Einzelmolekülmessungen mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie in lebenden Zellen

Abstract

Die Einzelmolekülmikroskopie entwickelte sich in den letzten Jahren zu einer vielversprechenden Methodensammlung zur Messung der Dynamik selbst kleinster Molekülkonzentrationen in vivo. Diese Abhandlung besteht inhaltlich aus zwei Teilen: (i) Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie zur Messung von Membranproteinen - ein Kanalprotein (Connexin46) und einen Rezeptor (TNF-R2) - in der Plasmamembran von lebenden menschlichen Krebszellen. (ii) crosstalkfreie Fluoreszenz Kreuz-Korrelations Spektroskopie (FCCS) zur Bestimmung der Kolokalisation von mit autofluoreszierenden Proteinen markierten Molekülen in lebenden Zellen.

Der erste Teil enthält die Beschreibung der selbstgebauten aufrechten und inversen, prismenlosen TIRF Mikroskope mit Einzelmoleküldetektionsempfindlichkeit. Sie dienten zur Messung der Bewegungsmodi - brownsche Diffusion, anomale Diffusion, eingeschränkte Diffusion und Drift/gerichteter Transport - von Connexin-Halbkanälen und TNF-R2 Rezeptoren in der Plasmamembran von lebenden Zellen. Die Ergebnisse werden mit Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) Messungen an den gleichen Systemen verglichen, um die Stärken und Schwächen der jeweiligen Methode hervorzuheben.

Der zweite Teil beschreibt die Idee - und dessen Realisierung - zu einem crosstalkfreien FCCS Aufbau für die, in der Zellbiologie wegen ihrer Spezifität und Ungiftigkeit für Zellen weit verbreiteten, autofluoreszierenden Proteine Cyan Fluoreszierendes Protein (ECFP) und Gelb Fluoreszierendes Protein (EYFP) durch Diskriminierung der Fluoreszenz im Anregungsspektrum anstatt, wie üblich, im Emissionsspektrum. Dies wird mit gepulster Anregung mit zwei alternierenden Laserfrequenzen und der Detektion jedes einzelnen Fluoreszenzphotons mit einer time correlated single photon counting Karte erreicht, deren Ausgabe zur Berechnung der Auto- und Kreuzkorrelationsfunktionen herangezogen wird. Letztere gibt den Grad der Kolokalisation an. Dieses Kapitel enthält den Aufbau und die Testmessungen in Lysaten und an bichromatisch markierten Connexin46-Hexameren in lebenden Zellen.

Single Molecule Microscopy evolved in recent years to a promising toolbox to measure the dynamics of small amounts of target-molecules in vivo. This disquisition consists of two main parts: (i) total internel reflection fluorescence (TIRF) microscopy used to monitor membrane proteins - a channel protein (connexin46) as well as a receptor (TNF-R2) - in the plasmamembrane of living human cancer cells. (ii) crosstalk-free fluorescence cross correlation spectroscopy (cf-FCCS) to measure the colocalisation of autofluorescent protein labelled molecules in living cells.

In the first part the custom-built setups of an upright and an inverse, prismless TIRF microscope with single molecule detection sensitivity are introduced. They were used to detect different kinds of movement modes - namely brownian motion, anomalous diffusion, coralled diffusion and drift/directed transport - of connexon-hemichannels and TNF-R2 receptors in the plasmamembrane of living cells. These results are compared to fluorescence correlation spectroscopy (FCS) measurements on the same systems to expose strengths and weaknesses of both techniques.

The second part describes the idea - and its realisation - to built a crosstalk-free FCCS setup for the, in cell biology for their specificity and non-toxicity widely used, autofluorescent proteins cyan fluorescent protein (ECFP) and yellow fluorescent protein (EYFP) by discriminating the fluorescence in the excitation spectrum rather than in emission as usual. A pulsed excitation with two alternating laser frequencies and the time correlated single photon counting detection technique enables us to calculate autocorrelation and crosscorrelation functions and therefore the amount of associated diffusing particles. Here the setup is ultimately tested with specimens in lysates and double labelled connexon hemichannels in living cells.