Neue Enzyme für industrielle Anwendungen aus Boden-Genbanken

Abstract

In zahlreichen Industriezweigen werden heutzutage biokatalytische Prozesse erfolgreich angewendet. Das Einsatzgebiet von Enzymen reicht von der Lebensmittelproduktion, dem Waschmittelsektor und der Textilindustrie bis hin zur Verwendung in der modernen Analytik und in der medizinischen Therapie. Die Fähigkeit von Enzymen, an zahlreichen Substanzen in spezifischer Weise Reaktionen wie beispielsweise Oxidationen, Hydrierungen, Hydrolysen, Methylierungen oder Veresterungen durchzuführen, stellt auch ein großes Potential für Stoffumwandlungen in der chemischen und pharmazeutischen Industrie dar. Von besonderer Bedeutung ist hierbei vor allem die meist stark ausgeprägte Chemo-, Regio- und Stereospezifität der enzymkatalysierten Reaktion. Sie ermöglicht die spezifische Synthese von chemisch schwer zugänglichen Verbindungen unter milden Reaktionsbedingungen ohne Bildung unerwünschter Nebenprodukte. Angesichts dieser Vorteile stieg das Interesse an der Nutzung enzymatisch katalysierter Reaktionen vor allem in der organisch-chemischen Synthese in den letzten Jahren stark an und führte zu einem gesteigerten Bedarf an Enzymen, die für den technischen Einsatz geeignet sind.

Strategien zur Bereitstellung geeigneter Biokatalysatoren umfassen die gentechnische Modifizierung bereits vorhandener Enzyme, die Durchsuchung kommerzieller Enzymbibliotheken oder die Durchmusterung mikrobieller Stammsammlungen nach gewünschten Enzymaktivitäten. Als Hauptquelle für neue biotechnologische Produkte und Prozesse wird die beträchtliche physiologische Vielfalt von Mikroorganismen angesehen. Klassische Methoden zur Identifizierung neuer Enzymaktivitäten beruhen auf deren Kultivierung. Da jedoch nur ein geringer Anteil der tatsächlich existierenden Mikroorganismen unter Laborbedingungen kultivierbar ist, bleibt dabei das beträchtliche Potential des unkultivierbaren Anteils der Population unentdeckt. Um einen Verlust an Diversität zu vermeiden, sind daher kultivierungsunabhängige Ansätze erforderlich, die das metabolische Potential eines Standortes in seiner Gesamtheit zugänglich machen.

In dieser Arbeit wurden deshalb Methoden entwickelt, die den Engpass der Kultivierbarkeit umgehen und es stattdessen im Rahmen eines kultivierungsunabhängigen Vorgehens ermöglichen, die gesamte genetische Vielfalt eines Habitats, kodiert durch die Gesamtheit aller enthaltenen mikrobiellen Genome, das Metagenom, für die Entdeckung neuartiger Enzymaktivitäten zu nutzen. Dazu wurde die genomische DNA der Mikroorganismen aus einer Bodenprobe isoliert und aufgereinigt. Durch die Verwendung einer modifizierten Aufschlussmethode der direkten Lyse gefolgt von einer Aufreinigung mittels Gelfiltrations-Säulen gelang die Gewinnung hochmolekularer und reiner und damit für die Klonierung geeigneter genomischer DNA. Nach enzymatischer Fragmentierung wurde die Boden-DNA in den Expressionsvektor pJOE930 kloniert, der zwei induzierbare lac-Promotoren beinhaltet. Auf diese Weise wurden Genbanken konstruiert, die insgesamt 140 000 Klone umfassten. Durch das Screening der Genbanken auf unterschiedlichste Enzymaktivitäten wurden anschließend sowohl deren genetisches Potential und ihre Vielfalt überprüft als auch eine Vielzahl neuartiger Enzyme für mögliche industrielle Anwendungen identifiziert.

Als Grundlage für die Identifizierung neuer dehalogenierender Enzyme wurden Testverfahren untersucht, die auf dem Nachweis einer pH-Absenkung infolge der Freisetzung von Protonen bei hydrolytischen Dehalogenierungsreaktionen beruhen. Des Weiteren wurde auf der Basis eines elektrochemischen Chloridsensors ein parallelisiertes und automatisiertes Screeningsystem für ein sensitives HTP-Screening nach Dehalogenasen entwickelt.

Mit Hilfe der verschiedenen Screeningverfahren wurden insgesamt 70 Enzyme mit unterschiedlicher Aktivität gefunden, darunter 14 lipolytische Enzyme, 13 Phosphatasen, 38 Amylasen, zwei Dioxygenasen und drei Dehalogenasen. Wie die Sequenzanalyse der rekombinanten Klone zeigte, war es mit Hilfe der entwickelten Methoden möglich, neuartige Genprodukte zu identifizieren, deren Sequenzen nur geringe Ähnlichkeit zu bereits bekannten Enzymen aufwiesen, was die Vermutung nahe legt, dass sie aus bisher unbekannten Mikroorganismen stammen. Die Vielzahl und Vielfalt der entdeckten Enzymaktivitäten sowie die Tatsache, dass alle Sequenzen verschieden waren, sind Hinweise auf die genetische Diversität und den geringen Grad an Redundanz der aus Boden-DNA erstellten Genbanken. Wesentliche Punkte für die Effizienz des Verfahrens waren die Verwendung eines Plasmidvektors, der die heterologe Expression inserierter Gene unabhängig von ihrer Orientierung und gen-eigenen Promotoren ermöglichte, sowie die Gewinnung hochreiner klonierbarer DNA. Die direkte Klonierung metagenomischer DNA erwies sich somit als geeignete Strategie zur Nutzbarmachung der metabolischen Vielfalt eines Habitats für biotechnologische Innovationen.

Technological usage of enzymes in processing natural materials has a long tradition. Nowadays, the widespread application of enzymes as key components in detergents, in various processes of food industry, in textile manufacturing as well as in chemical analysis or medication is successfully established. Due to their ability to selectively catalyze reactions like oxidations, hydrogenations, hydrolyses, methylations or esterifications of various substrates, enzymes are also considered as valuable tools for organic synthesis in pharmaceutical or chemical industry. Thereby, their pronounced chemo-, regio- and enantioselectivity is of particular importance, since it enables the selective synthesis of substances which are chemically difficult to access. In addition, enzymatic reactions proceed under mild conditions without the formation of undesirable by-products. Facing these advantages, interest in usage of biocatalysis for industrial chemical synthesis has been awakened and an increasing demand of industry for novel enzymes to improve existing applications or to establish novel processes for the production of innovative products or intermediates has occurred in the past few years.

Strategies for the supply of an appropriate biocatalyst with specific properties enclose the genetic modification of known enzymes and the screening of commercial enzyme libraries or strain collections for designated enzyme activities. The substantial natural biodiversity of microorganisms is considered to be a major resource for biotechnological products and processes. The classical approach of isolating new enzymes is based on cultivation of microorganisms. However, since only a marginal fraction of microorganisms existing in nature can be cultivated by standard techniques, the tremendous variety of the uncultured majority remains undetected. To avoid this inherent loss of diversity, cultivation-independent approaches are needed, thus providing access to the metabolic potential present in a given habitat in its entirety.

To circumvent the limitations of cultivation, methods of an alternative cultivation-independent approach have been developed in this study, thereby enabling the use of the entire genetic diversity of a microbial consortium in a given habitat, encoded by their collective genomes, the so called metagenome, for the detection of unique biocatalysts. Genomic DNA was isolated from compost soil using a modified extraction method based on direct lysis and purified by size exclusion chromatography. The recovered DNA was of high molecular weight with low degree of shearing and of sufficient purity to be suitable for subsequent cloning. Following enzymatic digestion, soil DNA was cloned into the expression vector pJOE930, which contains two inducible lac-promotors. The resulting expression plasmid libraries comprised a total of 140 000 clones. To check their genetic diversity as well as to discover a wide variety of novel biocatalysts suitable for technical application, the constructed libraries were subsequently screened for various enzymatic activities.

To establish a basis for the identification of novel dehalogenating enzymes, assays based on the monitoring of the decrease of pH due to the enzymatic release of protons during a hydrolytic dehalogenation reaction were tested. Furthermore, an automated and parallelized screening system on the basis of electrochemical chloride detection was developed, thus providing an efficient means for the sensitive high throughput screening for dehalogenases.

A total of 70 novel enzymes catalyzing different reactions were identified by activity-based screening, including 14 lipolytic enzymes, 13 phosphatases, 38 amylases, two dioxygenases and three dehalogenases. As indicated by sequence analysis, the application of the newly developed methods enabled the detection of novel gene products, whose sequences revealed only limited similarity to known proteins and which therefore probably originate from hitherto unknown microorganisms. The multitude and variety of enzymatic activities as well as the overall dissimilarity of sequences point to the genetic diversity and low level of redundancy of the constructed libraries. Crucial points for attaining a highly efficient cloning procedure consisted in the usage of an expression vector enabling expression of inserted genes independent of orientation and insert-borne promoters as well as in the availability of high-quality genomic DNA suitable for cloning. Consequently, direct cloning of metagenomic DNA turned out to be a suitable strategy for the utilization of metabolic diversity in a given habitat for biotechnical innovations.