed. Immunocompetent individuals were found to be infected with different HCMV strains simultaneously. This indicates that a primary infection with one HCMV strain only insufficiently protects from reinfection with a different virus strain. For the DNA-immunisation nine expressionvectors were constructed that contained glycoproteins gB1, gB1?TM, gB2, gB3, gB4, gH1, gH2, gL and the phosphoprotein pp65. Mice were intramuscularly, intranasaly or intracutaneously immunised with these plasmids and analysed for either the induction of an immune response or the distribution of plasmid-DNA in different organs A humoral immune response against the glycoprotein gB could be induced in i.m. immunised mice, with maximum antibodytiters of 640. In mice, i.n. immunised gB-specific antibodies were induced very late after immunisation and with very low titers. None of these HCMV-antibody-positive sera of DNA-vaccinated mice was able to neutralise virus. Antibodies against glycoprotein gH or phosphoprotein pp65 could not be detected. Also a cellular immune response against the phosphoprotein pp65 could not be induced by DNA-immunisation. To address safety concerns about DNA-vaccines we analysed the distribution of DNA-vaccines in different tissues of immunised mice and the transfer of the immunisation vector to their offspring. Using highly sensitive nested PCRs we could show a wide distribution and a long persistence of plasmid DNA in different tissues of immunised mice. The immunisation vector could be detected in nearly all tissues six weeks postinjection. Moreover expression of the foreign antigen could be found in all analysed tissues 10 weeks after the last immunisation. Plasmid-DNA was also detected in fetuses and in five week old offspring of immunised mice.