Tumor Counterattack: Apoptose-vermittelte Immunsuppression durch Tumore

Abstract

Tumorzellen wehren sich möglicherweise nicht nur passiv gegen eine Zerstörung durch das Immunsystem. Viele Tumore exprimieren CD95L, mit dessen Hilfe sie Tumor-infiltrierende Lymphozyten aktiv töten und so die anti-Tumor Immunantwort unterdrücken könnten - ein Phänomen, das Tumor Counterattack genannt wird. Um die Auswirkungen der CD95L-Expression von Tumoren auf Tumor-spezifische T-Zellen genauer zu charakterisieren, wurde in dieser Arbeit die Tumor-Counterattack-Situation zunächst in einem Modellsystem in vitro nachgestellt. Dazu wurden einerseits T-Zellen von anti-Kb T-Zell-Rezeptor-transgenen Perforin-knockout (TCRPKO)-Mäusen und andererseits verschiedene Tumorzelllinien eingesetzt, die als Modell-Tumorantigen das MHC-Molekül Kb exprimieren. Dabei bestand eine wechselseitige Zytotoxizität zwischen dem CD95L+ Tumor und den aktivierten anti-Tumor T-Zellen. Die CD95L-Expression der Tumorzellen verhinderte in gemischten Lymphozyten-Tumor-Reaktionen die Generierung von zytotoxischen anti-Tumor T-Zellen. Sie hatte aber keinen Einfluss auf die Lyse des Tumors durch aktivierte T-Zellen. Ein Einfluss von Kostimulation mit B7 auf Tumor Counterattack konnte in vitro nicht nachgewiesen werden. Obwohl in humanen CD95L+ Tumoren vermehrt apoptotische T-Zellen gefunden werden und auch in-vitro-Befunde für die Existenz von Tumor Counterattack sprechen, führt die CD95L-Expression zur Abstoßung oder einem Wachstumsnachteil der Tumore in Mäusen. Zwei wesentliche Faktoren, die die Auswirkung der CD95L-Expression auf Tumoren in vivo beeinflussen konnten und daher für diese kontroverse Situation verantwortlich gemacht wurden, waren das CD95L-Expressionsniveau und der Zeitpunkt der CD95L-Expression. Um den Einfluss des CD95L-Expressionsniveaus auf die Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen zu untersuchen, wurden zunächst Tumorzelllinien generiert, die unterschiedliche Mengen von CD95L konstitutiv exprimieren. In Nacktmäusen wuchsen diese Tumorzelllinien deutlich langsamer als der CD95L- Kontrolltumor. Das CD95L-Expressionsniveau hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit der CD95L+ Tumore. In TCRPKO-Mäusen wuchsen sie gar nicht oder nur verzögert. Um zusätzlich den Einfluss des Zeitpunktes der CD95L-Expression untersuchen zu können, wurde eine CD95-resistente Zelllinie generiert, in der mit Hilfe des tet-Systems eine CD95L-Expression induziert werden konnte. Diese Zelllinie wurde in Nackt-, NOD/SCID- oder TCRPKO-Mäuse injiziert. In allen Mausstämmen wurden etablierte Tumore nach CD95L-Induktion schnell und mit ähnlicher Geschwindigkeit abgestoßen. Eine CD95L-Expression zu einem späteren Zeitpunkt in einem etablierten Tumor führte also genauso zur Abstoßung wie eine konstitutive Expression. Eine geringere CD95L-Induktion verzögerte die Abstoßung der Tumore nur minimal. Bei der Abstoßung von CD95L+ Tumoren in Mäusen handelt es sich folglich nicht um ein Artefakt durch Überexpression. Die Abstoßung hängt außerdem nicht von Ereignissen zu Beginn der Tumorentstehung ab. In zahlreichen Studien wurden Neutrophile für die Abstoßung von CD95L+ Tumoren verantwortlich gemacht. Es wurde daher in vitro untersucht, ob Neutrophile selektiv gegenüber CD95L+ Tumorzellen zytotoxisch sind. In Zytotoxizitäts-Tests konnte keine Lyse von CD95L+ oder CD95L- Maus-Tumorzelllinien durch murine oder humane Neutrophile beobachtet werden. Um zu klären, welchen Zytotoxizitäts-Mechanismus Neutrophile benutzen, um CD95L+ Tumore abzustoßen, wurde das Wachstum von CD95L+ Tumoren in iNOS-/-- und p47phox-/--Mäusen untersucht. In beiden knockout-Mausstämmen wuchsen die CD95L+ Tumore und die Kontrolltumore genauso schnell wie in Wildtyp-Mäusen. Die phagozytäre NADPH-Oxidase (p47phox) und iNOS sind also bei der Abstoßung der CD95L+ Tumore nicht ausschließlich involviert. Insgesamt ist damit die Apoptose-vermittelte Immunsuppression von Tumoren (Tumor Counterattack) ein möglicher und plausibler Immunevasionsmechanismus von Tumoren, die Relevanz für die Situation in vivo ist aber offen. Eine weitere Aufklärung dieser komplexen Zusammenhänge ist für die Tumorimmunologie und die Krebstherapie von großer Bedeutung.

Tumor cells may not only passively resist destruction by the immune system. Many tumors express CD95L and may also actively kill tumor-infiltrating lymphocytes to suppress the anti-tumor immune response - a phenomenon called "tumor counterattack". To characterize the effect of CD95L-expression of tumor cells on tumor-specific T cells, we established a model to mimic the tumor counterattack situation in vitro. In this model T cells from anti-Kb T cell receptor transgenic perforin knockout (TCRPKO) mice and tumor cell lines expressing the MHC molecule Kb as a model tumor antigen were used. The CD95L+ tumor cells and the activated anti-tumor T cells were able to kill each other. CD95L expression of the tumor cells inhibited the generation of cytotoxic anti-tumor T cells in mixed lymphocyte tumor reactions. However, it did not inhibit the lysis of the tumor cells by activated T cells. Costimulation by B7 did not influence the tumor counterattack situation in vitro. Although in human CD95L+ tumors increased apoptosis of T cells can be found and in vitro experiments support the tumor counterattack hypothesis, in mice CD95L+ tumors are rejected or grow more slowly than CD95L- tumors. Two factors that could influence the outcome of CD95L expression on tumors in vivo and thus could account for the controversial situation, were the level and the time-point of CD95L expression. To investigate the influence of the CD95L-expression level on the rejection of CD95L+ tumors in mice, tumor cell lines constitutively expressing different levels of CD95L were generated. The CD95L expression level had no influence on the growth rate of CD95L+ tumors in nude mice. In contrast, growth of CD95L- control tumors was much faster. In TCRPKO mice the CD95L+ cell lines did not form tumors. To investigate the influence of the time-point of CD95L expression, we generated a CD95-resistant cell line in which CD95L can be induced via the tet-system. This cell line was injected into nude, NOD/SCID and TCRPKO mice. In all mouse strains induction of strong CD95L expression in established tumors lead to rapid rejection of the tumors. Induction of lower CD95L expression levels delayed tumor rejection only minimally. Therefore, neither the CD95L expression level nor the time-point of CD95L expression influenced the rejection of CD95L+ tumors substantially. These results demonstrate that rejection of CD95L-expressing tumors in mice is not an overexpression artefact and does not depend on events at the onset of tumor progression. Various studies indicated that CD95L+ tumors are rejected by neutrophils. Hence we investigated whether neutrophils selectively kill CD95L+ tumor cells in vitro. In cytotoxicity assays no lysis of murine tumor cells by murine or human neutrophils could be found. CD95L+ tumor cells were not killed specifically by neutrophils. To clarify which cytotoxicity mechanism neutrophils use that might lead to rejection of CD95L+ tumors, we investigated growth of CD95L+ tumors in iNOS-/- and p47phox-/- mice. In both knockout strains the growth rate of CD95L+ and control tumors was the same as in wildtype mice. Therefore, the phagocytic NADPH oxidase and iNOS are each not essential for the rejection of CD95L+ tumors in mice. Taken together, apoptosis-mediated immunosuppression (tumor counterattack) is a plausible immune escape mechanism of tumors. However, its importance for the in vivo situation remains to be determined. Further investigation of this complex situation is highly relevant for tumor immunology and cancer therapy.