Untersuchung der DNA-Reparaturwege in Streptomyces lividans TK64 anhand von Deletionsmutanten

Abstract

Streptomyceten sind vor allem wegen ihres ausgeprägten Sekundärstoffwechsels bekannt (z.B. Antibiotikaproduktion). Ihr Lebenszyklus ist komplex und beinhaltet ein Sporenstadium. Das lineare Genom ist mit über 8 Mb außergewöhnlich groß. Ebenso ungewöhnlich ist die hohe Frequenz von spontanen Deletionen. Ziel dieser Arbeit war es ein besseres Verständnis für die DNA-Reparatur bzw. Rekombination und chromosomale Stabilität in Streptomyceten zu erhalten. Dazu wurden von S. lividans Mutanten erstellt, bei denen jeweils ein oder mehrere Gene eines bestimmten DNA-Reparaturweges deletiert wurden. Insgesamt wurden siebzehn verschiedene Deletionsmutanten auf ihre chromosomale Stabilität hin untersucht. Des Weiteren wurde die Überlebensfähigkeit dieser Mutanten nach der Mutagenese mit vier verschiedenen Mutagenen untersucht, jeweils im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64. Aus dem DNA-Reparaturweg der Prävention und Reversion von DNA-Schäden wurden die Gene der dUTPase und von AlkB deletiert. Die Basenexzisionsreparatur betreffend wurden die Gene von vier DNA-Glykosylasen und das Gen der Exonuklease III deletiert. Alle diese Deletionsmutanten zeigten keine veränderte chromosomale Stabilität. Nach der Behandlung mit einem methylierenden Mutagen zeigten nur die exoIII Mutanten eine signifikant reduzierte Überlebensrate. Unerwartet war dagegen die signifikant veränderten Überlebensraten der Mutanten (außer der dut Mutante) bei Mutagenen, welche nach der Theorie die Nukleotidexzisionsreparatur und/oder die Rekombinationsreparatur ansprechen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Enzyme auf der einen Seite keine zentrale Stellung in ihrem Reparaturweg einnehmen bzw. durch redundante Systeme kompensierte werden können. Auf der anderen Seite deuten die Ergebnisse auf eine unvermutet starke Vernetzung der Reparaturwege hin. Die Nukleotidexzisionsreparatur spielt in der Zelle eine sehr wichtige Rolle. Nach der Deletion von uvrB war die chromosomale Instabilität signifikant erhöht. Die Überlebensfähigkeit der Zellen war zudem nach der Behandlung mit Mutagenen, welche die Nukleotidexzisionsreparatur erfordern, stark reduziert. Streptomyceten stehen für die ersten Schritte der Rekombinationsreparatur bzw. der homologen Rekombination nur die Gene des RecFOR-Weges zur Verfügung. Es fehlen die Gene recB und recC für den RecBCD-Weg, der in E. coli die zentrale Rolle spielt, oder das alternative System AddAB, wie es in B. subtilis vorkommt. Die Ergebnisse zeigten, dass der RecFOR-Weg essentiell für die chromosomale Stabilität und die Rekombinationsreparatur ist. Schon ein Drittel der gebildeten Sporen der recF bzw. recO Mutanten war genetisch verändert, und die Überlebensfähigkeit der Zellen war bei allen Mutagenese-Versuchen drastisch reduziert. RecD spielt dagegen ohne RecB und RecC keine wichtige Rolle in einem der DNA-Reparaturwege, da sich eine Deletion von recD nicht signifikant auswirkte. Die Enzyme RecG und RuvABC sind in der postsynaptischen Phase der Rekombinationsreparatur von zentraler Bedeutung. Die Ergebnisse deuten auf eine Aufgabenteilung zwischen diesen beiden Systemen hin. Die alleinige Auflösung von DNA-Überkreuzungsstrukturen erfordert RuvABC. Wird dagegen eine Verschiebung der Überkreuzungsstruktur benötigt, oder findet eine Regression der Replikationsgabel statt, so ist RecG beteiligt. Die Helikase RecQ dürfte an mehreren DNA-Reparaturwegen beteiligt sein. Die chromosomale Instabilität war bei den recQ Mutanten leicht erhöht. RecQ kann zusammen mit der 5´-3´-Exonuklease RecJ 3´-DNA-Überhängen für die homologe Rekombination bereitstellen. In Streptomyceten fehlt recJ. Eine alternative 5´-3´-Exonuklease konnte noch nicht zugeordnet werden. Die Untersuchungen zeigten ferner, dass RecN bei der Aufrechterhaltung der chromosomalen Integrität und bei der Rekombinationsreparatur beteiligt ist, wenn auch von untergeordneter Bedeutung. Gene für das nicht-homologe Verbinden von Enden konnte in S. lividans TK64 durch Sequenzvergleiche nachgewiesen werden. Die Deletion von einem zu ku orthologen Gen und der benachbart kodierten Ligase zeigte jedoch keine Auswirkungen. Die Deletion von sbcCD verbesserte die Überlebensfähigkeit gegenüber manchen Mutagenen, erhöhte jedoch die chromosomale Instabilität. Eventuell verschlechtert die 3´-5´-Exonukleaseaktivität von SbcCD im Ausgangsstamm die Bereitstellung von 3´-DNA-Überhängen für die homologe Rekombination. Streptomyceten zeigen in ihrer Genausstattung bezüglich der DNA-Reparatur und der Reaktion auf Mutagene viele Gemeinsamkeiten aber auch einige Unterschiede mit den bisher darin sehr intensiv untersuchten Bakterien wie E. coli, D. radiodurans, B. subtilis oder M. tuberculosis. Insbesondere bleibt noch zu klären, welche Enzyme für die ersten Schritte der Rekombinationsreparatur bzw. der allgemeinen homologen Rekombination verantwortlich sind (Herstellung der 3´-DNA-Überhänge).

Streptomycetes are famous for their extended secondary metabolism (e.g. antibiotica production). Their life cycle is complex and includes sporulation. The genome is linear and with 8 Mb extraordinarily large. The high frequency of spontaneous deletions is also very uncommon. The goal of this work was to improve the understanding of DNA repair or recombination respectively and the chromosomal instability of Streptomycetes. Therefore mutants with one or more genes deleted in a certain DNA repair pathway were created in S. lividans. All in all the chromosomal instability of seventeen deletion mutants was investigated. Furthermore the survival capability of those mutants was determined after treatment with four different mutagens in comparison to that of the original strain S. lividans TK64. From the DNA repair pathway of the prevention and reversion of DNA lesions the genes of the dUTPase and of AlkB were deleted. Concerning the base excision repair the genes for four DNA glycosylases and the gene for exonuclease III were deleted. All these mutants didn´t show any change in chromosomal stability. After treatment with a methylating mutagen only exoIII mutants showed a significantly reduced survival rate. Unanticipated were the significantly changed survival rates of the mutants (except the dut mutants) when treated with mutagens which require the nucleotide excision repair and/or recombinational repair. The results show, that those enzymes on the one hand don´t play a central role in their DNA repair pathway or can be compensated by redundant systems respectively. On the other hand, the results hint at an unsuspected strong interaction of the repair pathways. Nucleotide excision repair plays a very important role in cells. After the deletion of uvrB chromosomal instability was significantly increased. Furthermore the survival capability of the cells was reduced severely after treatment with mutagens which call for the nucleotide excision repair. For the first steps in recombinational repair or homologous recombination, respectively Streptomycetes only have the genes of the RecFOR pathway available. The genes recB and recC of the RecBCD pathway which plays the central role in E. coli are missing in Streptomycetes. Also there is no alternative system AddAB like in B. subtilis. The results proved that the RecFOR pathway is essential for chromosomal stability and recombinational repair. A third of the spores of the recF or recO mutants were genetically changed already and the survival capability of the cells was reduced dramatically throughout all mutagenesis experiments. In contrast RecD is not important in one of the repair pathways without RecB and RecC since a deletion of recD has no significant effect. The enzymes RecG and RuvABC are of upmost significance for the postsynaptical phase of recombinational repair. The results hint at a task sharing between those two systems. For the sole resolution of Holliday junctions RuvABC is required. RecG is involved as soon as migration of the Holliday junction or regression of the replication fork is needed. The helicase RecQ seems to be participating in different DNA repair pathways. The chromosomal instability of the recQ mutants was slightly increased. Together with the 5´-3´-exonuclease RecJ RecQ can provide 3´ single-stranded DNA overhangs for homologous recombination. In Streptomycetes recJ is missing. An alternative 5´-3´-exonuclease could not yet be assigned. Furthermore the investigations demonstrated that RecN is involved in maintenance of chromosomal stability and recombinational repair even if only of minor importance. Genes of the non-homologous end joining could be identified in S. lividans TK64 by sequence comparison. But the deletion of the gene orthologous to ku and the ligase encoded adjoining to it didn´t show any effect. Deletion of sbcCD improved survival capability against some mutagens but also increased chromosomal instability. Maybe the 3´-5´-exonuclease activity of SbcCD in the original strain worsens the creation of 3´ single-stranded DNA overhangs for homologous recombination. Concerning their configuration of genes, regarding the DNA repair pathways, as well as their reactions towards mutagens, Streptomycetes have many similarities but also some differences with the up to now therein very intensely researched bacteria E. coli, D. radiodurans, B. subtilis or M. tuberkulosis. In particular, it remains to be resolved which enzymes are responsible for the first steps of recombinational repair or the general homologous recombination respectively (production of 3´-single-stranded DNA overhangs).